EB病毒潜伏膜蛋白2重组逆转录病毒的构建及表达
作者：朱伟严 周玲 姚家伟 曾毅
单位：中国预防医学科学院病毒学研究所肿瘤室 北京 100052
关键词：疱疹病毒科；膜蛋白质类；基因表达
中华实验和临床病毒学杂志000410 【摘要】 目的 寻找在真核细胞中表达Epstein-Barr(EB)病毒潜伏膜蛋白2(Latent membrane protein 2,LMP2)的有效途径，研究LMP2蛋白功能及深入探讨其在诱导细胞免疫应答中的作用。方法 将EB病毒LMP2蛋白的基因重组至逆转录病毒载体LXSN上，通过脂质体将重组质粒导入PT67细胞，G418筛选抗性克隆，收集含重组病毒的上清，将其感染小鼠成纤维细胞NIH 3T3，测定病毒滴度，提取转染细胞DNA进行PCR鉴定，间接免疫荧光法检测外源基因在感染病毒的NIH 3T3中的表达。 结果 培养上清的病毒滴度为5.8×105 PFU/ml，聚合酶链反应(PCR)结果证实，转染细胞的DNA中含有目的基因的特异性片段。免疫荧光结果表明EBV-LMP2基因在小鼠成纤维细胞中获得表达。 结论 重组逆转录病毒成功地将EB病毒LMP2基因整合到细胞中并得以表达。
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Expression of Epstein-Barr virus latent membrane protein 2 in murine fibroblasts by retroviral-mediated gene transfer
ZHU Weiyan,ZHOU Ling, YAO Jiawei
(Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052, China)
【Abstract】 Objective This study is to find an efficient way to express EB virus latent membrane protein 2 in mammalian cells, and provide for further investigate on the function of LMP2 protein and its role in cellular immunity. Methods The LMP2 gene was cloned into the EcoR Ⅰ site of a retroviral vector LXSN and the recombinant LXSN-LMP2 was tranfected into PT67 by lipofect TAMINE.After screened by G418,the supernatant of G418-resistant cells was used to infect murine fibroblasts NIH 3T3 to determine the virus titer. DNA was extracted from transfected cells and tested by PCR. Indirect immunofluorescence assay was used to detect the expression of the inserted gene. Results The virus titer was 5.8×105 PFU/ml. The result of PCR showed that the LMP2 gene had been integrated into the DNA of transfected cells. Indirect immunofluoresecence showed that the LMP2 gene had been expressed in the murine fibroblasts. Conclusion EB virus LMP2 gene had been integrated into the genome of cells by retroviral-mediated transfer and the target gene had been expressed.
, 百拇医药
【Key words】 Herpesviridae; Membrane proteins; Gene expression
鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是中国南方一种高发的恶性肿瘤，大量的流行病和实验室证据提示EB病毒与鼻咽癌关系密切。我室的研究工作首次证明EB病毒在TPA和丁酸协同作用下能诱发人胚鼻咽部上皮细胞恶变。这些工作表明EB病毒在鼻咽癌发生中起重要作用〔1〕。在鼻咽癌患者的肿瘤组织中有EB病毒的EBNA-1，LMP1，LMP2基因表达〔2，3〕。已有研究证明，EBV的LMP1和LMP2能诱发特异性细胞免疫。如果能用LMP1和LMP2抗原免疫IgA抗体阳性的高危人群或鼻咽癌病人，提高LMP1和LMP2特异性细胞免疫，就可能对表达这些抗原的肿瘤细胞进行杀伤，预防肿瘤的发生、复发或转移〔4〕。为了寻找表达EBV LMP2的有效方法，我们构建了EB病毒LMP2重组逆转录病毒，将其感染小鼠成纤维细胞并得到表达。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 质粒和细胞 质粒pSG5-LMP2含有EB病毒LMP2的cDNA，逆转录病毒载体LXSN、包装细胞PT67和小鼠成纤维细胞NIH 3T3为本室冻存。
1.2 试剂 各限制性内切酶、连接酶、牛小肠碱性磷酸酶(CIP)为Promega公司产品。DMEM和脂质体在GIBCO公司购买。Polybrene在Sigma公司购买。PCR试剂盒购于TaKaRa公司。大鼠LMP2单抗由英国伯明翰大学Alan教授惠赠。
1.3 重组逆转录病毒载体的构建 见图1。
图1 重组质粒pLXSN-LMP2的构建
Fig.1 Scheme for the construction of recombinant plasmid pLXSN-LMP2
, 百拇医药
1.4 PT67细胞的转染和病毒滴度的测定 参照文献〔6〕。20 μl脂质体及8 μl重组质粒DNA混合，30 min后补无血清培养基至3 ml淋于24 h内传代长有50%PT67细胞的大方培养瓶上，37℃ 5%CO2孵育4 h后补3 ml 20%牛血清培养基。24 h后换液，待细胞长满后1∶6传代，加G418 600 μg/ml，约2周后抗性克隆出现，挑克隆扩大培养，收集抗性细胞上清稀释后感染NIH 3T3细胞，加Polybrene,使终浓度8 μg/ml。次日传代后加G418 800 μg/ml，根据抗性克隆数及稀释倍数换算病毒滴度。
1.5 PCR方法检测目的基因 针对LMP2基因保守区设计一对引物，P1 5′-CGGGATCCATATGCTT
TTAACATTGGCAGC-3’，P2 5’-CGGGATCCAGT
GTAAGGCAGTAGTAG-3’。提取抗性细胞基因组DNA，取0.1 μg作为模板，各加入50 pmol/L的引物P1和P2，置50 μl的PCR扩增体系，按94℃ 30 s,58℃ 45 s,72℃ 60 s,共进行30个循环，最后72℃延伸10 min。电泳分析产物。
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1.6 间接免疫荧光检测目的基因表达 感染病毒的NIH 3T3细胞培养72 h后制细胞涂片，丙酮固定10 min，加LMP2单抗37℃孵育30 min，PBS洗3次，加抗大鼠FITC二抗37℃孵育30 min，PBS洗，伊文斯蓝染色后在荧光显微镜下观察。
2 结果
2.1 重组逆转录病毒载体的限制性内切酶酶切分析 pLXSN-LMP2正向重组质粒EcoR Ⅰ酶切后片段大小为2.0 kb，5.8 kb；BamH Ⅰ酶切后片段为1.9 kb，5.9 kb；Sma Ⅰ酶切后片段为1.7 kb，2.8 kb，3.3 kb；Hind Ⅲ酶切后片段为7.8 kb(图2)。
图2 重组逆转录病毒载体的酶切鉴定
Fig.2 Identification of recombinant retroviral
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vector with restriction enzyme digestion
1：DL 15 000 marker.2:pLXSN.3:pLXSN-LMP2.
4:pLXSN-LMP2/EcORI. 5:pLXSN-LMP2/BamHⅠ.
6:pLXSN-LMP2/Sma Ⅰ. 7:pLXSN-LMP2/Hind Ⅲ
2.2 转染效率和病毒滴度的测定 5×105PT67细胞转染后经G418筛选获得23个阳性克隆，表明转染效率4.6×10-5。抗性细胞混合克隆的病毒滴度为5.8×105PFU/ml。
2.3 转染细胞系的鉴定 PCR结果显示，只有PT67-LMP2包装细胞及感染重组病毒的NIH 3T3细胞DNA中有长520 bp的LMP2特异性扩增条带。其他均为阴性。表明EBV-LMP2重组逆转当病毒成功感染细胞并将EB病毒LMP2基因整合到细胞中。
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2.4 免疫荧光检测 间接免疫荧光法检测LMP2蛋白在NIH 3T3细胞上的表达结果见图版ⅠB。
3 讨论
EB病毒为疱疹病毒科嗜淋巴细胞病毒，能引起青少年的传染性单核细胞增多症及在免疫抑制者中形成恶性B淋巴细胞增生，现已明确EB病毒是导致Burkitt淋巴瘤，鼻咽癌的病因之一，还与何杰金氏，非何杰金氏淋巴瘤，外周T细胞淋巴瘤有关。
图3 PCR检测各细胞基因组中LMP2片段的结果
Fig.3 PCR detection of LMP2 gene
fragment from different cell genomes
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1:DL 2 000 marker. 2:From DNA of PT67-LMP2 cells.
3:From DNA of NIH 3T3-LMP2 cells. 4:From DNA of PT67 cells.
5:From DNA of NIH 3T3 cells
EB病毒在人体中有极高的感染率，然而仅少数个体发生恶性肿瘤，显然特异性细胞免疫在杀伤肿瘤细胞，防止肿瘤发生中有重要作用。研究发现NPC中特异性杀伤T细胞的功能受到抑制。NPC患者外周血中LMP1的特异性细胞免疫明显低于正常人群。因此，如果能在EB病毒感染阳性者体内持续表达含CTL表位的EBV相关靶蛋白，激活特异性记忆T细胞，诱发和提高机体抗EBV的细胞免疫水平。这种CTL反应对肿瘤具有潜在的预防和治疗价值。肿瘤形成的另一机制是肿瘤逃逸宿主的免疫监督作用，只有与MHC分子结合呈递至细胞表面的抗原才能被其特异性CTL识别而杀伤肿瘤细胞。在鼻咽癌等EBV相关恶性肿瘤组织中仅有EBNA1，LMP1，LMP2是持续表达的蛋白，EBNA1蛋白中的GAr重复序列阻止EBNA1通过HLA向免疫细胞呈递的过程，不能引起有效的杀伤。LMP1基因具有肿瘤基因的特性，而LMP2无转 化作用，含多种受HLA限制的CTL表位〔5〕，其序列保守，相关的HLA型别在中国南方人群中很常见。应用LMP2发展EB病毒治疗性疫苗是良好的研究方向。1996年Lammali研究NPC组织中EBV基因和原癌基因转录状况时发现LMP2在大多数NPC患者各病变时期的病理活检组织中均有表达〔6〕。LMP2基因组长12 kb，含8个外显子，转录长2.3 kb和2.0 kb的两段mRNA分别编码54 000，40 000的蛋白，其基因称为LMP 2A，LMP 2B。LMP 2B是LMP 2A中的一部分〔7〕。LMP2基因中含多个不被大肠埃希菌常用的密码子，因此利用原核系统高效表达LMP2蛋白制备抗原较为困难。体外合成肽的方法简便，但免疫原性弱价格昂贵，因此利用重组病毒介导的免疫治疗较为实际。肿瘤基因治疗中基因的转导方式很多，其中逆转录病毒介导的基因转染应用最为广泛〔8，9〕。我们将LMP2基因定向克隆入逆转录病毒载体LXSN中，经包装细胞包装后获得带有LMP2的复制缺陷病毒，感染小鼠成纤维细胞NIH 3T3后发现LMP2基因有表达。这为进一步深入研究EB病毒LMP2蛋白功能，筛选抗LMP2的抗体，探讨应用LMP2蛋白治疗EB病毒相关肿瘤的研究奠定了基础。为获得高滴度的病毒我们将进一步做交叉感染及克隆筛选。
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图版 ⅠB 朱伟严等.EB病毒潜伏膜蛋白2重组逆转录病毒的构建及表达
Plate ⅠB ZHU Weiyan,et al.Expression of Epstein-Barr virus latent membrane protein 2 in murine fibroblasts by retroviral-mediated gene transfer
(Original article on p.342)
本课题由国家九七三基金资助(G1998051201)
参 考 文 献
1，Liu ZS,Liu YF,Zeng Y.Studies on human nasopharyngeal malignant lymphoma and undifferentiated carcinoma induced by the synergetic effect of EB virus and tumor promoter. J Cancer Res Clin Oncol,1998,1243：541-548.
, 百拇医药
2，Busson P,McCoy R,Sadler,et al. Consistent transcription of the Epstein-Barr virus LMP2 gene in nasopharyngeal carcinoma. J Virol,1992,66：3257-3262.
3，Lee SP,Tierney RJ,Thomas WA,et al.Conserved CTL epitopes within EBV latent membrne protein 2:A potential target for CTL-based tumor therapy. J Immun, 1997,158：3325-3334.
4，Sing AP,Ambinder RF,Hong DJ,et al. Isolation of Epstein-Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes that lyse Reed-sternberg cells:Implicaton for immune-mediated therapy of EBV+Hodgkin′s disease.Blood,1997,89：1978-1986.
, 百拇医药
5，Deacon EM,Pallesen G,Niedobitek J,et al.Epstein-Barr virus and Hodgkin′s disease:transcriptional analysis of virus latency in the malignant cells. J Exp Med,1993,177：339-349.
6，Lammali FS,Djennaoui D,Belaoui H,et al.Transcriiptional expression of Epstein-Barr virus genes and proto-oncogenes in North African nasopharyngeal carcinoma. J Med Virol,1996,49：7-14.
7，Sample J, Liebowitz D,Kieff E,et al.Two related Epstein-Barr virus membrane proteins are encoded by separate genes.J Virol,1989,63：933-937.
8，Aoki K,Yocheda T,Sugimura T,et al. Liposome-mediated in vivo gene transfer of antisense K-reconstruct inhibits pancreatic tumor dissemination in the murine peritoneal cavity. Cancer Res,1995,55：3810-3816.
(收稿日期：2000-02-21)
, 百拇医药
单位：中国预防医学科学院病毒学研究所肿瘤室 北京 100052
关键词：疱疹病毒科；膜蛋白质类；基因表达
中华实验和临床病毒学杂志000410 【摘要】 目的 寻找在真核细胞中表达Epstein-Barr(EB)病毒潜伏膜蛋白2(Latent membrane protein 2,LMP2)的有效途径，研究LMP2蛋白功能及深入探讨其在诱导细胞免疫应答中的作用。方法 将EB病毒LMP2蛋白的基因重组至逆转录病毒载体LXSN上，通过脂质体将重组质粒导入PT67细胞，G418筛选抗性克隆，收集含重组病毒的上清，将其感染小鼠成纤维细胞NIH 3T3，测定病毒滴度，提取转染细胞DNA进行PCR鉴定，间接免疫荧光法检测外源基因在感染病毒的NIH 3T3中的表达。 结果 培养上清的病毒滴度为5.8×105 PFU/ml，聚合酶链反应(PCR)结果证实，转染细胞的DNA中含有目的基因的特异性片段。免疫荧光结果表明EBV-LMP2基因在小鼠成纤维细胞中获得表达。 结论 重组逆转录病毒成功地将EB病毒LMP2基因整合到细胞中并得以表达。
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Expression of Epstein-Barr virus latent membrane protein 2 in murine fibroblasts by retroviral-mediated gene transfer
ZHU Weiyan,ZHOU Ling, YAO Jiawei
(Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052, China)
【Abstract】 Objective This study is to find an efficient way to express EB virus latent membrane protein 2 in mammalian cells, and provide for further investigate on the function of LMP2 protein and its role in cellular immunity. Methods The LMP2 gene was cloned into the EcoR Ⅰ site of a retroviral vector LXSN and the recombinant LXSN-LMP2 was tranfected into PT67 by lipofect TAMINE.After screened by G418,the supernatant of G418-resistant cells was used to infect murine fibroblasts NIH 3T3 to determine the virus titer. DNA was extracted from transfected cells and tested by PCR. Indirect immunofluorescence assay was used to detect the expression of the inserted gene. Results The virus titer was 5.8×105 PFU/ml. The result of PCR showed that the LMP2 gene had been integrated into the DNA of transfected cells. Indirect immunofluoresecence showed that the LMP2 gene had been expressed in the murine fibroblasts. Conclusion EB virus LMP2 gene had been integrated into the genome of cells by retroviral-mediated transfer and the target gene had been expressed.
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【Key words】 Herpesviridae; Membrane proteins; Gene expression
鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是中国南方一种高发的恶性肿瘤，大量的流行病和实验室证据提示EB病毒与鼻咽癌关系密切。我室的研究工作首次证明EB病毒在TPA和丁酸协同作用下能诱发人胚鼻咽部上皮细胞恶变。这些工作表明EB病毒在鼻咽癌发生中起重要作用〔1〕。在鼻咽癌患者的肿瘤组织中有EB病毒的EBNA-1，LMP1，LMP2基因表达〔2，3〕。已有研究证明，EBV的LMP1和LMP2能诱发特异性细胞免疫。如果能用LMP1和LMP2抗原免疫IgA抗体阳性的高危人群或鼻咽癌病人，提高LMP1和LMP2特异性细胞免疫，就可能对表达这些抗原的肿瘤细胞进行杀伤，预防肿瘤的发生、复发或转移〔4〕。为了寻找表达EBV LMP2的有效方法，我们构建了EB病毒LMP2重组逆转录病毒，将其感染小鼠成纤维细胞并得到表达。
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1 材料和方法
1.1 质粒和细胞 质粒pSG5-LMP2含有EB病毒LMP2的cDNA，逆转录病毒载体LXSN、包装细胞PT67和小鼠成纤维细胞NIH 3T3为本室冻存。
1.2 试剂 各限制性内切酶、连接酶、牛小肠碱性磷酸酶(CIP)为Promega公司产品。DMEM和脂质体在GIBCO公司购买。Polybrene在Sigma公司购买。PCR试剂盒购于TaKaRa公司。大鼠LMP2单抗由英国伯明翰大学Alan教授惠赠。
1.3 重组逆转录病毒载体的构建 见图1。
图1 重组质粒pLXSN-LMP2的构建
Fig.1 Scheme for the construction of recombinant plasmid pLXSN-LMP2
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1.4 PT67细胞的转染和病毒滴度的测定 参照文献〔6〕。20 μl脂质体及8 μl重组质粒DNA混合，30 min后补无血清培养基至3 ml淋于24 h内传代长有50%PT67细胞的大方培养瓶上，37℃ 5%CO2孵育4 h后补3 ml 20%牛血清培养基。24 h后换液，待细胞长满后1∶6传代，加G418 600 μg/ml，约2周后抗性克隆出现，挑克隆扩大培养，收集抗性细胞上清稀释后感染NIH 3T3细胞，加Polybrene,使终浓度8 μg/ml。次日传代后加G418 800 μg/ml，根据抗性克隆数及稀释倍数换算病毒滴度。
1.5 PCR方法检测目的基因 针对LMP2基因保守区设计一对引物，P1 5′-CGGGATCCATATGCTT
TTAACATTGGCAGC-3’，P2 5’-CGGGATCCAGT
GTAAGGCAGTAGTAG-3’。提取抗性细胞基因组DNA，取0.1 μg作为模板，各加入50 pmol/L的引物P1和P2，置50 μl的PCR扩增体系，按94℃ 30 s,58℃ 45 s,72℃ 60 s,共进行30个循环，最后72℃延伸10 min。电泳分析产物。
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1.6 间接免疫荧光检测目的基因表达 感染病毒的NIH 3T3细胞培养72 h后制细胞涂片，丙酮固定10 min，加LMP2单抗37℃孵育30 min，PBS洗3次，加抗大鼠FITC二抗37℃孵育30 min，PBS洗，伊文斯蓝染色后在荧光显微镜下观察。
2 结果
2.1 重组逆转录病毒载体的限制性内切酶酶切分析 pLXSN-LMP2正向重组质粒EcoR Ⅰ酶切后片段大小为2.0 kb，5.8 kb；BamH Ⅰ酶切后片段为1.9 kb，5.9 kb；Sma Ⅰ酶切后片段为1.7 kb，2.8 kb，3.3 kb；Hind Ⅲ酶切后片段为7.8 kb(图2)。
图2 重组逆转录病毒载体的酶切鉴定
Fig.2 Identification of recombinant retroviral
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vector with restriction enzyme digestion
1：DL 15 000 marker.2:pLXSN.3:pLXSN-LMP2.
4:pLXSN-LMP2/EcORI. 5:pLXSN-LMP2/BamHⅠ.
6:pLXSN-LMP2/Sma Ⅰ. 7:pLXSN-LMP2/Hind Ⅲ
2.2 转染效率和病毒滴度的测定 5×105PT67细胞转染后经G418筛选获得23个阳性克隆，表明转染效率4.6×10-5。抗性细胞混合克隆的病毒滴度为5.8×105PFU/ml。
2.3 转染细胞系的鉴定 PCR结果显示，只有PT67-LMP2包装细胞及感染重组病毒的NIH 3T3细胞DNA中有长520 bp的LMP2特异性扩增条带。其他均为阴性。表明EBV-LMP2重组逆转当病毒成功感染细胞并将EB病毒LMP2基因整合到细胞中。
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2.4 免疫荧光检测 间接免疫荧光法检测LMP2蛋白在NIH 3T3细胞上的表达结果见图版ⅠB。
3 讨论
EB病毒为疱疹病毒科嗜淋巴细胞病毒，能引起青少年的传染性单核细胞增多症及在免疫抑制者中形成恶性B淋巴细胞增生，现已明确EB病毒是导致Burkitt淋巴瘤，鼻咽癌的病因之一，还与何杰金氏，非何杰金氏淋巴瘤，外周T细胞淋巴瘤有关。
图3 PCR检测各细胞基因组中LMP2片段的结果
Fig.3 PCR detection of LMP2 gene
fragment from different cell genomes
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1:DL 2 000 marker. 2:From DNA of PT67-LMP2 cells.
3:From DNA of NIH 3T3-LMP2 cells. 4:From DNA of PT67 cells.
5:From DNA of NIH 3T3 cells
EB病毒在人体中有极高的感染率，然而仅少数个体发生恶性肿瘤，显然特异性细胞免疫在杀伤肿瘤细胞，防止肿瘤发生中有重要作用。研究发现NPC中特异性杀伤T细胞的功能受到抑制。NPC患者外周血中LMP1的特异性细胞免疫明显低于正常人群。因此，如果能在EB病毒感染阳性者体内持续表达含CTL表位的EBV相关靶蛋白，激活特异性记忆T细胞，诱发和提高机体抗EBV的细胞免疫水平。这种CTL反应对肿瘤具有潜在的预防和治疗价值。肿瘤形成的另一机制是肿瘤逃逸宿主的免疫监督作用，只有与MHC分子结合呈递至细胞表面的抗原才能被其特异性CTL识别而杀伤肿瘤细胞。在鼻咽癌等EBV相关恶性肿瘤组织中仅有EBNA1，LMP1，LMP2是持续表达的蛋白，EBNA1蛋白中的GAr重复序列阻止EBNA1通过HLA向免疫细胞呈递的过程，不能引起有效的杀伤。LMP1基因具有肿瘤基因的特性，而LMP2无转 化作用，含多种受HLA限制的CTL表位〔5〕，其序列保守，相关的HLA型别在中国南方人群中很常见。应用LMP2发展EB病毒治疗性疫苗是良好的研究方向。1996年Lammali研究NPC组织中EBV基因和原癌基因转录状况时发现LMP2在大多数NPC患者各病变时期的病理活检组织中均有表达〔6〕。LMP2基因组长12 kb，含8个外显子，转录长2.3 kb和2.0 kb的两段mRNA分别编码54 000，40 000的蛋白，其基因称为LMP 2A，LMP 2B。LMP 2B是LMP 2A中的一部分〔7〕。LMP2基因中含多个不被大肠埃希菌常用的密码子，因此利用原核系统高效表达LMP2蛋白制备抗原较为困难。体外合成肽的方法简便，但免疫原性弱价格昂贵，因此利用重组病毒介导的免疫治疗较为实际。肿瘤基因治疗中基因的转导方式很多，其中逆转录病毒介导的基因转染应用最为广泛〔8，9〕。我们将LMP2基因定向克隆入逆转录病毒载体LXSN中，经包装细胞包装后获得带有LMP2的复制缺陷病毒，感染小鼠成纤维细胞NIH 3T3后发现LMP2基因有表达。这为进一步深入研究EB病毒LMP2蛋白功能，筛选抗LMP2的抗体，探讨应用LMP2蛋白治疗EB病毒相关肿瘤的研究奠定了基础。为获得高滴度的病毒我们将进一步做交叉感染及克隆筛选。
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图版 ⅠB 朱伟严等.EB病毒潜伏膜蛋白2重组逆转录病毒的构建及表达
Plate ⅠB ZHU Weiyan,et al.Expression of Epstein-Barr virus latent membrane protein 2 in murine fibroblasts by retroviral-mediated gene transfer
(Original article on p.342)
本课题由国家九七三基金资助(G1998051201)
参 考 文 献
1，Liu ZS,Liu YF,Zeng Y.Studies on human nasopharyngeal malignant lymphoma and undifferentiated carcinoma induced by the synergetic effect of EB virus and tumor promoter. J Cancer Res Clin Oncol,1998,1243：541-548.
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2，Busson P,McCoy R,Sadler,et al. Consistent transcription of the Epstein-Barr virus LMP2 gene in nasopharyngeal carcinoma. J Virol,1992,66：3257-3262.
3，Lee SP,Tierney RJ,Thomas WA,et al.Conserved CTL epitopes within EBV latent membrne protein 2:A potential target for CTL-based tumor therapy. J Immun, 1997,158：3325-3334.
4，Sing AP,Ambinder RF,Hong DJ,et al. Isolation of Epstein-Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes that lyse Reed-sternberg cells:Implicaton for immune-mediated therapy of EBV+Hodgkin′s disease.Blood,1997,89：1978-1986.
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5，Deacon EM,Pallesen G,Niedobitek J,et al.Epstein-Barr virus and Hodgkin′s disease:transcriptional analysis of virus latency in the malignant cells. J Exp Med,1993,177：339-349.
6，Lammali FS,Djennaoui D,Belaoui H,et al.Transcriiptional expression of Epstein-Barr virus genes and proto-oncogenes in North African nasopharyngeal carcinoma. J Med Virol,1996,49：7-14.
7，Sample J, Liebowitz D,Kieff E,et al.Two related Epstein-Barr virus membrane proteins are encoded by separate genes.J Virol,1989,63：933-937.
8，Aoki K,Yocheda T,Sugimura T,et al. Liposome-mediated in vivo gene transfer of antisense K-reconstruct inhibits pancreatic tumor dissemination in the murine peritoneal cavity. Cancer Res,1995,55：3810-3816.
(收稿日期：2000-02-21)
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