磁场抑制动脉平滑肌细胞增殖作用的研究
作者：吕安林 高歌 贾国良 郭文怡 王海昌 王小燕 杨省莉
单位：710032 陕西省西安市，中国人民解放军第四军医大学西京医院 心脏 内科
关键词：磁场；动脉平滑肌细胞；抑制作用
中国循环杂志000427 摘要 目的：探讨不同场强、不同作用时间的低频电磁场对兔主动脉平滑肌细胞增殖的调控作用。
方法：体外培养的新西兰白兔主动脉平滑肌细胞3～7代与含5%小牛血清的RPMI-1640培养液的混悬液100 μl加入96孔板中培养，按照实验分组，每日磁场作用1次，共2日。72 h后用四唑盐比色法和氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入法检测动脉平滑肌细胞的增殖数量。
结果：20 mT、40 mT和60 mT各磁场组动脉平滑肌细胞的增殖数量显著低于对照组(P<0.05)，其中30 min、40 mT磁场组动脉平滑肌细胞增殖数量的降低最显著(P<0.001)。
, 百拇医药
结论：磁场对动脉平滑肌细胞增殖有显著的抑制作用，这种抑制效应具有强度敏感性和时间依赖性。
中图分类号：R541.4 文献标识码：A
文章编号：1000—3614(2000)04—0242—02
Inhibiting Effect of Magnetic Fields on the Proliferation of Aortic Smooth Muscle Cells in Rabbits
Lu Anlin Gao Ge Jia Guoliang et al.
(Department of Cardiology,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi'an(710032),Shanaxi)
, http://www.100md.com
Abstract Objective:To investigate the inhibiting effect of low-frequency electric magnetic field(LFEMF) in different intensity and time on the proliferation of arterial smooth muscle cells(ASMCs).
Methods:New Zealand rabbit ASMCs were cultured in vitro to 3—7 passage.100 μl mixture of ASMCs and RPMI-1640 including 5 percent calf plasma was put in every cavity of 96-hole plate to culture for test.According to the experimental groups,ASMCs were affected by LFEMF for one time per day,altogether two days.The numbers of ASMCs proliferation were monitored by MTT method and 3H-TdR incorporation.
, http://www.100md.com
Results:ASMCs proliferation mumbers of LFEMF groups were significantly lower than that of control group (p<0.05),and ASMCs proliferation numbers of 40 mT LFEMF for 30 minute group was the lowest(p<0.001).
Conclusion:LFEMF could significantly inhibit the proliferation of ASMCs,and the inhibitory effect on ASMCs proliferation had the field intensity sensibility and time dependent.
Key words Magnetic fields;Arterial smooth muscle cells;Inhibiting effect
, 百拇医药
经皮冠状动脉(冠脉)腔内成形术(PTCA)及支架后冠脉再狭窄的主要原因是冠脉血管重构和内膜增生，血管重构是冠脉的修复效应造成的，而内膜增生是动脉平滑肌细胞(ASMCs)的迁移、增殖和基质改建形成的[1]。目前有关防治冠脉新生内膜增生研究的文献较多，但所提出防治措施的疗效均不满意，冠脉再狭窄率仍高达10%～20%[1～3]。为了提高PTCA支架术的疗效，我们于1999年6月至8月研究了低频电磁场对兔ASMCs增殖的影响，以探讨磁场对冠脉再狭窄的防治作用。
1 材料与方法
材料与设备：P1K2型低频电磁治疗仪(苏州市无线电元件五厂)，频率50 Hz，脉宽20 μs；MODEL2300型CO2培养箱(Sheldon);LS-6500型液体闪烁计数器(BECKMAN)；DG3022A型酶联免疫检测仪(华东电子管厂)；新西兰白兔(本校动物中心)；RPMI-1640培养液和细胞培养板(华美公司)；小牛血清(杭州生物制品研究所)。
, http://www.100md.com
ASMCs的体外培养与鉴定：按照Ross贴片法培养ASMCs，用相差显微镜、透射电镜和α-肌动蛋白抗体染色法鉴定ASMCs，取其3～7代作为实验用细胞。
实验设计：将含5%小牛血清的RPMI-1640培养液与3～7代ASMCs的混悬液(细胞密度为1×104/ml)100 μl加入96孔板的48个孔中，对照组无磁场作用状态下在CO2孵箱中静止培养72 h；实验组静止培养24 h后置于下列低频电磁场(N极和S极对置，培养板位于两极中间)中继续培养48 h。根据不同场强实验分20 mT磁场，40 mT磁场，60 mT磁场，每个磁场作用时间均分别为10 min/d、20 min/d、30 min/d。
ASMCs增殖数量的检测：四唑盐比色法(MTT)和氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入实验检测ASMCs的增殖数量。
, 百拇医药 统计学处理：数据用均数±标准差表示，数据处理采用显著性t检验法，P<0.05有显著性差异。
2 结果
磁场对ASMCs增殖的影响：全部实验均重复2次，2次实验数据的平均值为各实验组ASMCs增殖的光密度值(A值)和每分计数值的统计数据(附表)。由附表知，各磁场ASMCs增殖均受到不同程度的抑制并随时间延长呈逐渐增强趋势。A值对照组与实验组20 mT磁场作用时间10 min/d，60 mT磁场作用时间10 min/d间无显著差异，但与实验组的20 mT磁场作用时间20 min/d、30 min/d，40 mT磁场作用时间10 min/d、20 min/d，60 mT磁场作用时间20 min/d、30 min/d有极显著差异(P<0.01)，其中对照组与实验组40 mT磁场作用时间30 min/d比较有高度差异(P<0.001)，每分计数值对照组与实验组20 mT磁场作用时间10 min/d有极显著差异(P<0.01)，与其它各磁场作用时间比较有高度差异(P<0.001)。
, 百拇医药
附表 两组动脉平滑肌细胞增殖的光密度值和每分计数值(
±s) 组别
光密度值
每分计数值
0 min/d
10 min/d
20 min/d
30 min/d
0 min/d
10 min/d
20 min/d
, 百拇医药 30 min/d
对照组
0.5160±0.0115
—
—
—
2747±1200
—
—
—
实验组
20mT
—
, http://www.100md.com
0.4904±0.0093
0.4113±0.0133*
0.3869±0.0114*
—
1861±942*
1732±722**
1386±530**
40mT
—
0.4140±0.0094*
, http://www.100md.com
0.3671±0.0067*
0.2898±0.0107**
—
1648±731**
1375±614**
1353±633**
60mT
—
0.4548±0.0052
0.3777±0.0100*
, 百拇医药
0.3933±0.0128*
—
1730±606**
1454±568**
1517±415**
注：与对照组0 min/d比较*P<0.01 **P<0.001。—：未测3 讨论
近年来，有关磁场促进创伤组织愈合的研究文献较多[4]，但磁场调控ASMCs增殖的研究却未见报道。有研究认为磁场作用时间小于10 min对表皮细胞的增殖起促进作用，大于10 min呈现抑制作用[5]。本实验仅发现磁场对ASMCs增殖的抑制效应，可能与磁场作用时间大于10 min有关。在磁场的作用下，实验组ASMCs的增殖均受到不同程度的抑制，以40 mT磁场最显著，20 mT磁场相对较弱。由于电磁体的磁场强度随着距离的增大而减弱，而且在原始数据的统计过程中也发现越靠近磁场的培养孔，ASMCs增殖的A值和每分计数值就越小，所以磁场对ASMCs增殖的抑制作用还与ASMCs与磁场的空间距离有关，表现为空间距离性或场强敏感性。磁场对ASMCs增殖的调控作用还具有时间依赖性，即随着磁场作用时间的延长，ASMCs的增殖作用呈逐渐递减的趋势。Nossol等[6]在研究磁场对细胞色素C氧化酶活性的影响时也发现了同样的现象。
, 百拇医药
磁场抑制ASMCs增殖的作用机制可能为：①磁场对细胞新陈代谢的影响：培养液中的荷电离子，如钾、钠、氯、钙、镁、磷等离子，在磁场的作用下其荷电能力发生改变，影响了这些离子的移动速度和排列形式，使细胞代谢所需酶的活性或功能受到干扰，细胞代谢水平降低，细胞的增殖能力降低[5，6]；②磁场对脱氧核糖核酸(DNA)合成的影响：磁场的能量直接作用于DNA合成的信使转录系统，降低了DNA的合成速度，使ASMCs的增殖受到抑制[7]。
有文献报道适当强度的磁场对心脏的传导和收缩功能无显著影响[8～10]。我们的动物实验已证实，磁化支架能显著降低PTCA支架后冠脉再狭窄率，但有待进一步的临床观察。
作者简介：吕安林(1962—) 男 副教授 博士后 主要从事冠心病介入治疗研究
参考文献
, 百拇医药
1，Farb A,Sangiorgi G,Carter AJ,et al.Pathology of acute and chronic coronary stenting in humans.Circulation,1999,99:44—52.
2，Mgosaki N,Tsurumi Y,Hosoda S.Current approaches to restenosis after coronary interventions.Nippon Rinsho,1998,56:242—248.
3，Leon MB,Popma JJ,Mintz GS,et al.An overview of US coronary stent trials.Semi Interv Cardiol,1998,1:247—254.
4，Darendeliler MA,Darendeliler A,Sinclair PM.Effects of static magnetic and pulsed electromagnetic fields on bone healing.Lnt J Adult Orthognath Surg,1997,12:43—53.
, 百拇医药
5，陈树德，张红锋，陈家森，等.低频电磁场对细胞生物学效应的研究.中华物理医学杂志，1998，20：78—80.
6，Nossol B,Buse G,Silny J.Influence of weak static 50 Hz magnetic fields on the redox activity of cytochrome-C.Bioel Ctromagnetics,1993,14:361—372.
7，Lai H,Singh NP.Acute exposure to a 60 Hz magnetic field increases DNA strand breaks in rat brain cells.Bioelectromagnetics,1997,18:156—165.
8，Grassi-Schultheiss PP,Heller F,Dobson J.Analysis of magentic material in the human heart,spleen and liver.Biometals,1997,10:351—355.
, http://www.100md.com
9，Mouchawar GA,Bourland TD,Nyenhuis TA.Closed-chest cardiac stimulation with a pulsed magnetic field.Med Biol Eng Comput,1992,30:162—168.
10，Kazakova RT,Badakva AM.Effect of isolated and combined effect of a constant magentic field and antiorthostatic hypokinesia on central hemodynamics in rats.Kosm Biol Avikosm Med,1991,25:48—49.
收稿：1999-12-16
修稿：2000-05-26, http://www.100md.com
单位：710032 陕西省西安市，中国人民解放军第四军医大学西京医院 心脏 内科
关键词：磁场；动脉平滑肌细胞；抑制作用
中国循环杂志000427 摘要 目的：探讨不同场强、不同作用时间的低频电磁场对兔主动脉平滑肌细胞增殖的调控作用。
方法：体外培养的新西兰白兔主动脉平滑肌细胞3～7代与含5%小牛血清的RPMI-1640培养液的混悬液100 μl加入96孔板中培养，按照实验分组，每日磁场作用1次，共2日。72 h后用四唑盐比色法和氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入法检测动脉平滑肌细胞的增殖数量。
结果：20 mT、40 mT和60 mT各磁场组动脉平滑肌细胞的增殖数量显著低于对照组(P<0.05)，其中30 min、40 mT磁场组动脉平滑肌细胞增殖数量的降低最显著(P<0.001)。
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结论：磁场对动脉平滑肌细胞增殖有显著的抑制作用，这种抑制效应具有强度敏感性和时间依赖性。
中图分类号：R541.4 文献标识码：A
文章编号：1000—3614(2000)04—0242—02
Inhibiting Effect of Magnetic Fields on the Proliferation of Aortic Smooth Muscle Cells in Rabbits
Lu Anlin Gao Ge Jia Guoliang et al.
(Department of Cardiology,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi'an(710032),Shanaxi)
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Abstract Objective:To investigate the inhibiting effect of low-frequency electric magnetic field(LFEMF) in different intensity and time on the proliferation of arterial smooth muscle cells(ASMCs).
Methods:New Zealand rabbit ASMCs were cultured in vitro to 3—7 passage.100 μl mixture of ASMCs and RPMI-1640 including 5 percent calf plasma was put in every cavity of 96-hole plate to culture for test.According to the experimental groups,ASMCs were affected by LFEMF for one time per day,altogether two days.The numbers of ASMCs proliferation were monitored by MTT method and 3H-TdR incorporation.
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Results:ASMCs proliferation mumbers of LFEMF groups were significantly lower than that of control group (p<0.05),and ASMCs proliferation numbers of 40 mT LFEMF for 30 minute group was the lowest(p<0.001).
Conclusion:LFEMF could significantly inhibit the proliferation of ASMCs,and the inhibitory effect on ASMCs proliferation had the field intensity sensibility and time dependent.
Key words Magnetic fields;Arterial smooth muscle cells;Inhibiting effect
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经皮冠状动脉(冠脉)腔内成形术(PTCA)及支架后冠脉再狭窄的主要原因是冠脉血管重构和内膜增生，血管重构是冠脉的修复效应造成的，而内膜增生是动脉平滑肌细胞(ASMCs)的迁移、增殖和基质改建形成的[1]。目前有关防治冠脉新生内膜增生研究的文献较多，但所提出防治措施的疗效均不满意，冠脉再狭窄率仍高达10%～20%[1～3]。为了提高PTCA支架术的疗效，我们于1999年6月至8月研究了低频电磁场对兔ASMCs增殖的影响，以探讨磁场对冠脉再狭窄的防治作用。
1 材料与方法
材料与设备：P1K2型低频电磁治疗仪(苏州市无线电元件五厂)，频率50 Hz，脉宽20 μs；MODEL2300型CO2培养箱(Sheldon);LS-6500型液体闪烁计数器(BECKMAN)；DG3022A型酶联免疫检测仪(华东电子管厂)；新西兰白兔(本校动物中心)；RPMI-1640培养液和细胞培养板(华美公司)；小牛血清(杭州生物制品研究所)。
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ASMCs的体外培养与鉴定：按照Ross贴片法培养ASMCs，用相差显微镜、透射电镜和α-肌动蛋白抗体染色法鉴定ASMCs，取其3～7代作为实验用细胞。
实验设计：将含5%小牛血清的RPMI-1640培养液与3～7代ASMCs的混悬液(细胞密度为1×104/ml)100 μl加入96孔板的48个孔中，对照组无磁场作用状态下在CO2孵箱中静止培养72 h；实验组静止培养24 h后置于下列低频电磁场(N极和S极对置，培养板位于两极中间)中继续培养48 h。根据不同场强实验分20 mT磁场，40 mT磁场，60 mT磁场，每个磁场作用时间均分别为10 min/d、20 min/d、30 min/d。
ASMCs增殖数量的检测：四唑盐比色法(MTT)和氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入实验检测ASMCs的增殖数量。
, 百拇医药 统计学处理：数据用均数±标准差表示，数据处理采用显著性t检验法，P<0.05有显著性差异。
2 结果
磁场对ASMCs增殖的影响：全部实验均重复2次，2次实验数据的平均值为各实验组ASMCs增殖的光密度值(A值)和每分计数值的统计数据(附表)。由附表知，各磁场ASMCs增殖均受到不同程度的抑制并随时间延长呈逐渐增强趋势。A值对照组与实验组20 mT磁场作用时间10 min/d，60 mT磁场作用时间10 min/d间无显著差异，但与实验组的20 mT磁场作用时间20 min/d、30 min/d，40 mT磁场作用时间10 min/d、20 min/d，60 mT磁场作用时间20 min/d、30 min/d有极显著差异(P<0.01)，其中对照组与实验组40 mT磁场作用时间30 min/d比较有高度差异(P<0.001)，每分计数值对照组与实验组20 mT磁场作用时间10 min/d有极显著差异(P<0.01)，与其它各磁场作用时间比较有高度差异(P<0.001)。
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附表 两组动脉平滑肌细胞增殖的光密度值和每分计数值(
±s) 组别光密度值
每分计数值
0 min/d
10 min/d
20 min/d
30 min/d
0 min/d
10 min/d
20 min/d
, 百拇医药 30 min/d
对照组
0.5160±0.0115
—
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2747±1200
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实验组
20mT
—
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0.4904±0.0093
0.4113±0.0133*
0.3869±0.0114*
—
1861±942*
1732±722**
1386±530**
40mT
—
0.4140±0.0094*
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0.3671±0.0067*
0.2898±0.0107**
—
1648±731**
1375±614**
1353±633**
60mT
—
0.4548±0.0052
0.3777±0.0100*
, 百拇医药
0.3933±0.0128*
—
1730±606**
1454±568**
1517±415**
注：与对照组0 min/d比较*P<0.01 **P<0.001。—：未测3 讨论
近年来，有关磁场促进创伤组织愈合的研究文献较多[4]，但磁场调控ASMCs增殖的研究却未见报道。有研究认为磁场作用时间小于10 min对表皮细胞的增殖起促进作用，大于10 min呈现抑制作用[5]。本实验仅发现磁场对ASMCs增殖的抑制效应，可能与磁场作用时间大于10 min有关。在磁场的作用下，实验组ASMCs的增殖均受到不同程度的抑制，以40 mT磁场最显著，20 mT磁场相对较弱。由于电磁体的磁场强度随着距离的增大而减弱，而且在原始数据的统计过程中也发现越靠近磁场的培养孔，ASMCs增殖的A值和每分计数值就越小，所以磁场对ASMCs增殖的抑制作用还与ASMCs与磁场的空间距离有关，表现为空间距离性或场强敏感性。磁场对ASMCs增殖的调控作用还具有时间依赖性，即随着磁场作用时间的延长，ASMCs的增殖作用呈逐渐递减的趋势。Nossol等[6]在研究磁场对细胞色素C氧化酶活性的影响时也发现了同样的现象。
, 百拇医药
磁场抑制ASMCs增殖的作用机制可能为：①磁场对细胞新陈代谢的影响：培养液中的荷电离子，如钾、钠、氯、钙、镁、磷等离子，在磁场的作用下其荷电能力发生改变，影响了这些离子的移动速度和排列形式，使细胞代谢所需酶的活性或功能受到干扰，细胞代谢水平降低，细胞的增殖能力降低[5，6]；②磁场对脱氧核糖核酸(DNA)合成的影响：磁场的能量直接作用于DNA合成的信使转录系统，降低了DNA的合成速度，使ASMCs的增殖受到抑制[7]。
有文献报道适当强度的磁场对心脏的传导和收缩功能无显著影响[8～10]。我们的动物实验已证实，磁化支架能显著降低PTCA支架后冠脉再狭窄率，但有待进一步的临床观察。
作者简介：吕安林(1962—) 男 副教授 博士后 主要从事冠心病介入治疗研究
参考文献
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1，Farb A,Sangiorgi G,Carter AJ,et al.Pathology of acute and chronic coronary stenting in humans.Circulation,1999,99:44—52.
2，Mgosaki N,Tsurumi Y,Hosoda S.Current approaches to restenosis after coronary interventions.Nippon Rinsho,1998,56:242—248.
3，Leon MB,Popma JJ,Mintz GS,et al.An overview of US coronary stent trials.Semi Interv Cardiol,1998,1:247—254.
4，Darendeliler MA,Darendeliler A,Sinclair PM.Effects of static magnetic and pulsed electromagnetic fields on bone healing.Lnt J Adult Orthognath Surg,1997,12:43—53.
, 百拇医药
5，陈树德，张红锋，陈家森，等.低频电磁场对细胞生物学效应的研究.中华物理医学杂志，1998，20：78—80.
6，Nossol B,Buse G,Silny J.Influence of weak static 50 Hz magnetic fields on the redox activity of cytochrome-C.Bioel Ctromagnetics,1993,14:361—372.
7，Lai H,Singh NP.Acute exposure to a 60 Hz magnetic field increases DNA strand breaks in rat brain cells.Bioelectromagnetics,1997,18:156—165.
8，Grassi-Schultheiss PP,Heller F,Dobson J.Analysis of magentic material in the human heart,spleen and liver.Biometals,1997,10:351—355.
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9，Mouchawar GA,Bourland TD,Nyenhuis TA.Closed-chest cardiac stimulation with a pulsed magnetic field.Med Biol Eng Comput,1992,30:162—168.
10，Kazakova RT,Badakva AM.Effect of isolated and combined effect of a constant magentic field and antiorthostatic hypokinesia on central hemodynamics in rats.Kosm Biol Avikosm Med,1991,25:48—49.
收稿：1999-12-16
修稿：2000-05-26, http://www.100md.com