汉城病毒新亚型的发现
作者：王华 吉松组子 张全福 霍子威 张明 杭长寿 有川二郎
单位：王华 张全福 霍子威 杭长寿(中国预防医学科学院病毒学研究所出血热及虫媒病毒研究室 北京 100052)张明(正阳县人民医院传染科)；吉松组子 有川二郎(日本北海道大学医学部)
关键词：汉坦病毒；碱基序列；基因型
中华实验和临床病毒学杂志000404 【摘要】 目的 至今为止，汉城病毒间核苷酸序列的同源性均在95%以上，而氨基酸序列显示出更高的保守性。本研究对一株分离于褐家鼠的汉城病毒Gou3株的M、S片段进行了部分核苷酸序列测定，观察其与已知汉城病毒的差异。方法 采用逆转录-PCR方法对Gou3病毒进行了扩增鉴定，并对其部分M和S基因组片段进行了碱基序列测定。结果 表明Gou3与其他SEO病毒有不同的PCR扩增特点。序列测定也显示其是一个差异较大的汉城病毒株，与其它汉城型病毒的同源性却只有85%左右。但由其推导出的Gou3的部分糖蛋白的氨基酸序列与其他汉城型病毒相比却高度保守。系统发生树分析表明Gou3是介乎于汉城病毒与汉滩病毒之间，但其亲缘关系较近于已知汉城病毒。结论 Gou3病毒为汉城病毒，是属于汉城病毒一个新亚型。
, 百拇医药
Discovery of a new subtype of SEO virus
WANG Hua, KUMIKO Yoshimatsu, ZHANG Quanfu
(Institute of Virology,Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052,China)
【Abstract】 Objective The M and S segments of Gou3,a Hantavirus strain isolated from Rattus norvegieus were partially reverse transcripted, PCR amplified and sequenced with ABI 373 DNA sequencer to observe the differences from other SEO type viruses. Methods RT-PCR was used to amplify M and S segments of Gou3 strain, and then the nucleotide (nt) sequences of the segments were analysed. Phylogenetic tree analysis was also performed. Results The different property through PCR amplification and partial nucleotide sequence data showed that Gou3 was a Hantavirus of SEO type with significance difference from the other SEO type viruses. The nt sequence homology between Gou3 and the other SEO type viruses was only about 85%, but the deduced amino acid (aa) sequence of partial glycoprotein was highly conservative, at least as same as that among the other SEO type viruses. Sequence analysis also showed that nt or aa sequence homology between Gou3, or other SEO type, and HTN type viruses was nearly the same, while the phylogenetic tree analysis showed that Gou3 was a virus which was between HTN and the other SEO type viruses but closer to the latter.Conclusion Gou3 is a SEO virus but belongs to a new subtype.
, 百拇医药
【Key words】 Hantavirus; Base sequence; Genotype
汉坦病毒属布尼雅病毒科，感染人类可引起肾综合征出血热或汉坦病毒肺综合征。汉坦病毒为分节段负链RNA病毒，其基因组由S，M和L三个片段组成，分别编码病毒的核衣壳蛋白，膜糖蛋白G1，G2和RNA依赖的RNA多聚酶〔1〕。现已发现汉坦病毒至少有12个血清型。不同的血清型的汉坦病毒有不同的原始宿主动物。其对人的致病性及其他生物学特性也各不相同。近年研究还发现，不同血清亚型的汉坦病毒其原始宿主动物也有其特殊的基因型〔2〕。已有SEO型汉坦病毒核苷酸序列资料显示该型病毒最为保守，其核苷酸序列的同源性基本在95%以上，病毒蛋白的氨基酸序列显示出更高的保守性，尚未发现较大差异的SEO型病毒[3-5]。本研究对一株分离于褐家鼠的汉坦病毒毒株进行了部分核苷酸序列测定，结果表明它是一株与常见SEO病毒差异较大的SEO型病毒。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 毒株 Gou3株病毒，1984年分离自浙江省的褐家鼠。SR11分离自日本褐家鼠。L99株分离自江西的罗赛鼠。这两株为SEO病毒。Chen株分离自安徽肾综合征出血热(HFRS)病人，为HTN型病毒。Vero E6细胞培养传代，病毒接种7～10 d左右后，收获感染细胞用于病毒的RNA提取。
1.2 引物 研究中使用引物及其特性见表1。M基因组片段的逆转录使用引物为HG2F0，PCR使用引物为：SEO-MF和SEO-MR。S基因组片段的逆转录使用引物为P14，PCR使用引物为STF和GS6。M基因组片段部分序列的测定使用引物SEO-MR。S基因组片段部分序列的测定使用引物GS6。
1.3 病毒RNA提取方法 病毒感染细胞总RNA的提取使用试剂盒(ISOGEN)。步骤如下：胰酶消化病毒感染细胞单层(T75或T25细胞培养瓶)，PBS洗涤细胞沉块，然后加入1 ml裂解液，混匀后室温放置5 min。加入200 μl氯仿，充分混匀后室温放置3 min。4℃，15 000 r/min离心15 min。取水相加等量异丙醇沉淀10 min。离心后沉淀用80%乙醇洗涤。然后于室温下干燥沉淀。最后每管加入20～50 μl DEPC处理的去离子水溶解所提取的RNA。
, 百拇医药
1.4 逆转录-PCR(RT-PCR)及PCR片段回收方法 逆转录使用GIBco BRL的SuperscripTM Ⅱ逆转录酶，引物使用浓度为10 pmol/20 μl，RNA模板使用5 μ。取2～5 μl上述逆转录产物进行PCR扩增(反应体积为50～100 μl)，使用PE公司的Ampli Taq GoldTM酶。产物的检测使用1%的琼脂糖凝胶。扩增片段的回收使用公司的WizardTM PCR Preps DNA片段回收系统。
表1 研究中使用的引物
Tab.1 Primers used in the study 引物Primer
序列
Sequence
位置
, 百拇医药
Location
意义与片段
Segment sense
P14
TAGTAGTAGACTCC
1-14
L M S(+)
HG2FO
AAGAAGACTGTCACT
CCTCAAA
1844-1865
M(+)
, 百拇医药
SEO-MF
GTGGACTCTTCTTCT
CATTATT
1936-1957
M(+)
SEO-MR
TGGGCAATCTGGGGG
GTTGCATG
2331-2353
M(-)
GS6
AGCTCIGGATCCATI
, 百拇医药
TCATC
1234-1253
S(-)
STF
TAGTAGTAGACTCCC
TAAAGA
1-21
S(+)
1.5 核苷酸序列的测定及分析方法 使用ABI373 DNA序列自动测序进行序列测定。测序试剂盒为PE公司的ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit with AmpliTaq DNA Polymerase,FS.序列分析使用WINSTAR软件包。其他已知序列来源于EMBL。
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2 结果
2.1 PCR扩增结果
2.1.1 部分M片段的扩增 SEO-MF、MR为作者自行设计的SEO型汉坦病毒型特异性引物，对SEO型汉坦病毒具有广泛的适用性。HG2FO为对SEO和HTN型汉坦病毒均保守的组特异性引物。扩增表明：两对照毒株扩增出对应相对分子质量的特异片段(约418 bp)，而Gou3扩增片段较大。扩增条带相对较弱，相对分子质量约在500 bp(图1)。分析可能是逆转录的HG2FO与SEO-MR扩增之产物。其后的序列测定结果证实了这种分析。
2.1.2 部分S片段的扩增 STF为根据汉坦病毒S基因组末端保守区设计的引物，GS6也是对SEO和HTN两型病毒均反应的组特异性引物。Gou3、L99及SR11均扩增出相应相对分子质量的特异片段(约1 253 bp，见图2)。
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1～6泳道分别为阴性对照、SR11、L99、Gou3、Chen和标准
相对分子质量(1 kb ladder)
图1 部分S基因组片段的RT-PCR扩增
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products of S segments
1-6：Negative control,SR11,L99,Gou3,Chen and
DNA marker(1 kb ladder) respectively
2.2 序列测定与分析
2.2.1 Gou3部分S，M基因组片段与其他汉坦病毒的核苷酸序列比较 上述Gou3扩增片段经回收纯化后进行序列测定，S片段获得351 bp(882-1 232 bp，相对于SR11，S基因组片段cDNA而言)的序列；M片段获得300 bp(2 003～2 302 bp，相对于76-118株，M其因组片段cDNA而言)的序列。其S，M片段的部分核苷酸序列及其所推导出的氨基酸序列与其他已知汉坦病毒株序列的比较分别见图3，4及表2，3。
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图2 部分M基因片段的RT-PCR扩增
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products of M segments
1-5：DNA marker(100 bp ladder),negative control,SR11,L99 and Gou3 respectively
表2 Gou3与其他毒株部分S基因组片段核苷酸序列及
所推导的氨基酸序列的同源性(%)
Tab.2 Homology(%) of partial nt and aa sequences of
S segment of Gou3 and other strains
, 百拇医药
R22
Seoul
SR11
76-118
Gou3
R22
95.4
98.3
79.2
88.0
Seoul
95.7
96.6
, 百拇医药
76.1
85.6
SR11
99.1
96.5
78.3
87.7
76-118
86.2
81.7
85.3
76.6
Gou3
, 百拇医药
97.4
94.8
98.3
86.2
注：空白对角线上为核苷酸序列比较，下为氨基酸序列比较
Note:Upper triangle:homology of nt sequence.Lower triangle：homology of aa sequence表3 Gou3与其他毒株部分M基因组片段核苷酸序列及
所推导的氨基酸序列的同源性(%)
Tab.3 Homology(%) of partial nt and aa sequences of
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M segment of Gou3 and other strains
R22
L99
Seoul
SR11
A9
76-118
Gou3
R22
99.3
94.3
95.0
, 百拇医药
67.0
69.7
84.3
L99
99.0
95.0
95.0
67.3
69.7
85.0
Seoul
98.0
99.0
, 百拇医药
96.0
68.3
70.0
85.0
SR11
98.0
99.0
98.0
68.0
72.0
84.7
A9
78.8
, http://www.100md.com
79.8
78.8
78.8
88.0
70.3
76-118
79.8
80.8
79.0
79.8
97.0
73.0
Gou3
, 百拇医药
99.0
100.0
99.0
99.0
79.8
80.0
注：空白对角线上为核苷酸序列比较，下为氨基酸序列比较
Note:Upper triangle:homology of nt sequence.Lower triangle:homology of aa sequence
可见，与其他SEO和HTN型汉坦病毒比较，Gou3的氨基酸序列的保守性大于其核苷酸序列的保守性。从核苷酸序列上讲，Gou3与HTN型汉坦病毒的同源性小于其它SEO型病毒的同源性。而Gou3与HTN型病毒的同源性却比其它SEO型病毒与HTN型病毒的同源性高。另一个十分有趣的现象是，从核苷酸序列推导出的Gou3的部分糖蛋白的氨基酸序列与其它SEO型病毒的氨基酸序列相比极为保守(99.0%～100.0%)，基本与其它SEO型病毒间糖蛋白的同源性相同；与76-118相比，该株核蛋白的同源性比糖蛋白要高。
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图3 Gou3与其他毒株部分S基因组片段核苷酸序列比较
Fig.3 Alignments of partial S segment sequence of Gou3 and that of other strains
图4 Gou3与其他毒株部分M基因组片段核苷酸序列比较
Fig.4 Alignments of partial M segment sequence of Gou3 and that of other strains
2.2.2 系统发生树分析 基于上述图1，2的序列，构建了汉坦病毒的种系发生树(图5，6)。可见两图具有相类似的形状。Gou3与其它SEO型病毒的亲缘关系较近，与HTN型病毒的亲缘关系相对较远。提示Gou3是介于两型病毒之间的与SEO型病毒较近的一个种系演化分支。
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图5 基于部分S基因组片段核苷酸序列构建的种系发生树
Fig.5 Phylogenetic tree based on partial S segment sequence
图6 基于部分M基因组片段核苷酸序列构建的种系发生树
Fig.6 Phylogenetic tree based on partial M segment sequence
3 讨论
汉坦病毒有着极为复杂的进化过程。一般来讲该病毒是与其宿主动物共演化的，不同血清型甚或不同血清亚型的病毒各有其特定的原始宿主动物〔2〕。病毒的进化可来源于病毒基因组的点突变，病毒基因组间的重排或重组。无论是从RT-PCR扩增的结果，还是从病毒部分基因组核苷酸序列测定的结果来看，Gou3是一株变化较大的SEO型汉坦病毒株，它与其他SEO型汉坦病毒的核苷酸序列的差异(15%左右)远大于其他SEO型汉坦病毒间的差异(5%左右)。在国际上首次将SEO型汉坦病毒间的核苷酸序列的差异提高了近十个百分点。这也提示，SEO型汉坦病毒的进化并非象人们所想象的那么简单。Gou3的部分M基因组片段的核苷酸序列与其他病毒间的同源性与其部分S基因组片段的核苷酸序列与其他病毒间的同源性相差不大，提示该病毒的S、M基因组是未经重排情况下共演化至今的。
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尽管Gou3部分M基因组片段在核苷酸序列水平上与其他SEO型汉坦病毒的差异远大于其他SEO型汉坦病毒的差异。可其所推导的糖蛋白的氨基酸序列却高度保守，其同源性基本与其他SEO型病毒间的同源性相同。从Gou3株的核苷酸序列及其所推导出的氨基酸序列的同源性和构建的种系发生树来看，它是介乎于HTN和SEO型间的汉坦病毒。这提示若在病毒的繁殖滴度许可的情况下，其可成为一株抗原谱较广的良好的疫苗生产候选株。
该病毒是否对人类致病，病毒对组织培养及实验动物的感染增殖特点，病毒的免疫原性及免疫反应，病毒在自然界存在的宿主范围及病毒核苷酸序列的较高程度的差异与糖蛋白氨基酸序列的高度保守性的原因和机制等一系列的生物学问题均有待于进一步深入研究。
本文受国家自然科学基金资助(39670649)
参 考 文 献
1，管永军，陈钧，邵一鸣，等.云南瑞丽人免疫缺陷病毒感染者gp120基因C2-V3区的序列测定和亚型分析.中华实验和临床病毒学杂志，1997，11：8-12.
, 百拇医药
2，侯云德.动物病毒载体与基因治疗的现状和前景.现代分子病毒学选论.北京：科学出版社，1994，9-17.
3，Manning WC,Paliard X,Zhou SZ,et al.Genetic immunization with adeno-associated virus vectors expressing herpes simplex virus type 2 glycoproteins B and D.J Virol,1997,71：7960-7962.
4，Xiao X,Li J,Richard JS,et al.Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol,1998,72：2224-2232.
5，Xiao X,Li J, Richard JS,et al.Efficient long-term gene transfer into muscle tissue of immunocompetent mice by adeno-associated virus vector.J Virol,1996,70：8098-8108.
(收稿日期：2000-02-14), http://www.100md.com
单位：王华 张全福 霍子威 杭长寿(中国预防医学科学院病毒学研究所出血热及虫媒病毒研究室 北京 100052)张明(正阳县人民医院传染科)；吉松组子 有川二郎(日本北海道大学医学部)
关键词：汉坦病毒；碱基序列；基因型
中华实验和临床病毒学杂志000404 【摘要】 目的 至今为止，汉城病毒间核苷酸序列的同源性均在95%以上，而氨基酸序列显示出更高的保守性。本研究对一株分离于褐家鼠的汉城病毒Gou3株的M、S片段进行了部分核苷酸序列测定，观察其与已知汉城病毒的差异。方法 采用逆转录-PCR方法对Gou3病毒进行了扩增鉴定，并对其部分M和S基因组片段进行了碱基序列测定。结果 表明Gou3与其他SEO病毒有不同的PCR扩增特点。序列测定也显示其是一个差异较大的汉城病毒株，与其它汉城型病毒的同源性却只有85%左右。但由其推导出的Gou3的部分糖蛋白的氨基酸序列与其他汉城型病毒相比却高度保守。系统发生树分析表明Gou3是介乎于汉城病毒与汉滩病毒之间，但其亲缘关系较近于已知汉城病毒。结论 Gou3病毒为汉城病毒，是属于汉城病毒一个新亚型。
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Discovery of a new subtype of SEO virus
WANG Hua, KUMIKO Yoshimatsu, ZHANG Quanfu
(Institute of Virology,Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052,China)
【Abstract】 Objective The M and S segments of Gou3,a Hantavirus strain isolated from Rattus norvegieus were partially reverse transcripted, PCR amplified and sequenced with ABI 373 DNA sequencer to observe the differences from other SEO type viruses. Methods RT-PCR was used to amplify M and S segments of Gou3 strain, and then the nucleotide (nt) sequences of the segments were analysed. Phylogenetic tree analysis was also performed. Results The different property through PCR amplification and partial nucleotide sequence data showed that Gou3 was a Hantavirus of SEO type with significance difference from the other SEO type viruses. The nt sequence homology between Gou3 and the other SEO type viruses was only about 85%, but the deduced amino acid (aa) sequence of partial glycoprotein was highly conservative, at least as same as that among the other SEO type viruses. Sequence analysis also showed that nt or aa sequence homology between Gou3, or other SEO type, and HTN type viruses was nearly the same, while the phylogenetic tree analysis showed that Gou3 was a virus which was between HTN and the other SEO type viruses but closer to the latter.Conclusion Gou3 is a SEO virus but belongs to a new subtype.
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【Key words】 Hantavirus; Base sequence; Genotype
汉坦病毒属布尼雅病毒科，感染人类可引起肾综合征出血热或汉坦病毒肺综合征。汉坦病毒为分节段负链RNA病毒，其基因组由S，M和L三个片段组成，分别编码病毒的核衣壳蛋白，膜糖蛋白G1，G2和RNA依赖的RNA多聚酶〔1〕。现已发现汉坦病毒至少有12个血清型。不同的血清型的汉坦病毒有不同的原始宿主动物。其对人的致病性及其他生物学特性也各不相同。近年研究还发现，不同血清亚型的汉坦病毒其原始宿主动物也有其特殊的基因型〔2〕。已有SEO型汉坦病毒核苷酸序列资料显示该型病毒最为保守，其核苷酸序列的同源性基本在95%以上，病毒蛋白的氨基酸序列显示出更高的保守性，尚未发现较大差异的SEO型病毒[3-5]。本研究对一株分离于褐家鼠的汉坦病毒毒株进行了部分核苷酸序列测定，结果表明它是一株与常见SEO病毒差异较大的SEO型病毒。
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1 材料和方法
1.1 毒株 Gou3株病毒，1984年分离自浙江省的褐家鼠。SR11分离自日本褐家鼠。L99株分离自江西的罗赛鼠。这两株为SEO病毒。Chen株分离自安徽肾综合征出血热(HFRS)病人，为HTN型病毒。Vero E6细胞培养传代，病毒接种7～10 d左右后，收获感染细胞用于病毒的RNA提取。
1.2 引物 研究中使用引物及其特性见表1。M基因组片段的逆转录使用引物为HG2F0，PCR使用引物为：SEO-MF和SEO-MR。S基因组片段的逆转录使用引物为P14，PCR使用引物为STF和GS6。M基因组片段部分序列的测定使用引物SEO-MR。S基因组片段部分序列的测定使用引物GS6。
1.3 病毒RNA提取方法 病毒感染细胞总RNA的提取使用试剂盒(ISOGEN)。步骤如下：胰酶消化病毒感染细胞单层(T75或T25细胞培养瓶)，PBS洗涤细胞沉块，然后加入1 ml裂解液，混匀后室温放置5 min。加入200 μl氯仿，充分混匀后室温放置3 min。4℃，15 000 r/min离心15 min。取水相加等量异丙醇沉淀10 min。离心后沉淀用80%乙醇洗涤。然后于室温下干燥沉淀。最后每管加入20～50 μl DEPC处理的去离子水溶解所提取的RNA。
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1.4 逆转录-PCR(RT-PCR)及PCR片段回收方法 逆转录使用GIBco BRL的SuperscripTM Ⅱ逆转录酶，引物使用浓度为10 pmol/20 μl，RNA模板使用5 μ。取2～5 μl上述逆转录产物进行PCR扩增(反应体积为50～100 μl)，使用PE公司的Ampli Taq GoldTM酶。产物的检测使用1%的琼脂糖凝胶。扩增片段的回收使用公司的WizardTM PCR Preps DNA片段回收系统。
表1 研究中使用的引物
Tab.1 Primers used in the study 引物Primer
序列
Sequence
位置
, 百拇医药
Location
意义与片段
Segment sense
P14
TAGTAGTAGACTCC
1-14
L M S(+)
HG2FO
AAGAAGACTGTCACT
CCTCAAA
1844-1865
M(+)
, 百拇医药
SEO-MF
GTGGACTCTTCTTCT
CATTATT
1936-1957
M(+)
SEO-MR
TGGGCAATCTGGGGG
GTTGCATG
2331-2353
M(-)
GS6
AGCTCIGGATCCATI
, 百拇医药
TCATC
1234-1253
S(-)
STF
TAGTAGTAGACTCCC
TAAAGA
1-21
S(+)
1.5 核苷酸序列的测定及分析方法 使用ABI373 DNA序列自动测序进行序列测定。测序试剂盒为PE公司的ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit with AmpliTaq DNA Polymerase,FS.序列分析使用WINSTAR软件包。其他已知序列来源于EMBL。
, 百拇医药
2 结果
2.1 PCR扩增结果
2.1.1 部分M片段的扩增 SEO-MF、MR为作者自行设计的SEO型汉坦病毒型特异性引物，对SEO型汉坦病毒具有广泛的适用性。HG2FO为对SEO和HTN型汉坦病毒均保守的组特异性引物。扩增表明：两对照毒株扩增出对应相对分子质量的特异片段(约418 bp)，而Gou3扩增片段较大。扩增条带相对较弱，相对分子质量约在500 bp(图1)。分析可能是逆转录的HG2FO与SEO-MR扩增之产物。其后的序列测定结果证实了这种分析。
2.1.2 部分S片段的扩增 STF为根据汉坦病毒S基因组末端保守区设计的引物，GS6也是对SEO和HTN两型病毒均反应的组特异性引物。Gou3、L99及SR11均扩增出相应相对分子质量的特异片段(约1 253 bp，见图2)。
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1～6泳道分别为阴性对照、SR11、L99、Gou3、Chen和标准
相对分子质量(1 kb ladder)
图1 部分S基因组片段的RT-PCR扩增
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products of S segments
1-6：Negative control,SR11,L99,Gou3,Chen and
DNA marker(1 kb ladder) respectively
2.2 序列测定与分析
2.2.1 Gou3部分S，M基因组片段与其他汉坦病毒的核苷酸序列比较 上述Gou3扩增片段经回收纯化后进行序列测定，S片段获得351 bp(882-1 232 bp，相对于SR11，S基因组片段cDNA而言)的序列；M片段获得300 bp(2 003～2 302 bp，相对于76-118株，M其因组片段cDNA而言)的序列。其S，M片段的部分核苷酸序列及其所推导出的氨基酸序列与其他已知汉坦病毒株序列的比较分别见图3，4及表2，3。
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图2 部分M基因片段的RT-PCR扩增
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products of M segments
1-5：DNA marker(100 bp ladder),negative control,SR11,L99 and Gou3 respectively
表2 Gou3与其他毒株部分S基因组片段核苷酸序列及
所推导的氨基酸序列的同源性(%)
Tab.2 Homology(%) of partial nt and aa sequences of
S segment of Gou3 and other strains
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R22
Seoul
SR11
76-118
Gou3
R22
95.4
98.3
79.2
88.0
Seoul
95.7
96.6
, 百拇医药
76.1
85.6
SR11
99.1
96.5
78.3
87.7
76-118
86.2
81.7
85.3
76.6
Gou3
, 百拇医药
97.4
94.8
98.3
86.2
注：空白对角线上为核苷酸序列比较，下为氨基酸序列比较
Note:Upper triangle:homology of nt sequence.Lower triangle：homology of aa sequence表3 Gou3与其他毒株部分M基因组片段核苷酸序列及
所推导的氨基酸序列的同源性(%)
Tab.3 Homology(%) of partial nt and aa sequences of
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M segment of Gou3 and other strains
R22
L99
Seoul
SR11
A9
76-118
Gou3
R22
99.3
94.3
95.0
, 百拇医药
67.0
69.7
84.3
L99
99.0
95.0
95.0
67.3
69.7
85.0
Seoul
98.0
99.0
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96.0
68.3
70.0
85.0
SR11
98.0
99.0
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68.0
72.0
84.7
A9
78.8
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79.8
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88.0
70.3
76-118
79.8
80.8
79.0
79.8
97.0
73.0
Gou3
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99.0
100.0
99.0
99.0
79.8
80.0
注：空白对角线上为核苷酸序列比较，下为氨基酸序列比较
Note:Upper triangle:homology of nt sequence.Lower triangle:homology of aa sequence
可见，与其他SEO和HTN型汉坦病毒比较，Gou3的氨基酸序列的保守性大于其核苷酸序列的保守性。从核苷酸序列上讲，Gou3与HTN型汉坦病毒的同源性小于其它SEO型病毒的同源性。而Gou3与HTN型病毒的同源性却比其它SEO型病毒与HTN型病毒的同源性高。另一个十分有趣的现象是，从核苷酸序列推导出的Gou3的部分糖蛋白的氨基酸序列与其它SEO型病毒的氨基酸序列相比极为保守(99.0%～100.0%)，基本与其它SEO型病毒间糖蛋白的同源性相同；与76-118相比，该株核蛋白的同源性比糖蛋白要高。
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图3 Gou3与其他毒株部分S基因组片段核苷酸序列比较
Fig.3 Alignments of partial S segment sequence of Gou3 and that of other strains
图4 Gou3与其他毒株部分M基因组片段核苷酸序列比较
Fig.4 Alignments of partial M segment sequence of Gou3 and that of other strains
2.2.2 系统发生树分析 基于上述图1，2的序列，构建了汉坦病毒的种系发生树(图5，6)。可见两图具有相类似的形状。Gou3与其它SEO型病毒的亲缘关系较近，与HTN型病毒的亲缘关系相对较远。提示Gou3是介于两型病毒之间的与SEO型病毒较近的一个种系演化分支。
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图5 基于部分S基因组片段核苷酸序列构建的种系发生树
Fig.5 Phylogenetic tree based on partial S segment sequence
图6 基于部分M基因组片段核苷酸序列构建的种系发生树
Fig.6 Phylogenetic tree based on partial M segment sequence
3 讨论
汉坦病毒有着极为复杂的进化过程。一般来讲该病毒是与其宿主动物共演化的，不同血清型甚或不同血清亚型的病毒各有其特定的原始宿主动物〔2〕。病毒的进化可来源于病毒基因组的点突变，病毒基因组间的重排或重组。无论是从RT-PCR扩增的结果，还是从病毒部分基因组核苷酸序列测定的结果来看，Gou3是一株变化较大的SEO型汉坦病毒株，它与其他SEO型汉坦病毒的核苷酸序列的差异(15%左右)远大于其他SEO型汉坦病毒间的差异(5%左右)。在国际上首次将SEO型汉坦病毒间的核苷酸序列的差异提高了近十个百分点。这也提示，SEO型汉坦病毒的进化并非象人们所想象的那么简单。Gou3的部分M基因组片段的核苷酸序列与其他病毒间的同源性与其部分S基因组片段的核苷酸序列与其他病毒间的同源性相差不大，提示该病毒的S、M基因组是未经重排情况下共演化至今的。
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尽管Gou3部分M基因组片段在核苷酸序列水平上与其他SEO型汉坦病毒的差异远大于其他SEO型汉坦病毒的差异。可其所推导的糖蛋白的氨基酸序列却高度保守，其同源性基本与其他SEO型病毒间的同源性相同。从Gou3株的核苷酸序列及其所推导出的氨基酸序列的同源性和构建的种系发生树来看，它是介乎于HTN和SEO型间的汉坦病毒。这提示若在病毒的繁殖滴度许可的情况下，其可成为一株抗原谱较广的良好的疫苗生产候选株。
该病毒是否对人类致病，病毒对组织培养及实验动物的感染增殖特点，病毒的免疫原性及免疫反应，病毒在自然界存在的宿主范围及病毒核苷酸序列的较高程度的差异与糖蛋白氨基酸序列的高度保守性的原因和机制等一系列的生物学问题均有待于进一步深入研究。
本文受国家自然科学基金资助(39670649)
参 考 文 献
1，管永军，陈钧，邵一鸣，等.云南瑞丽人免疫缺陷病毒感染者gp120基因C2-V3区的序列测定和亚型分析.中华实验和临床病毒学杂志，1997，11：8-12.
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3，Manning WC,Paliard X,Zhou SZ,et al.Genetic immunization with adeno-associated virus vectors expressing herpes simplex virus type 2 glycoproteins B and D.J Virol,1997,71：7960-7962.
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5，Xiao X,Li J, Richard JS,et al.Efficient long-term gene transfer into muscle tissue of immunocompetent mice by adeno-associated virus vector.J Virol,1996,70：8098-8108.
(收稿日期：2000-02-14), http://www.100md.com