免疫斑点法检测特异性EBV潜伏膜蛋白2合成肽的细胞毒T淋巴细胞
作者：周玲 姚家伟 陈志坚 周微雅 李德锐 A.Rickinon 曾毅
单位：周玲 姚家伟 曾毅(中国预防医学科学院病毒学研究所肿瘤研究室 北京 100052)；陈志坚 李德锐(汕头大学医学院肿瘤研究所检验科)；周微雅(广西壮族自治区人民医院检验科)；A.Rickinson(英国伯明翰大学肿瘤研究所)
关键词：
中华实验和临床病毒学杂志000424 Epstein-Barr(EB)病毒是人传染性单核细胞增多症(IM)的病原，是鼻咽癌(NPC)的病因之一〔1〕，近年来又发现与众多癌症有关如胃癌、肺癌、胸腺癌等，因此研究EBV感染后的机体免疫，特别是细胞免疫的特点，已倍受关注。人体的免疫反应具有抗肿瘤作用，它通过细胞免疫机制能破坏机体内的肿瘤细胞，其中细胞毒T细胞(CTL)是最重要的免疫监视细胞。CTL主是是MHC Ⅰ类分子限制性的CD8+T细胞，它通过T细胞受体(TCR)识别靶细胞Ⅰ类MHC分子沟槽结构中的抗原多肽(8-10个氨基酸)，即靶细胞通过MHC Ⅰ类分子将内源性抗原加工呈递给CTL前体〔2〕。因此，用合成肽替代自然多肽诱导CTL产生是可行的。MHC Ⅰ类基因产物主要指HLA-A、B、C抗原。已被检出的众多的HLA抗原在不同人种、甚至不同地区的人群中的分布存在着很大的差别。我国汉族人以HLA-A2、B46，HLA-A11、B40和HLA-A2、B40单体型最常见。根据有效的抗原性多肽必需满足的条件，我们又按照已确定了多种受HLA限制的潜伏膜蛋白2(LMP2)CTL表位，合成在中国南方人群中很常见的HLA-A2段短肽，应用免疫斑点法(Elispot)，检测了我国37例正常人与NPC病人的特异性EBV-LMP2的CTL。
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1 材料和方法
1.1 标本收集 采集我国广东汕头、广西南宁和北京地区37例外周血标本，其中NPC病人17例，正常人18例，肠癌、肺癌各1例。获得新鲜的单核淋巴细胞。
1.2 多肽设计 参照EBV-LMP2多肽库的序列，由英国伯明翰大学Rickinson教授实验室合成〔3〕。EBV-LMP2肽CTL的表位序列见表1。
1.3 检测方法 用Elispot检测人群中T淋巴细胞针对EBV-LMP2(A2.01、A2.03、A2.06)肽的特异性杀伤作用。Elispot试验盒由英国伯明翰大学Rickinson教授赠送。包被人γ干扰素(IFN-γ)单抗4℃过夜或37℃ 3 h，加新分离的单核淋巴细胞与不同的肽，37℃过夜。当特定肽与淋巴细胞中的特异的HLA分子稳定结合后，刺激细胞表达IFN-γ抗原与包被板上的IFN-γ单抗结合。第2天经洗板后加抗IFN-γ抗体，加酶标记抗体后，染色，干燥，在显微镜下阳性细胞计数，每份标本检测时设对照孔；阳性孔，淋巴细胞加植物血凝素(PHA)；阴性孔，淋巴细胞加1640。结果判定：阳性细胞数大于阴性孔阳性细胞数2倍，实验成立；阳性细胞数大于50个以上、阳性细胞数大于阴性孔阳性细胞数2倍以上判为阳性。
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2 结果
37例标本中特异性EBV-LMP2肽的CTL检测结果见表2。CLG，LLW，FLY(A2.01)，LLS(A2.03)，LTA(A2.06)全部强阳性的16例中，3例NPC病人，13例正常人；多肽LLW、FLY、LLS、LTA或FLY、LLS、LTA阳性的7例中，3例NPC病人，4例正常人；全部阴性的14例中，NPC病人占11例，正常人1例，其他癌病人2例。
表1 EBV-LMP2肽CTL表位序列
Tab.1 Sequence of CTL response to EBV-LMP2 peptide EBV-LMP2(A2)肽名
Peptide name of EBV-LMP2
氨基酸产物位置
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Location of amino acid residues
HLA限制
HLA restriction
肽序列
Peptide sequence
CLG
426-434
A*0201
CLGGLITMV
LLW
329-337
, http://www.100md.com A*0201
LLWTLVVLL
FLY
356-364
A*0201
FLYALALLL
LLS
447-455
A*203
LLSAWILTA
LTA
453-461
, 百拇医药 A*206
LTAGFLIFL
表2 特异性EBV-LMP2肽的CTL
Tab.2 CTL of specific EBV-LMP2 peptide 分项
Type
鼻咽癌病人(例)
Case of NPC
其他癌病人(例)
Other cancer patients
正常人(例)
Normal individuals
, http://www.100md.com
合计(例)
Total
全部肽阳性
All peptides positive
3
-
13
16
部分肽阳性
Partial peptides positive
3
-
, http://www.100md.com
4
7
全部肽阴性
All peptides negative
11
2
1
14
合 计
Total
17
2
18
, 百拇医药
37
3 讨论
目前已知，几乎所有的肿瘤患者均有免疫功能异常，EBV相关恶性肿瘤患者的细胞免疫也是低下的。杨成勇等〔4〕建立了检测EBV-LMP1特异性CTL功能的方法，发现NPC患者外周血中LMP1特异性的细胞免疫功能显著低于正常人群。我们的实验也得到同样的结果。EBV LMP2多肽全部强阳性的16例中，3例为NPC病人，13例为正常人，多肽全部阴性的14例中11例为NPC病人，1例正常人。
最近的研究又表明EBV-LMP2是治疗EBV相关肿瘤的良好靶抗原。美国Rooney教授等〔5〕利用逆转录和单纯疱疹病毒作载体，将EBV-LMP2导入树突状细胞并表达，以它作刺激细胞激发何杰金氏病患者体内的特异性CTL，发现15名患者中有11名在第一或第二次治疗中产生了自身的EBV特异的CTL。
, 百拇医药
我们的工作初步了解特异性EBV-LMP2肽在NPC病人与正常人中的状况，为进一步将开展的用LMP2肽或LMP2重组病毒病苗，进行NPC免疫治疗以及预防和防止NPC复发转移等重要工作，提供了重要依据。
本课题受国家九七三项目资助(G1998051201)
参 考 文 献
1 Kieff E,Liebowitz D.Epstein-Barr virus and its replication. In:Fields BN,Knipe DM，et al eds. Vriology,2nd ed,New York:Raven Press,1990：1889-1920.
2 陈永良，何球藻.合成多肽诱导细胞毒T淋巴细胞产生.国外医学免疫学分册，1995，5：228-232.
, 百拇医药
3 Redehenko LV,Rickinson AB. Accessing Epstein-Barr virus specific T-cell memory with peptide-loaded dendritic cells.J Virol,1999,73：334-342.
4 杨成勇，沈倍奋，曾毅.鼻咽癌患者EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)的特异性细胞免疫研究.病毒学报，1999，15：193-198.
5 Rooney CM,Roskyow MA,Suzuki N.Treatment of relapsed Hodgkin′s disease using EBV-specific cytotoxic T cells.Ann Oncol,1998,9(Suppl 5):S129-132.
(收稿日期：2000-06-13), http://www.100md.com
单位：周玲 姚家伟 曾毅(中国预防医学科学院病毒学研究所肿瘤研究室 北京 100052)；陈志坚 李德锐(汕头大学医学院肿瘤研究所检验科)；周微雅(广西壮族自治区人民医院检验科)；A.Rickinson(英国伯明翰大学肿瘤研究所)
关键词：
中华实验和临床病毒学杂志000424 Epstein-Barr(EB)病毒是人传染性单核细胞增多症(IM)的病原，是鼻咽癌(NPC)的病因之一〔1〕，近年来又发现与众多癌症有关如胃癌、肺癌、胸腺癌等，因此研究EBV感染后的机体免疫，特别是细胞免疫的特点，已倍受关注。人体的免疫反应具有抗肿瘤作用，它通过细胞免疫机制能破坏机体内的肿瘤细胞，其中细胞毒T细胞(CTL)是最重要的免疫监视细胞。CTL主是是MHC Ⅰ类分子限制性的CD8+T细胞，它通过T细胞受体(TCR)识别靶细胞Ⅰ类MHC分子沟槽结构中的抗原多肽(8-10个氨基酸)，即靶细胞通过MHC Ⅰ类分子将内源性抗原加工呈递给CTL前体〔2〕。因此，用合成肽替代自然多肽诱导CTL产生是可行的。MHC Ⅰ类基因产物主要指HLA-A、B、C抗原。已被检出的众多的HLA抗原在不同人种、甚至不同地区的人群中的分布存在着很大的差别。我国汉族人以HLA-A2、B46，HLA-A11、B40和HLA-A2、B40单体型最常见。根据有效的抗原性多肽必需满足的条件，我们又按照已确定了多种受HLA限制的潜伏膜蛋白2(LMP2)CTL表位，合成在中国南方人群中很常见的HLA-A2段短肽，应用免疫斑点法(Elispot)，检测了我国37例正常人与NPC病人的特异性EBV-LMP2的CTL。
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1 材料和方法
1.1 标本收集 采集我国广东汕头、广西南宁和北京地区37例外周血标本，其中NPC病人17例，正常人18例，肠癌、肺癌各1例。获得新鲜的单核淋巴细胞。
1.2 多肽设计 参照EBV-LMP2多肽库的序列，由英国伯明翰大学Rickinson教授实验室合成〔3〕。EBV-LMP2肽CTL的表位序列见表1。
1.3 检测方法 用Elispot检测人群中T淋巴细胞针对EBV-LMP2(A2.01、A2.03、A2.06)肽的特异性杀伤作用。Elispot试验盒由英国伯明翰大学Rickinson教授赠送。包被人γ干扰素(IFN-γ)单抗4℃过夜或37℃ 3 h，加新分离的单核淋巴细胞与不同的肽，37℃过夜。当特定肽与淋巴细胞中的特异的HLA分子稳定结合后，刺激细胞表达IFN-γ抗原与包被板上的IFN-γ单抗结合。第2天经洗板后加抗IFN-γ抗体，加酶标记抗体后，染色，干燥，在显微镜下阳性细胞计数，每份标本检测时设对照孔；阳性孔，淋巴细胞加植物血凝素(PHA)；阴性孔，淋巴细胞加1640。结果判定：阳性细胞数大于阴性孔阳性细胞数2倍，实验成立；阳性细胞数大于50个以上、阳性细胞数大于阴性孔阳性细胞数2倍以上判为阳性。
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2 结果
37例标本中特异性EBV-LMP2肽的CTL检测结果见表2。CLG，LLW，FLY(A2.01)，LLS(A2.03)，LTA(A2.06)全部强阳性的16例中，3例NPC病人，13例正常人；多肽LLW、FLY、LLS、LTA或FLY、LLS、LTA阳性的7例中，3例NPC病人，4例正常人；全部阴性的14例中，NPC病人占11例，正常人1例，其他癌病人2例。
表1 EBV-LMP2肽CTL表位序列
Tab.1 Sequence of CTL response to EBV-LMP2 peptide EBV-LMP2(A2)肽名
Peptide name of EBV-LMP2
氨基酸产物位置
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Location of amino acid residues
HLA限制
HLA restriction
肽序列
Peptide sequence
CLG
426-434
A*0201
CLGGLITMV
LLW
329-337
, http://www.100md.com A*0201
LLWTLVVLL
FLY
356-364
A*0201
FLYALALLL
LLS
447-455
A*203
LLSAWILTA
LTA
453-461
, 百拇医药 A*206
LTAGFLIFL
表2 特异性EBV-LMP2肽的CTL
Tab.2 CTL of specific EBV-LMP2 peptide 分项
Type
鼻咽癌病人(例)
Case of NPC
其他癌病人(例)
Other cancer patients
正常人(例)
Normal individuals
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合计(例)
Total
全部肽阳性
All peptides positive
3
-
13
16
部分肽阳性
Partial peptides positive
3
-
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4
7
全部肽阴性
All peptides negative
11
2
1
14
合 计
Total
17
2
18
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37
3 讨论
目前已知，几乎所有的肿瘤患者均有免疫功能异常，EBV相关恶性肿瘤患者的细胞免疫也是低下的。杨成勇等〔4〕建立了检测EBV-LMP1特异性CTL功能的方法，发现NPC患者外周血中LMP1特异性的细胞免疫功能显著低于正常人群。我们的实验也得到同样的结果。EBV LMP2多肽全部强阳性的16例中，3例为NPC病人，13例为正常人，多肽全部阴性的14例中11例为NPC病人，1例正常人。
最近的研究又表明EBV-LMP2是治疗EBV相关肿瘤的良好靶抗原。美国Rooney教授等〔5〕利用逆转录和单纯疱疹病毒作载体，将EBV-LMP2导入树突状细胞并表达，以它作刺激细胞激发何杰金氏病患者体内的特异性CTL，发现15名患者中有11名在第一或第二次治疗中产生了自身的EBV特异的CTL。
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我们的工作初步了解特异性EBV-LMP2肽在NPC病人与正常人中的状况，为进一步将开展的用LMP2肽或LMP2重组病毒病苗，进行NPC免疫治疗以及预防和防止NPC复发转移等重要工作，提供了重要依据。
本课题受国家九七三项目资助(G1998051201)
参 考 文 献
1 Kieff E,Liebowitz D.Epstein-Barr virus and its replication. In:Fields BN,Knipe DM，et al eds. Vriology,2nd ed,New York:Raven Press,1990：1889-1920.
2 陈永良，何球藻.合成多肽诱导细胞毒T淋巴细胞产生.国外医学免疫学分册，1995，5：228-232.
, 百拇医药
3 Redehenko LV,Rickinson AB. Accessing Epstein-Barr virus specific T-cell memory with peptide-loaded dendritic cells.J Virol,1999,73：334-342.
4 杨成勇，沈倍奋，曾毅.鼻咽癌患者EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)的特异性细胞免疫研究.病毒学报，1999，15：193-198.
5 Rooney CM,Roskyow MA,Suzuki N.Treatment of relapsed Hodgkin′s disease using EBV-specific cytotoxic T cells.Ann Oncol,1998,9(Suppl 5):S129-132.
(收稿日期：2000-06-13), http://www.100md.com