庚型肝炎病毒基因型分析
作者：赵和平 张玲荣 张金叶 庄辉
单位：赵和平 张玲荣 张金叶(山西医科大学附属第一医院传染科 太原 030001)；庄辉(北京医科大学微生物教研室)
关键词：
中华实验和临床病毒学杂志000425 庚型肝炎病毒5′非编码区(5′-UTR)的基因序列是整个基因组中最为保守的区段。Muerhoff等〔1〕根据该片段的基因序列将HGV分为1，2和3型。该三种基因型呈明显的地理分布。1型为GBV-C型，多见于非洲；2型为HGV型，多分布于南美洲和欧洲；3型主要见于日本和我国。我们对从太原市1名急性非甲～非戊型肝炎病人血清中分离的1株HGV 5′-UTR部分基因序列进行了测定，并与国内外已报告的26株HGV基因序列做了比较及种系发生分析(Phylogenetic analysis)。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 病人血清标本来源 采自太原市一名急性非甲～非戊型肝炎患者(SX6)血清。
1.2 种系发生分析 我国部分地区HGV分离株共17株，其中3株来自柳州市献血员和非甲～非戊型肝炎病人(LZ1，LZ2和LZ3)；3株从北京市献血员和慢性非甲～非戊型肝炎病人中分离(BJ1，BJ2和BJ3)；1株来自南昌市急性乙型肝炎病人(NC)；1株从广州市肝细胞癌病人分离(GZ)；1株来自太原市非甲～非戊型肝炎病人(SX)；另8株分别从哈尔滨市(HRB1)，长春市(CC)，石家庄市(SJZ1，SJZ2和SJZ3)，南京市(NJ)，合肥市(HF)和乌鲁木齐市献血员(XJ)中分离〔2-4〕。
1.3 HGV RNA的检测 选择HGV 5′-UTR保守区段，根据引物设计原则设计引物。外引物为：OP1 5′-AGG TGG TGG ATG GGT GAT-3′，OP2 5′-TGC CAC CCG CCC TCA CCC GAA-3′；内引物为：IP1 5′-TGG TAG GTC GTA AAT CCC GGT-3′，IP2 5′-TGC CAC CCG CCC TCA CCC GAA-3′。扩增片段长约350 bp。
, http://www.100md.com
1.4 PCR产物的克隆及测序 PCR产物用2%的低熔点琼脂糖凝胶分离目的条带，切下目的带，用DNA快速纯化试剂盒进行纯化，然后连接至pGEM T easy载体并转化至DH5 α大肠埃希菌；挑选阳性克隆，鉴定重组质粒。最后，用AB1 Prime 377自动测序仪分别用T7和SP6引物从两端同时测序，以检验测序的可靠性。
1.5 序列同源性及基因进化树分析 序列排列采用MULTIALN软件程序，同源性分析采用BLASTA程序处理。基因进化树的建立采用统计学参数bootstrap值分析，并经TREEVIEW程序处理。
2 结果
2.1 HGV RNA的检测结果 RT-nPCR第2轮扩增后，最终产物的片段大小为350 bp，用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，在350 bp位置上有一条明显条带者为阳性结果。
2.2 同一病人不同克隆的核苷酸序列变异情况 随机挑取5个阳性克隆进行序列测定，其核苷酸序列差异仅为0～4个，5个克隆的核苷酸序列的同源性为99.1%～100%。说明测序结果可靠。
, http://www.100md.com
2.3 HGV 5′-UTR部分核苷酸序列的同源性分析 从该例病人(SX6)血清中分离的HGV 5′-UTR部分核苷酸序列比较，该株HGV序列以核苷酸替换为主，多处存在插入(第147、155、164、204、243、266位核苷酸序列相对恒定)，2个位点存在缺失(第397和第451位核苷酸)。除部分区域的核苷酸高度变异外，大部分核酸序列相对恒定，特别是中国株之间的序列更为保守，而各株的第115～138位核苷酸和第365～388位核苷酸均无变异。该株HGV与1型(U36380)、2型(U44402)和3型(D90601)的核苷酸序列同源性分别为89.2%、89.2%和95.6%(表1)。
表1 HGV 5′-UTR核苷酸序列同源性(%)比较
Tab.1 Identity of HGV 5′-UTR
sequence among strains
, 百拇医药
SX6
GBV-C
HGV
3#
SX6
100.0
89.2
89.2
95.6
GBV-C
89.2
100.0
87.2
, http://www.100md.com
87.8
HGV
89.2
87.2
100.0
88.1
3#
95.6
87.8
88.1
100.0
2.4 HGV 5′-UTR核苷酸序列的种系发生关系分析 根据Muerhoff报道的基因分型，选择1型中1a、1b亚型，2型中2a、2b亚型及3型的代表株，综合我国已报道的部分地区HGV 5′-UTR核苷酸序列及太原株(SX6)序列，应用分子进化学方法，获得基因进化距离值，建立基因进化树，以分析HGV的基因型。对5′-UTR的第115位至第378位核苷酸(核苷酸位置以U36380为标准)区域进行分析，根据统计学数据bootstrap值建立了相应的基因进化树，可将1a、1b、2a、2b及3型明显分开，表明选择的分型区域有意义。进化树显示，太原株HGV与其他中国株HGV一样属基因3型。见图1。
, 百拇医药
3 讨论
对不同HGV分离株的序列进行分析是非常重要的，因为不同变异株的血清学反应性、致病性、毒力及对治疗的应答可能不同。本研究结果表明，来源于同一病人的HGV分离株的5个克隆，其序列同源性为99.1%～100%。Viazov等〔5〕对同一例慢性肝炎病人的HGV NS 5B区5个阳性克隆测序表明，HGV变异较小。因此，随机挑选一个阳性克隆进行测序，可反映该病人的HGV基因型。山西太原株HGV(SX6)与1型(U36380)、2型(U44402)和3(D90601)的同源性分别为89.2%、89.2%和95.6%。经种系发生分析，属于3型。虽然Bootstrap值不支持将中国株进一步分成不同的亚型，但从种系发生可以看出，中国株HGV可能还可分成不同的亚组。
图1 中国株HGV基因进化树分析
, 百拇医药
Fig.1 Evolutionary tree of HGV of Chinese strains
1-18:Chinese strains. 19-22:Japanese strains. 23-25:USA strains.
26:European strain. 27:West African strain
参 考 文 献
1，Muerhoff AS，Simons JN,Leary TP,et al. Sequence heterogeneity within the 5′-terminal region of the hepatitis GB virus C genome and evidence for genotypes.J Hepatol,1996,25：379-384.
, 百拇医药
2，汪兴太，庄辉，李河民，等.中国株庚型肝炎病毒C(GBV-C)部分核酸序列测定和分析.中国公共卫生学报，1996，15：195-196.
3，王佑春，庄辉，孙彬裕，等.我国部分地区庚型肝炎病毒5′端部分基因序列的比较.中国公共卫生学报，1997，13：586-587.
4，周育森，王海涛.庚型肝炎病毒(HGV)非结构区部分基因的克隆和cDNA序列测定.中国病毒学杂志，1997，1：57-60.
5，Viazov S,Riffelmann Y，Khoudyakov H,et al.Genetic heterogeneity of hepatitis G virus isolates from different parts of the world. J Gen Virol,1997,78：577.
(收稿日期：2000-03-24)
, http://www.100md.com
单位：赵和平 张玲荣 张金叶(山西医科大学附属第一医院传染科 太原 030001)；庄辉(北京医科大学微生物教研室)
关键词：
中华实验和临床病毒学杂志000425 庚型肝炎病毒5′非编码区(5′-UTR)的基因序列是整个基因组中最为保守的区段。Muerhoff等〔1〕根据该片段的基因序列将HGV分为1，2和3型。该三种基因型呈明显的地理分布。1型为GBV-C型，多见于非洲；2型为HGV型，多分布于南美洲和欧洲；3型主要见于日本和我国。我们对从太原市1名急性非甲～非戊型肝炎病人血清中分离的1株HGV 5′-UTR部分基因序列进行了测定，并与国内外已报告的26株HGV基因序列做了比较及种系发生分析(Phylogenetic analysis)。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 病人血清标本来源 采自太原市一名急性非甲～非戊型肝炎患者(SX6)血清。
1.2 种系发生分析 我国部分地区HGV分离株共17株，其中3株来自柳州市献血员和非甲～非戊型肝炎病人(LZ1，LZ2和LZ3)；3株从北京市献血员和慢性非甲～非戊型肝炎病人中分离(BJ1，BJ2和BJ3)；1株来自南昌市急性乙型肝炎病人(NC)；1株从广州市肝细胞癌病人分离(GZ)；1株来自太原市非甲～非戊型肝炎病人(SX)；另8株分别从哈尔滨市(HRB1)，长春市(CC)，石家庄市(SJZ1，SJZ2和SJZ3)，南京市(NJ)，合肥市(HF)和乌鲁木齐市献血员(XJ)中分离〔2-4〕。
1.3 HGV RNA的检测 选择HGV 5′-UTR保守区段，根据引物设计原则设计引物。外引物为：OP1 5′-AGG TGG TGG ATG GGT GAT-3′，OP2 5′-TGC CAC CCG CCC TCA CCC GAA-3′；内引物为：IP1 5′-TGG TAG GTC GTA AAT CCC GGT-3′，IP2 5′-TGC CAC CCG CCC TCA CCC GAA-3′。扩增片段长约350 bp。
, http://www.100md.com
1.4 PCR产物的克隆及测序 PCR产物用2%的低熔点琼脂糖凝胶分离目的条带，切下目的带，用DNA快速纯化试剂盒进行纯化，然后连接至pGEM T easy载体并转化至DH5 α大肠埃希菌；挑选阳性克隆，鉴定重组质粒。最后，用AB1 Prime 377自动测序仪分别用T7和SP6引物从两端同时测序，以检验测序的可靠性。
1.5 序列同源性及基因进化树分析 序列排列采用MULTIALN软件程序，同源性分析采用BLASTA程序处理。基因进化树的建立采用统计学参数bootstrap值分析，并经TREEVIEW程序处理。
2 结果
2.1 HGV RNA的检测结果 RT-nPCR第2轮扩增后，最终产物的片段大小为350 bp，用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，在350 bp位置上有一条明显条带者为阳性结果。
2.2 同一病人不同克隆的核苷酸序列变异情况 随机挑取5个阳性克隆进行序列测定，其核苷酸序列差异仅为0～4个，5个克隆的核苷酸序列的同源性为99.1%～100%。说明测序结果可靠。
, http://www.100md.com
2.3 HGV 5′-UTR部分核苷酸序列的同源性分析 从该例病人(SX6)血清中分离的HGV 5′-UTR部分核苷酸序列比较，该株HGV序列以核苷酸替换为主，多处存在插入(第147、155、164、204、243、266位核苷酸序列相对恒定)，2个位点存在缺失(第397和第451位核苷酸)。除部分区域的核苷酸高度变异外，大部分核酸序列相对恒定，特别是中国株之间的序列更为保守，而各株的第115～138位核苷酸和第365～388位核苷酸均无变异。该株HGV与1型(U36380)、2型(U44402)和3型(D90601)的核苷酸序列同源性分别为89.2%、89.2%和95.6%(表1)。
表1 HGV 5′-UTR核苷酸序列同源性(%)比较
Tab.1 Identity of HGV 5′-UTR
sequence among strains
, 百拇医药
SX6
GBV-C
HGV
3#
SX6
100.0
89.2
89.2
95.6
GBV-C
89.2
100.0
87.2
, http://www.100md.com
87.8
HGV
89.2
87.2
100.0
88.1
3#
95.6
87.8
88.1
100.0
2.4 HGV 5′-UTR核苷酸序列的种系发生关系分析 根据Muerhoff报道的基因分型，选择1型中1a、1b亚型，2型中2a、2b亚型及3型的代表株，综合我国已报道的部分地区HGV 5′-UTR核苷酸序列及太原株(SX6)序列，应用分子进化学方法，获得基因进化距离值，建立基因进化树，以分析HGV的基因型。对5′-UTR的第115位至第378位核苷酸(核苷酸位置以U36380为标准)区域进行分析，根据统计学数据bootstrap值建立了相应的基因进化树，可将1a、1b、2a、2b及3型明显分开，表明选择的分型区域有意义。进化树显示，太原株HGV与其他中国株HGV一样属基因3型。见图1。
, 百拇医药
3 讨论
对不同HGV分离株的序列进行分析是非常重要的，因为不同变异株的血清学反应性、致病性、毒力及对治疗的应答可能不同。本研究结果表明，来源于同一病人的HGV分离株的5个克隆，其序列同源性为99.1%～100%。Viazov等〔5〕对同一例慢性肝炎病人的HGV NS 5B区5个阳性克隆测序表明，HGV变异较小。因此，随机挑选一个阳性克隆进行测序，可反映该病人的HGV基因型。山西太原株HGV(SX6)与1型(U36380)、2型(U44402)和3(D90601)的同源性分别为89.2%、89.2%和95.6%。经种系发生分析，属于3型。虽然Bootstrap值不支持将中国株进一步分成不同的亚型，但从种系发生可以看出，中国株HGV可能还可分成不同的亚组。
图1 中国株HGV基因进化树分析
, 百拇医药
Fig.1 Evolutionary tree of HGV of Chinese strains
1-18:Chinese strains. 19-22:Japanese strains. 23-25:USA strains.
26:European strain. 27:West African strain
参 考 文 献
1，Muerhoff AS，Simons JN,Leary TP,et al. Sequence heterogeneity within the 5′-terminal region of the hepatitis GB virus C genome and evidence for genotypes.J Hepatol,1996,25：379-384.
, 百拇医药
2，汪兴太，庄辉，李河民，等.中国株庚型肝炎病毒C(GBV-C)部分核酸序列测定和分析.中国公共卫生学报，1996，15：195-196.
3，王佑春，庄辉，孙彬裕，等.我国部分地区庚型肝炎病毒5′端部分基因序列的比较.中国公共卫生学报，1997，13：586-587.
4，周育森，王海涛.庚型肝炎病毒(HGV)非结构区部分基因的克隆和cDNA序列测定.中国病毒学杂志，1997，1：57-60.
5，Viazov S,Riffelmann Y，Khoudyakov H,et al.Genetic heterogeneity of hepatitis G virus isolates from different parts of the world. J Gen Virol,1997,78：577.
(收稿日期：2000-03-24)
, http://www.100md.com