大鼠脊髓急性损伤后P53蛋白的表达
作者：傅强 侯铁胜 鲁凯伍 赵杰 李明 贺石生
单位：上海长海医院骨科，上海 200433
关键词：p53蛋白；脊髓损伤；凋亡
颈腰痛杂志000406 摘要：目的：探讨p53在脊髓损伤后神经细胞凋亡中，可能发挥的 作用。方法：选择大鼠脊髓急性压迫损伤模型，采用HE、Nissl染色和免疫 组化方法，检测了损伤后30min、2h、4h、8h、24h、48h和72h时间点脊髓组织。结 果：在损伤后4h损伤段及相邻节段脊髓中有大量p53阳性细胞，并在24h时达高峰。 高倍镜下阳性细胞形态主要分为两种：一类细胞阳性信号主要位于细胞核内，另一类细胞阳 性信号主要位于胞浆内。结论：P53蛋白可能在诱导神经细胞及胶质细胞凋 亡的过程中，发挥了重要作用。
中图分类号：R651.2 文献标识码：A
, 百拇医药
文献编号：1005-7234(2000)04 -0280-02
P53 protein expression after acute rat spinal cord injury
FU Qiang HOU Tie-sheng LU Kai-wu et al.
(Department of Orthopedics,Changhai Hospitai,The Second Military Medical Univer sity,Shanghai 200433, China)
Abstract:Objective:To determine the expression of p53 protein i n the rat spinal cord after compression injury.Methods:The spin al cord of rats with compression injury at the level of T8.9 in moderate degree,rats were killed at 30min,2,4,8,24,48 or 72 hours after injury(n=4 pre group).Three segments of every spinal cord were cut for morphological studies ,including hematoxylin and eosin staining,Nissl stain and immunohistochemical st aining.Results:p53 immunoreactivity were present in the compression reg ion and neighbor regions after 4h,with a maximum presence at 24h in the compress ed segment.The positive cells revealed two types of morphological features on l ight microscopy,some cells revealing typical apoptotic morphology.Concl usion:The p53 protein may play an important role in induction of neuron and glial cells to apoptosis.
, 百拇医药
Key words:p53 protein;spinal co rd injury;apoptosis
P53是目前人类研究最广泛、深入的一个抑癌基因。现已发现p53不仅作为重要的抑癌基 因发挥作用，还参与了细胞分化、增殖、衰老、死亡等过程，并涉及基因转录、DNA损伤与 修复、基因组稳定性及细胞周期调控等多个方面[1]。我们检测了急性压迫损伤的 大鼠脊髓组织中p53蛋白的表达，以探讨其在脊髓损伤后神经细胞凋亡中可能发挥的作用。
1 材料和方法
1.1 动物 成年雄性SD大鼠，重量( 300±20)g，共32只(购于BK公司)。动物随机分组：对照组，损伤组分为30min、2、4、8、2 4、48和72h时间组，每组4只。损伤组脊髓损伤模型参照Nyström法，致中度损伤。对 照组大鼠仅行椎板切除术。
, 百拇医药
1.2 取材及切片 动物在各时间点麻醉后，经左心室-主动脉插管灌流，完整取出脊髓组 织。先将每一标本切为损伤段(T8，9)、相邻头侧段(T7)和相邻尾侧段(T10) ，每段长约5mm。石蜡包埋后，连续切片，片厚10μm。每个组织块随机取连续切片3张，分 别做HE、Nissl染色、免疫组化。
1.3 免疫组化 采用SABC法；切片脱蜡至水，微波修复抗原。滴加封闭液。滴加抗p53的 一抗工作液(武汉博士德公司)，37℃2h。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃20min。滴加HI GH-SABC液37℃40min，以增加敏感性及降低背景。PBS冲洗，DAB显色，苏木素轻度复染， 脱水封片。
1.4 计算机图象分析 将损伤段免疫组化切片进行图象分析，计数左侧脊髓中阳性细胞数 以进行比较。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 HE及Nissl染色 光镜下可见损伤区30min即有广泛出血灶。8h时灰质结构破坏，大量 神经元死亡，部分神经元固缩，Nissl体减少。此时相邻节段后柱，也有明显出血坏死灶出 现。24h后损伤段灰质结构紊乱，仅有少量神经元存活。相邻节段损伤加重。48～72h后，损 伤范围基本确定。
2.2 免疫组化 对照组、阴性实验及30min，2h无明显阳性细胞。4h后各节段灰白质中均 有大量阳性细胞出现。损伤段24h阳性细胞数量达高峰(图A)。72h仍有表达，但数量明显下 降。相邻节段也有大量阳性细胞(计数结果见图1)。在高倍镜下，我们发现阳性细胞形态主 要分为两种类型：一类细胞阳性物质主要位于细胞核内，另一类细胞阳性物质主要位于胞浆 内。前者细胞形态大多异常，表现为细胞胞体固缩，染色质常呈半月状贴于核膜(图B)。这 类细胞形态及分布和SCI后出现的凋亡细胞相似[2]。而后者形态大多比较正常(图C )，常出现于损伤早期及位于损伤比较轻的区域。脊髓白质中有大量阳性胶质细胞，上述两 种形态对比明显(图D)。
, 百拇医药
图1 大鼠脊髓p53阳性细胞计数结果
3 讨 论
目前，大量实验已经证实SCI后广泛存在神经细胞凋亡，这是继发性损伤期的一个重要病理 变化。Crowe等采用Hoeschst染色法，发现大鼠SCI后6h出现神经细胞染色质浓聚，并可持续 到21d[3]。Li等采用原位末端标记法(TUNEL)，发现SCI后4～9d有大量胶质细胞凋 亡，但Bcl-2蛋白仅有少量表达[4]。Katoh等采用DNA电泳发现SCI后大量DNA呈片 断化损伤[5]。Liu等观察到SCI后神经元的凋亡，并在伤后8h达高峰[6]。 我们也在SCI模型中观察到大量神经元、胶质细胞的凋亡[2]。SCI后神经细胞凋亡 的意义在于，它是一个程序性过程，存在加以调控的可能性，因而成为当前研究的热点。
神经细胞凋亡除具有形态学特征外，还包括DNA损伤、相关基因表达等方面。而p53参与了DN A的损伤及修复，并可以调节多种相关基因的表达，所以成为调控细胞凋亡的核心物质之一 。最近的研究表明，中枢神经系统损伤后，p53mRNA及p53蛋白在损伤区域表达均增加，其中 p53mRNA的表达可能先于神经细胞凋亡。而p53蛋白可能以突变型为主。但尚无特殊抗体鉴别 神经组织内表达的p53蛋白类型。这可能是因为p53与DNA或其他蛋白(如HSPs等)结合，而改 变了其构型。国外学者发现p53蛋白在神经细胞核内及胞浆内均可表达[7]。本实验 也证实了这一点，从表达细胞形态来看，核内表达的细胞，大都为损伤后正在发生形态改变 的细胞；而在胞浆内表达的神经细胞，多为未损伤或形态较正常的细胞。这提示核内p53蛋 白的堆积，可能与神经细胞凋亡相关。
, 百拇医药
在体外实验中，Xiang等采用腺病毒将p53基因转入p53基因缺失(p53-/-)小鼠的皮质和海 马神经元中。结果转入4h后，p53在神经元细胞核内表达。从24h起神经元开始大量凋亡，第 5d时仅有5%神经元存活[8]。而Wood等在体内实验中发现，p53-/-小鼠全身照射 g射线后，未引起小脑粒细胞凋亡；而p53+/+小鼠照射后，则有大量小脑粒细胞凋亡[ 9]。从这些资料可以推测，p53参与了创伤所致的神经细胞凋亡，并在其中发挥了重要作 用。其作用机制可能包括以下几个主要环节：①神经细胞DNA轻微损伤，诱导p53在转录和翻 译水平大量表达；②调节相关基因表达(如使bcl-2、IGF-1R、c-myc等表达减少，而使ba x、p21、Fas等表达增加)；③与其他蛋白形成复合物，参与DNA合成、复制、修复。总之p53 可能具有双向调控作用：先参与损伤DNA的修复，如失败则启动凋亡程序。
本实验初步观察了SCI后p53蛋白的表达，及其在空间和时相上的分布特点。并观察到两种形 态的阳性细胞。这些都为p53参与SCI后神经细胞凋亡，提供了证据。今后的研究重点，将是 其作用机制。希望通过对p53及其相关基因的深入研究，为下一步SCI的基因治疗，筛选有效 的目的基因。
, 百拇医药
基金项目：上海科委学科带头人基金赞助(97XD14015)
作者简介：傅强(1971-)，男，江苏南京人，主治医师，博士，讲师研究方向：脊柱外科.
参 考 文 献：
[1] Fukasawa K, Chio T, Kuriyama R, et al. Abnormal centrosome a mplification in the absence of p53[J]. Science, 1996,271:1744-5.
[2] 傅 强，侯铁胜，刘善荣，等.大鼠脊髓压迫性损伤后神经细胞的死亡方式[J ].第二军医大学学报，1997，18：557-9.
[3] CroweMJ,ShumanSJ,MastersJN,etal.Morphological evidence suggesting ap optosis nuclei in spinal cord injury[J]. Soc Neursci Abstr, 1995,21:232-4.
, http://www.100md.com
[4] Li GL,GregerB,MohammadF,etal.Apoptosis and expression of bcl-2 afte r compression trauma to rat spinal cord[J]. J Neuropathol Exp Neurol, 199 6,55:280-7.
[5] Katoh K, Ikata T, Katoh S, et al. Induction and its s pread of apoptosis in rat spinal cord after mechanical trauma[J]. Neurosci Le tt, 1996,216:9-14.
[6] Liu Xz, Xu XM, Hu R, et al. Neuronal and glial apoptosis after traum atic spinal cord injury [J]. J Neurosci, 1997,17:5395-406.
, 百拇医药
[7] Halazonetis TD, Davis LJ, Kandil AN, Wild-type p53 adopt a mutant-l ike conformation when bound to DNA[J]. EMBO J,1993,12:1021-8.
[8] Xiang H, Hochman DW, Saya H, et al. Evidence for p53 mediated modula tion of neuronal viability[J]. J Neurosci, 1996,16:6753-61.
[9] Wood KA, Youle RY. The role of free radicals and p53 in neuron apopt osis in vivo[J]. J Neurosci, 1995,15:5851-7.
收稿：2000-02-29
修订日期：2000-04-26, http://www.100md.com
单位：上海长海医院骨科，上海 200433
关键词：p53蛋白；脊髓损伤；凋亡
颈腰痛杂志000406 摘要：目的：探讨p53在脊髓损伤后神经细胞凋亡中，可能发挥的 作用。方法：选择大鼠脊髓急性压迫损伤模型，采用HE、Nissl染色和免疫 组化方法，检测了损伤后30min、2h、4h、8h、24h、48h和72h时间点脊髓组织。结 果：在损伤后4h损伤段及相邻节段脊髓中有大量p53阳性细胞，并在24h时达高峰。 高倍镜下阳性细胞形态主要分为两种：一类细胞阳性信号主要位于细胞核内，另一类细胞阳 性信号主要位于胞浆内。结论：P53蛋白可能在诱导神经细胞及胶质细胞凋 亡的过程中，发挥了重要作用。
中图分类号：R651.2 文献标识码：A
, 百拇医药
文献编号：1005-7234(2000)04 -0280-02
P53 protein expression after acute rat spinal cord injury
FU Qiang HOU Tie-sheng LU Kai-wu et al.
(Department of Orthopedics,Changhai Hospitai,The Second Military Medical Univer sity,Shanghai 200433, China)
Abstract:Objective:To determine the expression of p53 protein i n the rat spinal cord after compression injury.Methods:The spin al cord of rats with compression injury at the level of T8.9 in moderate degree,rats were killed at 30min,2,4,8,24,48 or 72 hours after injury(n=4 pre group).Three segments of every spinal cord were cut for morphological studies ,including hematoxylin and eosin staining,Nissl stain and immunohistochemical st aining.Results:p53 immunoreactivity were present in the compression reg ion and neighbor regions after 4h,with a maximum presence at 24h in the compress ed segment.The positive cells revealed two types of morphological features on l ight microscopy,some cells revealing typical apoptotic morphology.Concl usion:The p53 protein may play an important role in induction of neuron and glial cells to apoptosis.
, 百拇医药
Key words:p53 protein;spinal co rd injury;apoptosis
P53是目前人类研究最广泛、深入的一个抑癌基因。现已发现p53不仅作为重要的抑癌基 因发挥作用，还参与了细胞分化、增殖、衰老、死亡等过程，并涉及基因转录、DNA损伤与 修复、基因组稳定性及细胞周期调控等多个方面[1]。我们检测了急性压迫损伤的 大鼠脊髓组织中p53蛋白的表达，以探讨其在脊髓损伤后神经细胞凋亡中可能发挥的作用。
1 材料和方法
1.1 动物 成年雄性SD大鼠，重量( 300±20)g，共32只(购于BK公司)。动物随机分组：对照组，损伤组分为30min、2、4、8、2 4、48和72h时间组，每组4只。损伤组脊髓损伤模型参照Nyström法，致中度损伤。对 照组大鼠仅行椎板切除术。
, 百拇医药
1.2 取材及切片 动物在各时间点麻醉后，经左心室-主动脉插管灌流，完整取出脊髓组 织。先将每一标本切为损伤段(T8，9)、相邻头侧段(T7)和相邻尾侧段(T10) ，每段长约5mm。石蜡包埋后，连续切片，片厚10μm。每个组织块随机取连续切片3张，分 别做HE、Nissl染色、免疫组化。
1.3 免疫组化 采用SABC法；切片脱蜡至水，微波修复抗原。滴加封闭液。滴加抗p53的 一抗工作液(武汉博士德公司)，37℃2h。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃20min。滴加HI GH-SABC液37℃40min，以增加敏感性及降低背景。PBS冲洗，DAB显色，苏木素轻度复染， 脱水封片。
1.4 计算机图象分析 将损伤段免疫组化切片进行图象分析，计数左侧脊髓中阳性细胞数 以进行比较。
2 结 果
, 百拇医药
2.1 HE及Nissl染色 光镜下可见损伤区30min即有广泛出血灶。8h时灰质结构破坏，大量 神经元死亡，部分神经元固缩，Nissl体减少。此时相邻节段后柱，也有明显出血坏死灶出 现。24h后损伤段灰质结构紊乱，仅有少量神经元存活。相邻节段损伤加重。48～72h后，损 伤范围基本确定。
2.2 免疫组化 对照组、阴性实验及30min，2h无明显阳性细胞。4h后各节段灰白质中均 有大量阳性细胞出现。损伤段24h阳性细胞数量达高峰(图A)。72h仍有表达，但数量明显下 降。相邻节段也有大量阳性细胞(计数结果见图1)。在高倍镜下，我们发现阳性细胞形态主 要分为两种类型：一类细胞阳性物质主要位于细胞核内，另一类细胞阳性物质主要位于胞浆 内。前者细胞形态大多异常，表现为细胞胞体固缩，染色质常呈半月状贴于核膜(图B)。这 类细胞形态及分布和SCI后出现的凋亡细胞相似[2]。而后者形态大多比较正常(图C )，常出现于损伤早期及位于损伤比较轻的区域。脊髓白质中有大量阳性胶质细胞，上述两 种形态对比明显(图D)。
, 百拇医药
图1 大鼠脊髓p53阳性细胞计数结果
3 讨 论
目前，大量实验已经证实SCI后广泛存在神经细胞凋亡，这是继发性损伤期的一个重要病理 变化。Crowe等采用Hoeschst染色法，发现大鼠SCI后6h出现神经细胞染色质浓聚，并可持续 到21d[3]。Li等采用原位末端标记法(TUNEL)，发现SCI后4～9d有大量胶质细胞凋 亡，但Bcl-2蛋白仅有少量表达[4]。Katoh等采用DNA电泳发现SCI后大量DNA呈片 断化损伤[5]。Liu等观察到SCI后神经元的凋亡，并在伤后8h达高峰[6]。 我们也在SCI模型中观察到大量神经元、胶质细胞的凋亡[2]。SCI后神经细胞凋亡 的意义在于，它是一个程序性过程，存在加以调控的可能性，因而成为当前研究的热点。
神经细胞凋亡除具有形态学特征外，还包括DNA损伤、相关基因表达等方面。而p53参与了DN A的损伤及修复，并可以调节多种相关基因的表达，所以成为调控细胞凋亡的核心物质之一 。最近的研究表明，中枢神经系统损伤后，p53mRNA及p53蛋白在损伤区域表达均增加，其中 p53mRNA的表达可能先于神经细胞凋亡。而p53蛋白可能以突变型为主。但尚无特殊抗体鉴别 神经组织内表达的p53蛋白类型。这可能是因为p53与DNA或其他蛋白(如HSPs等)结合，而改 变了其构型。国外学者发现p53蛋白在神经细胞核内及胞浆内均可表达[7]。本实验 也证实了这一点，从表达细胞形态来看，核内表达的细胞，大都为损伤后正在发生形态改变 的细胞；而在胞浆内表达的神经细胞，多为未损伤或形态较正常的细胞。这提示核内p53蛋 白的堆积，可能与神经细胞凋亡相关。
, 百拇医药
在体外实验中，Xiang等采用腺病毒将p53基因转入p53基因缺失(p53-/-)小鼠的皮质和海 马神经元中。结果转入4h后，p53在神经元细胞核内表达。从24h起神经元开始大量凋亡，第 5d时仅有5%神经元存活[8]。而Wood等在体内实验中发现，p53-/-小鼠全身照射 g射线后，未引起小脑粒细胞凋亡；而p53+/+小鼠照射后，则有大量小脑粒细胞凋亡[ 9]。从这些资料可以推测，p53参与了创伤所致的神经细胞凋亡，并在其中发挥了重要作 用。其作用机制可能包括以下几个主要环节：①神经细胞DNA轻微损伤，诱导p53在转录和翻 译水平大量表达；②调节相关基因表达(如使bcl-2、IGF-1R、c-myc等表达减少，而使ba x、p21、Fas等表达增加)；③与其他蛋白形成复合物，参与DNA合成、复制、修复。总之p53 可能具有双向调控作用：先参与损伤DNA的修复，如失败则启动凋亡程序。
本实验初步观察了SCI后p53蛋白的表达，及其在空间和时相上的分布特点。并观察到两种形 态的阳性细胞。这些都为p53参与SCI后神经细胞凋亡，提供了证据。今后的研究重点，将是 其作用机制。希望通过对p53及其相关基因的深入研究，为下一步SCI的基因治疗，筛选有效 的目的基因。
, 百拇医药
基金项目：上海科委学科带头人基金赞助(97XD14015)
作者简介：傅强(1971-)，男，江苏南京人，主治医师，博士，讲师研究方向：脊柱外科.
参 考 文 献：
[1] Fukasawa K, Chio T, Kuriyama R, et al. Abnormal centrosome a mplification in the absence of p53[J]. Science, 1996,271:1744-5.
[2] 傅 强，侯铁胜，刘善荣，等.大鼠脊髓压迫性损伤后神经细胞的死亡方式[J ].第二军医大学学报，1997，18：557-9.
[3] CroweMJ,ShumanSJ,MastersJN,etal.Morphological evidence suggesting ap optosis nuclei in spinal cord injury[J]. Soc Neursci Abstr, 1995,21:232-4.
, http://www.100md.com
[4] Li GL,GregerB,MohammadF,etal.Apoptosis and expression of bcl-2 afte r compression trauma to rat spinal cord[J]. J Neuropathol Exp Neurol, 199 6,55:280-7.
[5] Katoh K, Ikata T, Katoh S, et al. Induction and its s pread of apoptosis in rat spinal cord after mechanical trauma[J]. Neurosci Le tt, 1996,216:9-14.
[6] Liu Xz, Xu XM, Hu R, et al. Neuronal and glial apoptosis after traum atic spinal cord injury [J]. J Neurosci, 1997,17:5395-406.
, 百拇医药
[7] Halazonetis TD, Davis LJ, Kandil AN, Wild-type p53 adopt a mutant-l ike conformation when bound to DNA[J]. EMBO J,1993,12:1021-8.
[8] Xiang H, Hochman DW, Saya H, et al. Evidence for p53 mediated modula tion of neuronal viability[J]. J Neurosci, 1996,16:6753-61.
[9] Wood KA, Youle RY. The role of free radicals and p53 in neuron apopt osis in vivo[J]. J Neurosci, 1995,15:5851-7.
收稿：2000-02-29
修订日期：2000-04-26, http://www.100md.com