微小病毒B19的巢式聚合酶链反应检测
作者：王晓明 张国成 韩美玉 许东亮 汪萍
单位：第四军医大学西京医院儿科 西安 710032
关键词：
中华实验和临床病毒学杂志000429 人微小病毒B19(Human parvovirus B19，简称B19)属微小病毒属，是目前动物病毒中体积最小和结构最简单的一类单链线状DNA病毒〔1〕，自1974年被Cossart发现以来，至今已证实该病毒与传染性红斑、一过性再障、胎儿水肿、死胎和关节炎等多种人类疾病有关〔2〕。新近有B19感染与心肌炎，心肌病，川畸病等心肌受累的报道。我们就巢式聚合酶链反应(PCR)对微小病毒B19 DNA的检测技术的建立及对29例先天性心脏病心脏组织、30例非先天畸形尸解的心脏组织进行B19 DNA的检测结果报告如下。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 标本来源 1977～1996年第四军医大学病理解剖教研室尸解保存的29例先天性心脏病心脏标本，其中以石蜡包块取材26例，4%甲醛固定组织取材3例；病例组死亡年龄最小1 d，最大18岁，平均3.8岁；病种有房间隔缺损5例，室间隔缺损13例，法乐氏四联症5例，法乐氏五联症1例，肺动脉导管未闭2例，右心室双出口1例，肺动脉狭窄并房缺1例，室缺并主动脉关闭不全1例。30例对照组为同期非先天畸形患儿心脏组织，死亡年龄最小1 d，最大14岁，平均年龄1.2岁；病种有新生儿窒息10例，新生儿硬肿症5例，呼吸窘迫综合症2例，肺炎合并心衰12例，风湿性心脏病1例。
1.2 试剂 病毒DNA来源于沙特皇家医院研究中心(KFSH Research Center)，经提纯后含量为70 μg/ml。巢式PCR特异性内外引物的设计参照文献〔3〕，由上海生物工程研究所合成，其碱基序列及对应于B19 DNA的核苷酸位置见表1。Taq DNA聚合酶、4×dNTPs、10×PCR缓冲液和琼脂糖系Promega公司产品。蛋白酶K系Merck公司产品。PGEM Marker系华美生物工程公司产品。
, 百拇医药
1.3 DNA提取 石蜡标本按常规脱蜡，脱脂(固定标本剪碎组织、研磨成浆)，裂解消化，酚、氯仿异戊醇抽提，无水乙醇沉淀，TE液溶解，低温保存(-20℃)待检。
1.4 B19 DNA的巢式PCR扩增 方法同文献〔3〕，50 μl反应体系中双蒸水36 μl，10×PCR缓冲液5 μl，10 mmol/L 4×dNTPs 1 μl,Taq酶1 U，外引物1 S、2A各300 ng，模板5 μl(阳性对照1 μl，阴性对照以双蒸水作模)，混匀后用石蜡油30 μl覆盖。PCR循环条件为：93℃ 1 min,55℃ 1 min, 72℃ 1 min,35个周期后72℃充分延伸10 min。取第1次扩增产物5 μl为模板，以内引物3S和4A代替外引物，同上述反应体系及条件进行第2次PCR循环。
1.5 特异性试验 用本法更换模板DNA为猫细小病毒，腺病毒3、7型，呼吸道合胞病毒，巨细胞病毒和单纯疱疹病毒，进行巢式PCR检测。
, 百拇医药
1.6 结果观察 取第2次PCR循环产物10 μl于2 μl溴酚蓝混合，加样于含溴化乙锭(EB)的2%琼脂糖凝胶中电泳30 min，紫外分析仪上观察，104 bp处出现红色电泳带者为阳性。
2 结果
2.1 巢式PCR的特异性 将猫细小病毒，腺病毒3、7型，呼吸道合胞病毒，巨细胞病毒和单纯疱疹病毒同时用本法作巢式PCR检测，结果只有B19 DNA在104 bp处出现红色阳性电泳带，其余各病毒均为阴性，特异性检测结果见图1。
图1 巢式PCR特异性
Fig.1 The specificity of nested-PCR
1：PGEM-3ZF HaeⅢ marker. 2:Parvovirus
, http://www.100md.com
B19 DNA. 3:Cat parvovirus. 4: HSV.
5:Adv3.6:Adv7. 7:RSV. 8:CMV.
9:Negative control
将内外引物浓度提高1倍，于第2次扩增产物中电泳出现了4条红色条带，与巢式PCR两对引物理论上可能出现的4条带分子量相一致，即：1S、2A产物为1 112 bp，3S、4A产物为104 bp，1S、4A产物为386 bp，3S、2A产物为830 bp。见图2。
2.2 标本B19 DNA的检测结果 病例组29例中5例B19 DNA阳性(17.2%)，对照组所有标本30例均阴性，经美国CDC提供Epinfo Version 5.0统计软包处理，采用Fisher′s确切概率检验，P值为0.023 7，两组间差异有显著意义。见表2。
, 百拇医药
表1 引物的碱基序列及对应的核苷酸位置
Tab.1 Primer sequence and location 引物
Primer
序列
Sequence
碱基位置
Location
产物片段
Size of the
produced fragment
1S
, http://www.100md.com
5′-CTTTAGGTATAGCCAACTGG-3′
2905-2924
2A
5′-ACACTGAGTTTACTAGTGGC-3′
4016-3997
1112 bp
3S
5′-CAAAAGCATGTGGAGTGAGG-3′
3187-3206
4A
5′-CCTTATAATGGTGCTCTGGG-3′
, http://www.100md.com
3290-3271
104 bp
图2 巢式PCR第2次扩增产物
电泳结果
Fig.2 Electrophoresis of 2nd time
nested PCR
1：Negative control. 2:pGEM-3ZF-Hae Ⅲ
marker. 3:Positive control,2nd time
nested PCR amplified product. 4:Positive
, http://www.100md.com
specimens,2nd time nested PCR amplification
product. 5:Positive control,1st time nested
PCR amplification product. 6:Positive
specimens,1st time nested PCR amplified
product. 7-9:Negative specimens
3 讨论
血清免疫学抗原抗体检测是最常用的病毒学检测方法，包括ELISA、RIA和CIE等，尤以ELISA具有简便、快速、特异性强等特点，在实验及临床中受到了广泛的应用。能够替代B19抗原的病毒体外培养系统尚未建成，因此限制了B19病毒血清学实验的开展及普及，而敏感性高、特异性好的巢式PCR检测技术，成为B19 DNA检测的主要手段〔4〕。
, 百拇医药
表2 B19 DNA PCR检测结果
Tab.2 Results of B19 DNA detection by nested PCR 组别
Group
B19 DNA阳性
B19 DNA
positive
B19 DNA阴性
B19 DNA
negative
病例组
Cases
, http://www.100md.com
5
24
对照组
Control
0
30
合 计
Total
5
54
巢式PCR将目的靶片段两次扩增，大大地增加了病原基因检测的敏感度，特别是内引物相当于一对探针，使其特异性有了很大的提高，从本实验结果看完全符合基因序列扩增理论，当引物浓度增大时，理论上第2次扩增产物，除内引物片段外，还将出现内、外引物重新组合的两个新片段及外引物产物片段，相当于对外引物产物1 112 bp进行酶切图谱分析，进一步证实了本法的特异性。我们用巢式PCR技术检测了29例先心病心脏组织及同期30例非先天畸形心脏组织中B19 DNA，结果在先心病中阳检率为17.2%，与对照组比较，两组差异有显著性(P＝0.023 7)，说明B19病毒对先心病患儿心脏感染率更高，提示B19病毒感染可能与先心病发病有关，尽管该结果目前尚不能肯定B19病毒的宫内感染为先心病的发病的重要因子之一，但却为我们进行先心病的病因研究提供了实验依据。
, http://www.100md.com
国家计划生育委员会资助课题(9736)
参 考 文 献
1，Deiss V,Tratschin JD,Weitz M,et al.Cloning of the human parvovirus B19 genome and structural analysis of its palindromic termini.Virology,1990,175：247-254.
2，Brown KE,Young NS. Parvovirus B19 in human disease. Annu Rev Med,1997,48：59-67.
3，Musiani M,Azzi A,Zerbini M,et al.Nested polymerase chain reaction assay for the detection of B19 parvovirus DNA in human immunodeficiency virus patients. J Med Virol,1993,40：157-160.
4，Heegaard ED,Hormsleth A. Parvovirus:the expanding spectrum of disease. Acta Paediatr,1995,84：109-117.
(收稿日期：1999-11-21), 百拇医药
单位：第四军医大学西京医院儿科 西安 710032
关键词：
中华实验和临床病毒学杂志000429 人微小病毒B19(Human parvovirus B19，简称B19)属微小病毒属，是目前动物病毒中体积最小和结构最简单的一类单链线状DNA病毒〔1〕，自1974年被Cossart发现以来，至今已证实该病毒与传染性红斑、一过性再障、胎儿水肿、死胎和关节炎等多种人类疾病有关〔2〕。新近有B19感染与心肌炎，心肌病，川畸病等心肌受累的报道。我们就巢式聚合酶链反应(PCR)对微小病毒B19 DNA的检测技术的建立及对29例先天性心脏病心脏组织、30例非先天畸形尸解的心脏组织进行B19 DNA的检测结果报告如下。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 标本来源 1977～1996年第四军医大学病理解剖教研室尸解保存的29例先天性心脏病心脏标本，其中以石蜡包块取材26例，4%甲醛固定组织取材3例；病例组死亡年龄最小1 d，最大18岁，平均3.8岁；病种有房间隔缺损5例，室间隔缺损13例，法乐氏四联症5例，法乐氏五联症1例，肺动脉导管未闭2例，右心室双出口1例，肺动脉狭窄并房缺1例，室缺并主动脉关闭不全1例。30例对照组为同期非先天畸形患儿心脏组织，死亡年龄最小1 d，最大14岁，平均年龄1.2岁；病种有新生儿窒息10例，新生儿硬肿症5例，呼吸窘迫综合症2例，肺炎合并心衰12例，风湿性心脏病1例。
1.2 试剂 病毒DNA来源于沙特皇家医院研究中心(KFSH Research Center)，经提纯后含量为70 μg/ml。巢式PCR特异性内外引物的设计参照文献〔3〕，由上海生物工程研究所合成，其碱基序列及对应于B19 DNA的核苷酸位置见表1。Taq DNA聚合酶、4×dNTPs、10×PCR缓冲液和琼脂糖系Promega公司产品。蛋白酶K系Merck公司产品。PGEM Marker系华美生物工程公司产品。
, 百拇医药
1.3 DNA提取 石蜡标本按常规脱蜡，脱脂(固定标本剪碎组织、研磨成浆)，裂解消化，酚、氯仿异戊醇抽提，无水乙醇沉淀，TE液溶解，低温保存(-20℃)待检。
1.4 B19 DNA的巢式PCR扩增 方法同文献〔3〕，50 μl反应体系中双蒸水36 μl，10×PCR缓冲液5 μl，10 mmol/L 4×dNTPs 1 μl,Taq酶1 U，外引物1 S、2A各300 ng，模板5 μl(阳性对照1 μl，阴性对照以双蒸水作模)，混匀后用石蜡油30 μl覆盖。PCR循环条件为：93℃ 1 min,55℃ 1 min, 72℃ 1 min,35个周期后72℃充分延伸10 min。取第1次扩增产物5 μl为模板，以内引物3S和4A代替外引物，同上述反应体系及条件进行第2次PCR循环。
1.5 特异性试验 用本法更换模板DNA为猫细小病毒，腺病毒3、7型，呼吸道合胞病毒，巨细胞病毒和单纯疱疹病毒，进行巢式PCR检测。
, 百拇医药
1.6 结果观察 取第2次PCR循环产物10 μl于2 μl溴酚蓝混合，加样于含溴化乙锭(EB)的2%琼脂糖凝胶中电泳30 min，紫外分析仪上观察，104 bp处出现红色电泳带者为阳性。
2 结果
2.1 巢式PCR的特异性 将猫细小病毒，腺病毒3、7型，呼吸道合胞病毒，巨细胞病毒和单纯疱疹病毒同时用本法作巢式PCR检测，结果只有B19 DNA在104 bp处出现红色阳性电泳带，其余各病毒均为阴性，特异性检测结果见图1。
图1 巢式PCR特异性
Fig.1 The specificity of nested-PCR
1：PGEM-3ZF HaeⅢ marker. 2:Parvovirus
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B19 DNA. 3:Cat parvovirus. 4: HSV.
5:Adv3.6:Adv7. 7:RSV. 8:CMV.
9:Negative control
将内外引物浓度提高1倍，于第2次扩增产物中电泳出现了4条红色条带，与巢式PCR两对引物理论上可能出现的4条带分子量相一致，即：1S、2A产物为1 112 bp，3S、4A产物为104 bp，1S、4A产物为386 bp，3S、2A产物为830 bp。见图2。
2.2 标本B19 DNA的检测结果 病例组29例中5例B19 DNA阳性(17.2%)，对照组所有标本30例均阴性，经美国CDC提供Epinfo Version 5.0统计软包处理，采用Fisher′s确切概率检验，P值为0.023 7，两组间差异有显著意义。见表2。
, 百拇医药
表1 引物的碱基序列及对应的核苷酸位置
Tab.1 Primer sequence and location 引物
Primer
序列
Sequence
碱基位置
Location
产物片段
Size of the
produced fragment
1S
, http://www.100md.com
5′-CTTTAGGTATAGCCAACTGG-3′
2905-2924
2A
5′-ACACTGAGTTTACTAGTGGC-3′
4016-3997
1112 bp
3S
5′-CAAAAGCATGTGGAGTGAGG-3′
3187-3206
4A
5′-CCTTATAATGGTGCTCTGGG-3′
, http://www.100md.com
3290-3271
104 bp
图2 巢式PCR第2次扩增产物
电泳结果
Fig.2 Electrophoresis of 2nd time
nested PCR
1：Negative control. 2:pGEM-3ZF-Hae Ⅲ
marker. 3:Positive control,2nd time
nested PCR amplified product. 4:Positive
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specimens,2nd time nested PCR amplification
product. 5:Positive control,1st time nested
PCR amplification product. 6:Positive
specimens,1st time nested PCR amplified
product. 7-9:Negative specimens
3 讨论
血清免疫学抗原抗体检测是最常用的病毒学检测方法，包括ELISA、RIA和CIE等，尤以ELISA具有简便、快速、特异性强等特点，在实验及临床中受到了广泛的应用。能够替代B19抗原的病毒体外培养系统尚未建成，因此限制了B19病毒血清学实验的开展及普及，而敏感性高、特异性好的巢式PCR检测技术，成为B19 DNA检测的主要手段〔4〕。
, 百拇医药
表2 B19 DNA PCR检测结果
Tab.2 Results of B19 DNA detection by nested PCR 组别
Group
B19 DNA阳性
B19 DNA
positive
B19 DNA阴性
B19 DNA
negative
病例组
Cases
, http://www.100md.com
5
24
对照组
Control
0
30
合 计
Total
5
54
巢式PCR将目的靶片段两次扩增，大大地增加了病原基因检测的敏感度，特别是内引物相当于一对探针，使其特异性有了很大的提高，从本实验结果看完全符合基因序列扩增理论，当引物浓度增大时，理论上第2次扩增产物，除内引物片段外，还将出现内、外引物重新组合的两个新片段及外引物产物片段，相当于对外引物产物1 112 bp进行酶切图谱分析，进一步证实了本法的特异性。我们用巢式PCR技术检测了29例先心病心脏组织及同期30例非先天畸形心脏组织中B19 DNA，结果在先心病中阳检率为17.2%，与对照组比较，两组差异有显著性(P＝0.023 7)，说明B19病毒对先心病患儿心脏感染率更高，提示B19病毒感染可能与先心病发病有关，尽管该结果目前尚不能肯定B19病毒的宫内感染为先心病的发病的重要因子之一，但却为我们进行先心病的病因研究提供了实验依据。
, http://www.100md.com
国家计划生育委员会资助课题(9736)
参 考 文 献
1，Deiss V,Tratschin JD,Weitz M,et al.Cloning of the human parvovirus B19 genome and structural analysis of its palindromic termini.Virology,1990,175：247-254.
2，Brown KE,Young NS. Parvovirus B19 in human disease. Annu Rev Med,1997,48：59-67.
3，Musiani M,Azzi A,Zerbini M,et al.Nested polymerase chain reaction assay for the detection of B19 parvovirus DNA in human immunodeficiency virus patients. J Med Virol,1993,40：157-160.
4，Heegaard ED,Hormsleth A. Parvovirus:the expanding spectrum of disease. Acta Paediatr,1995,84：109-117.
(收稿日期：1999-11-21), 百拇医药