应用A组乙型链球菌特异性菌膜抗原诊断风湿性心脏炎的探讨
作者：余步云 张汉伟 古洁若 张韶冈
单位：余步云(510630 广州，中山医科大学附属第三医院风湿科)；张汉伟(510630 广州，中山医科大学附属第三医院风湿科)；古洁若(510630 广州，中山医科大学附属第三医院风湿科)；张韶冈(510630 广州，中山医科大学附属第三医院风湿科)
关键词：链球菌属；风湿性心脏病；促凝血活性；特异性
中华风湿病学杂志000404 【摘 要】 目的 研究A组乙型溶血性链球菌菌膜抗原在外周血淋巴细胞促凝血活性试验中诊断风湿性心脏炎的特异性。方法 分别用A组乙型溶血性链球菌菌膜抗原和1%植物血凝素(PHA)作为刺激物，分别测定38名健康对照组，30例风湿性心脏病活动组(风心活动组)，20例风湿性心脏病静止组(风心静止组)外周血淋巴细胞促凝血活性(procoagulant activity，PCA)。结果 在特异性菌膜抗原刺激下，风心活动组PCA (18.1±6.3)%显著高于风心静止组(7.2±1.9)%和健康对照组(6.0±3.0)%，而后二者无统计学差异。在受PHA刺激后，风心活动组PCA (9.0±2.5)%，风心静止组(6.2±1.6)%，和健康对照组(7.5±3.2)%三者差异无显著性。结论 以链球菌菌膜为促凝刺激物的PCA试验在判断风湿性心脏炎方面具有特异性，其特异性取决于所用的刺激原为特异性抗原。
, 百拇医药
Gruop a streptococcal membrance used as a specific antigen of diagnosis of rheumatic carditis
YU Buyun,ZHANG Hanwei,GU Jieruo,et al.
Department of Rheumatology,Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University of Medicial Sciences,Guangzhou 510630,China
【Abstract】 Objective To research the specificity of antigen from group A streptococcal cell membrane in procoagulant activity assay for the diagnosis of rheumatic carditis.Method A specific antigen from group A streptococcal cell membrane and 1%PHA were used as stimulants to test the peripheral blood lymphocyte procoagulant activity (PCA) in 30 cases of active rheumatic heart disease,20 cases of inactive rheumatic heart diseases and 38 cases of normal control.Results When streptococcal cell membrane was used as a stimulant,PCA of active rheumatic heart disease group (18.1±6.3)% was much higher than that of inactive rheumatic heart disease group (7.2±1.9)% and normal control group (6.0±3.0)%.It was found that no statistical difference between the latter 2 groups (P>0.05),While 1% PHA was used as stimulant,there was no statistical difference among the three groups (P>0.05),PCA in active,inactive and normal control groups was (9.0±2.5)%,(6.2±1.6)% and (7.5±3.2)% respectively.Conclusion PCA is of specific significance for detecting the activity of rheumatic carditis and its specificity is based on the specific antigen from groups A streptococal membrane.
, 百拇医药
【Key words】 Streptococcus; Rheumatic heart disease; Procoaglantactivity; Specificity
我国流行病学调查资料表明，风湿热和风心病仍是一个严重威胁人类健康的心血管疾病[1]。由于风湿热和风心病的发病机制仍不清楚，迄今国内外尚缺乏特异性诊断方法[2]，历来沿用的Jones标准已不能完全适应占相当大比例不典型风湿热的临床诊断，以至不少病人延误诊断，发展成严重心脏病。因此提高风湿热和风心病风湿活动特异性诊断水平，对于本病的防治和改善预后有重要意义。本研究在既往研究的基础上，进一步对促凝血活性(PCA)试验在诊断风湿热(RF)中应用特异性抗原意义进行研究。
1 资料与方法
1.1 病例选择
风湿性心脏病活动组(简称风心活动组)30例，男11例，女19例，平均年龄(32±12)岁。诊断根据1992年Jones修订标准，且在临床上发现有新的杂音出现或杂音性质的改变或超声心动图明显的瓣膜炎征象，并排除其他引起上述瓣膜改变的病因。风湿性心脏病风湿活动静止组(简称风心静止组)20例，男8例，女12例，平均年龄(34±11)岁，临床有典型心脏杂音，超声心动图显示瓣膜狭窄或关闭不全表现，追踪治疗半年以上，临床和实验室无风湿活动证据的门诊随访和住院患者。正常对照组38例，男25例，女13例，年龄(31±5)岁，来自本院健康体检者，与病例组比较，性别、年龄无统计学差异。
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1.2 检测方法
1.2.1 A组乙型溶血性链球菌菌膜抗原的制备：见文献[3]。
1.2.2 PCA的测定：3.8%枸橼酸钠抗凝血6 ml取自患者及健康对照组，用Ca2+、Mg2+、Hank′s液等量稀释后，淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，Hank′s液洗涤2次，用含10%小牛血清1640培养液调成1×106个/ml浓度，等量分成三管，其中第一管加等量培养液，第二管加等量菌膜抗原，第三管加等量植物血凝素(PHA)，37 ℃细胞培养箱培养20 h，取出后用Hank′s液洗2次，各取0.1 ml置37 ℃水浴箱中，加入0.1 ml正常人血浆，摇匀孵育1 min后加入1/40 mol CaCl2 0.1 ml，同时记录血浆凝固时间，按下式计算PCA缩短时间百分率。PCA(%)＝[(不加抗原管血浆凝固时间-加入抗原管血浆凝固时间)/不加抗原管血浆凝固时间]×100%。
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2 结 果
以特异性菌膜抗原为刺激物时，风心活动组PCA值明显增高，与风心静止组和健康人比较，差异有显著性，而风心静止组和健康人比较，差异无显著性，见表1。
表1 各组PCA值比较(
±s) 组别
例数
PCA(%)
P值
健康对照组
38
6.0±4.6
风心活动组
, 百拇医药
30
18.1±6.3
<0.05
风心静止组
15
7.2±1.9
>0.05
在特异性菌膜抗原刺激下，风心活动组PCA显著高于风心静止组和健康对照组(P<0.05)，而在受PHA刺激后，风心活动组、风心静止组和健康对照组三者差异无显著性(P>0.05)，说明菌膜抗原具有特异性，见表2。
10例活动期风心病经治疗病情缓解后PCA值显著下降，治疗前PCA值为17.8%，治疗后PCA值为8.6%，P<0.05，治疗前后差异有显著性。表2 不同刺激后各组PCA值(%)比较(±s) 项目
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风心活动组
风心静止组
正常对照组
特异性菌膜抗原
18.1±5.8
7.2±1.9
6.0±3.0
植物血凝素
9.0±2.5
6.2±1.6
7.5±3.1
3 讨 论
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风湿热(RF)的特征性病理变化是风湿小体的形成，风湿小体多发生在心肌间质的血管旁，其中央有胶原纤维碎裂、变性和坏死，外周有风湿细胞、巨噬细胞、淋巴细胞或浆细胞等浸润。近年研究认为纤维素样变物质是血浆蛋白在局部沉积和变性所致，这往往是迟发型免疫反应的一种表现。而风湿小体中的炎症细胞浸润是细胞免疫反应的一种病理改变，因为通过免疫组织化学研究发现其中的淋巴细胞大部分是T辅助淋巴细胞。据此可认为RF的病理过程主要是细胞免疫反应和凝血系统被激活所致[4]。
促凝血活性试验在80年代以来被认为是研究细胞免疫反应的一种较为可靠的方法。其原理是致敏淋巴细胞，再次接触相同抗原时，可产生淋巴因子，激发外源性的凝血活动，导致某些靶细胞(包括巨噬细胞、单核细胞和心肌细胞等)的促凝血活性增高[5]。80年代以来，此试验曾应用于多种疾病如肾小球肾炎、甲状腺功能亢进、脑脊髓炎等的发病机制和监测疗效的研究[6]，但尚未见有应用于疾病的特异性诊断的报道。本课题组根据风湿热的病理特点和PCA试验的原理，在国内外首先设计了应用链球菌膜为刺激原的PCA试验，以探讨其对风湿热和风湿性心脏炎的诊断意义。此研究已在临床上开展，测定了600例以上患者，研究结果证明该试验对风湿性心脏炎具有较高的阳性率，而对其他疾病如上呼吸道链球菌感染、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎，其他心血管病如病毒性心肌炎、冠心病等则阳性率甚低，以Jones标准为金指标，其特异性为88.3%，敏感性为83.0%，远优于其他传统的实验室检查如血沉、C反应蛋白和抗链“O”[7]。
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PCA的特异性是否决定于使用的抗原，文献尚未有这方面比较的报道。关于诱导PCA抗原的研究，以往一些报道认为多种非特异性抗原如植物血凝素、细菌脂多糖、结核菌素等可作为刺激原，诱导PCA的产生。本研究通过比较非特异抗原植物血凝素与特异抗原A组β型溶血性链球菌膜测定风湿性心脏炎的PCA结果，显示植物血凝素只能发挥较轻微的刺激作用，在此抗原的作用下，风湿活动组的PCA仅是轻度增高，与静止组和健康组比较，差异无显著性；而经链球菌膜刺激后，风湿活动组显著高于静止组和健康组。证明PCA增高是归因于特异性刺激原的应用。抗原的高度特异性是PCA试验，可作为特异性试验诊断RF的成功关键。
本文还通过10例患者抗风湿治疗前后的PCA值的对比，发现随着RF的免疫性炎症缓解或活动性下降时，PCA值亦随之下降，进一步说明此特异性试验还可用于监测病情，指导临床治疗。
基金项目：卫生部临床学科重点基金资助项目 [27(070)]
, 百拇医药
参 考 文 献
1.饶栩栩，黄震东，岑润超.我国风湿性心脏病的流行现状.中华心血管病杂志，1998，26：98-100.
2.Gibofsky A,Kerwar S,Zubriskie JB,et al.Rheumatic fever,the relationship between host,microbe and genetics.Rheum Dis Clin North Am,1998,24:237.
3.周惠琼，余步云，赵长林，等.风湿热时链球菌免疫指标的选择.风湿病学杂志，1996，1：174.
4.Kemeny E,Grieve T,Marcus R,et al.Identification of mononuclear cells and T cell subsets in rheumatic valvulitis.Clin Immunol Immunophathol,1989,52:225.
, http://www.100md.com
5.周惠琼，余步云，张书刚，等.心肌细胞促凝血活性在风湿性心脏炎发病中的意义.中华内科杂志，1997，36：256.
6.Cole EH,Schulman J,Urowit M,et al.Monocyte procoagulant in Glomerulonephritis associated with systemic lupus erythematosus.J Clin Invest,1985,75:861.
7.余步云，张帆.应用促凝血活性试验诊断链球菌性心脏病.中山医科大学学报，1994，15：128-132.
(收稿日期：1999-11-08), http://www.100md.com
单位：余步云(510630 广州，中山医科大学附属第三医院风湿科)；张汉伟(510630 广州，中山医科大学附属第三医院风湿科)；古洁若(510630 广州，中山医科大学附属第三医院风湿科)；张韶冈(510630 广州，中山医科大学附属第三医院风湿科)
关键词：链球菌属；风湿性心脏病；促凝血活性；特异性
中华风湿病学杂志000404 【摘 要】 目的 研究A组乙型溶血性链球菌菌膜抗原在外周血淋巴细胞促凝血活性试验中诊断风湿性心脏炎的特异性。方法 分别用A组乙型溶血性链球菌菌膜抗原和1%植物血凝素(PHA)作为刺激物，分别测定38名健康对照组，30例风湿性心脏病活动组(风心活动组)，20例风湿性心脏病静止组(风心静止组)外周血淋巴细胞促凝血活性(procoagulant activity，PCA)。结果 在特异性菌膜抗原刺激下，风心活动组PCA (18.1±6.3)%显著高于风心静止组(7.2±1.9)%和健康对照组(6.0±3.0)%，而后二者无统计学差异。在受PHA刺激后，风心活动组PCA (9.0±2.5)%，风心静止组(6.2±1.6)%，和健康对照组(7.5±3.2)%三者差异无显著性。结论 以链球菌菌膜为促凝刺激物的PCA试验在判断风湿性心脏炎方面具有特异性，其特异性取决于所用的刺激原为特异性抗原。
, 百拇医药
Gruop a streptococcal membrance used as a specific antigen of diagnosis of rheumatic carditis
YU Buyun,ZHANG Hanwei,GU Jieruo,et al.
Department of Rheumatology,Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University of Medicial Sciences,Guangzhou 510630,China
【Abstract】 Objective To research the specificity of antigen from group A streptococcal cell membrane in procoagulant activity assay for the diagnosis of rheumatic carditis.Method A specific antigen from group A streptococcal cell membrane and 1%PHA were used as stimulants to test the peripheral blood lymphocyte procoagulant activity (PCA) in 30 cases of active rheumatic heart disease,20 cases of inactive rheumatic heart diseases and 38 cases of normal control.Results When streptococcal cell membrane was used as a stimulant,PCA of active rheumatic heart disease group (18.1±6.3)% was much higher than that of inactive rheumatic heart disease group (7.2±1.9)% and normal control group (6.0±3.0)%.It was found that no statistical difference between the latter 2 groups (P>0.05),While 1% PHA was used as stimulant,there was no statistical difference among the three groups (P>0.05),PCA in active,inactive and normal control groups was (9.0±2.5)%,(6.2±1.6)% and (7.5±3.2)% respectively.Conclusion PCA is of specific significance for detecting the activity of rheumatic carditis and its specificity is based on the specific antigen from groups A streptococal membrane.
, 百拇医药
【Key words】 Streptococcus; Rheumatic heart disease; Procoaglantactivity; Specificity
我国流行病学调查资料表明，风湿热和风心病仍是一个严重威胁人类健康的心血管疾病[1]。由于风湿热和风心病的发病机制仍不清楚，迄今国内外尚缺乏特异性诊断方法[2]，历来沿用的Jones标准已不能完全适应占相当大比例不典型风湿热的临床诊断，以至不少病人延误诊断，发展成严重心脏病。因此提高风湿热和风心病风湿活动特异性诊断水平，对于本病的防治和改善预后有重要意义。本研究在既往研究的基础上，进一步对促凝血活性(PCA)试验在诊断风湿热(RF)中应用特异性抗原意义进行研究。
1 资料与方法
1.1 病例选择
风湿性心脏病活动组(简称风心活动组)30例，男11例，女19例，平均年龄(32±12)岁。诊断根据1992年Jones修订标准，且在临床上发现有新的杂音出现或杂音性质的改变或超声心动图明显的瓣膜炎征象，并排除其他引起上述瓣膜改变的病因。风湿性心脏病风湿活动静止组(简称风心静止组)20例，男8例，女12例，平均年龄(34±11)岁，临床有典型心脏杂音，超声心动图显示瓣膜狭窄或关闭不全表现，追踪治疗半年以上，临床和实验室无风湿活动证据的门诊随访和住院患者。正常对照组38例，男25例，女13例，年龄(31±5)岁，来自本院健康体检者，与病例组比较，性别、年龄无统计学差异。
, 百拇医药
1.2 检测方法
1.2.1 A组乙型溶血性链球菌菌膜抗原的制备：见文献[3]。
1.2.2 PCA的测定：3.8%枸橼酸钠抗凝血6 ml取自患者及健康对照组，用Ca2+、Mg2+、Hank′s液等量稀释后，淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，Hank′s液洗涤2次，用含10%小牛血清1640培养液调成1×106个/ml浓度，等量分成三管，其中第一管加等量培养液，第二管加等量菌膜抗原，第三管加等量植物血凝素(PHA)，37 ℃细胞培养箱培养20 h，取出后用Hank′s液洗2次，各取0.1 ml置37 ℃水浴箱中，加入0.1 ml正常人血浆，摇匀孵育1 min后加入1/40 mol CaCl2 0.1 ml，同时记录血浆凝固时间，按下式计算PCA缩短时间百分率。PCA(%)＝[(不加抗原管血浆凝固时间-加入抗原管血浆凝固时间)/不加抗原管血浆凝固时间]×100%。
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2 结 果
以特异性菌膜抗原为刺激物时，风心活动组PCA值明显增高，与风心静止组和健康人比较，差异有显著性，而风心静止组和健康人比较，差异无显著性，见表1。
表1 各组PCA值比较(
±s) 组别例数
PCA(%)
P值
健康对照组
38
6.0±4.6
风心活动组
, 百拇医药
30
18.1±6.3
<0.05
风心静止组
15
7.2±1.9
>0.05
在特异性菌膜抗原刺激下，风心活动组PCA显著高于风心静止组和健康对照组(P<0.05)，而在受PHA刺激后，风心活动组、风心静止组和健康对照组三者差异无显著性(P>0.05)，说明菌膜抗原具有特异性，见表2。
10例活动期风心病经治疗病情缓解后PCA值显著下降，治疗前PCA值为17.8%，治疗后PCA值为8.6%，P<0.05，治疗前后差异有显著性。表2 不同刺激后各组PCA值(%)比较(
±s) 项目, http://www.100md.com
风心活动组
风心静止组
正常对照组
特异性菌膜抗原
18.1±5.8
7.2±1.9
6.0±3.0
植物血凝素
9.0±2.5
6.2±1.6
7.5±3.1
3 讨 论
, http://www.100md.com
风湿热(RF)的特征性病理变化是风湿小体的形成，风湿小体多发生在心肌间质的血管旁，其中央有胶原纤维碎裂、变性和坏死，外周有风湿细胞、巨噬细胞、淋巴细胞或浆细胞等浸润。近年研究认为纤维素样变物质是血浆蛋白在局部沉积和变性所致，这往往是迟发型免疫反应的一种表现。而风湿小体中的炎症细胞浸润是细胞免疫反应的一种病理改变，因为通过免疫组织化学研究发现其中的淋巴细胞大部分是T辅助淋巴细胞。据此可认为RF的病理过程主要是细胞免疫反应和凝血系统被激活所致[4]。
促凝血活性试验在80年代以来被认为是研究细胞免疫反应的一种较为可靠的方法。其原理是致敏淋巴细胞，再次接触相同抗原时，可产生淋巴因子，激发外源性的凝血活动，导致某些靶细胞(包括巨噬细胞、单核细胞和心肌细胞等)的促凝血活性增高[5]。80年代以来，此试验曾应用于多种疾病如肾小球肾炎、甲状腺功能亢进、脑脊髓炎等的发病机制和监测疗效的研究[6]，但尚未见有应用于疾病的特异性诊断的报道。本课题组根据风湿热的病理特点和PCA试验的原理，在国内外首先设计了应用链球菌膜为刺激原的PCA试验，以探讨其对风湿热和风湿性心脏炎的诊断意义。此研究已在临床上开展，测定了600例以上患者，研究结果证明该试验对风湿性心脏炎具有较高的阳性率，而对其他疾病如上呼吸道链球菌感染、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎，其他心血管病如病毒性心肌炎、冠心病等则阳性率甚低，以Jones标准为金指标，其特异性为88.3%，敏感性为83.0%，远优于其他传统的实验室检查如血沉、C反应蛋白和抗链“O”[7]。
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PCA的特异性是否决定于使用的抗原，文献尚未有这方面比较的报道。关于诱导PCA抗原的研究，以往一些报道认为多种非特异性抗原如植物血凝素、细菌脂多糖、结核菌素等可作为刺激原，诱导PCA的产生。本研究通过比较非特异抗原植物血凝素与特异抗原A组β型溶血性链球菌膜测定风湿性心脏炎的PCA结果，显示植物血凝素只能发挥较轻微的刺激作用，在此抗原的作用下，风湿活动组的PCA仅是轻度增高，与静止组和健康组比较，差异无显著性；而经链球菌膜刺激后，风湿活动组显著高于静止组和健康组。证明PCA增高是归因于特异性刺激原的应用。抗原的高度特异性是PCA试验，可作为特异性试验诊断RF的成功关键。
本文还通过10例患者抗风湿治疗前后的PCA值的对比，发现随着RF的免疫性炎症缓解或活动性下降时，PCA值亦随之下降，进一步说明此特异性试验还可用于监测病情，指导临床治疗。
基金项目：卫生部临床学科重点基金资助项目 [27(070)]
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参 考 文 献
1.饶栩栩，黄震东，岑润超.我国风湿性心脏病的流行现状.中华心血管病杂志，1998，26：98-100.
2.Gibofsky A,Kerwar S,Zubriskie JB,et al.Rheumatic fever,the relationship between host,microbe and genetics.Rheum Dis Clin North Am,1998,24:237.
3.周惠琼，余步云，赵长林，等.风湿热时链球菌免疫指标的选择.风湿病学杂志，1996，1：174.
4.Kemeny E,Grieve T,Marcus R,et al.Identification of mononuclear cells and T cell subsets in rheumatic valvulitis.Clin Immunol Immunophathol,1989,52:225.
, http://www.100md.com
5.周惠琼，余步云，张书刚，等.心肌细胞促凝血活性在风湿性心脏炎发病中的意义.中华内科杂志，1997，36：256.
6.Cole EH,Schulman J,Urowit M,et al.Monocyte procoagulant in Glomerulonephritis associated with systemic lupus erythematosus.J Clin Invest,1985,75:861.
7.余步云，张帆.应用促凝血活性试验诊断链球菌性心脏病.中山医科大学学报，1994，15：128-132.
(收稿日期：1999-11-08), http://www.100md.com