放射联合淋巴细胞对腺样囊性癌的抗瘤效应
作者：蔡以理 邱蔚六 何荣根 王中和 周晓健
单位：蔡以理(200011 上海第二医科大学口腔医学院口腔颌面外科)；邱蔚六(200011 上海第二医科大学口腔医学院口腔颌面外科)；何荣根(200011 上海第二医科大学口腔医学院口腔颌面外科)；王中和(200011 上海第二医科大学口腔医学院口腔颌面外科)；周晓健(200011 上海第二医科大学口腔医学院口腔颌面外科)
关键词：淋巴细胞；癌；腺样囊性
中华口腔医学杂志000401 【摘要】 目的 探索放射联合肿瘤引流区淋巴结淋巴细胞(tumor draining lymph node lymphocyte, DNL)对肿瘤细胞的作用。方法 取首次治疗病理证实的口腔癌患者颈清扫淋巴结，经常规消化、分离，加白细胞介素2(interleukin-2, IL-2)培养，获取激活的淋巴细胞作为效应细胞，以效靶比(E∶T)25∶1进行集落形成试验,观察对人涎腺腺样囊性癌肺高转移细胞株(adenoid cystic carcinoma, ACC-M)的抗瘤效应，并分别以不同剂量60钴γ射线对ACC-M照射后，随即加入DNL细胞,观察放射结合DNL对ACC-M的抗瘤效应。结果 ACC-M为放射中度敏感细胞。根据线性——二次数学模型(LQ模型)，其α、β值分别为0.342 0，0.078 3。DNL对ACC-M的抑瘤率为49.06% 。放射联合DNL作用时,α值提高到0.768 8；Dq、S2分别从1.590 1、0.448 1降至0.599 5、0.113 5，这3个参数与放射组相比，差异均有显著性(P<0.05)。在高剂量区，与放射组比，放射联合淋巴细胞组的D0. 01和6 Gy、8 Gy剂量点的细胞存活率均明显下降，P<0.01。结论 体外来源于不同病理类型口腔癌的IL-2激活的DNL对ACC-M有明显的抗瘤效应，无论在低剂量还是高剂量区与放射结合都有显著的协同抗瘤效应。
, 百拇医药
Antitumor effect of radiation combined with tumor draining lymphocytes on human ACC-M cell in vitro
CAI Yili，QIU Weiliu，HE Ronggen
(Department of Oral Maxillofacial Surgery， School of Stomatology ，Shanghai Second Medical University ，Shanghai 200011，China)
【Abstract】 Objective To find whether there is any synergistic effect of radiation combined with interleukin-2(IL-2) activated tumor draining lymph nodes lymphocyts (DNL) from oral-carcinoma patients on high-lung metastatic salivary adenoid cystic carcinoma cell line(ACC-M). Methods Colony - forming test was used to investigate antitumor effect and analyzed using linear-quadratic(LQ) equation and single hit multi targets equation. Results The ratio of effect to targets was 25∶1.The cytotoxiclty of DNL was 49.06%.Radiation combined with DNL showed higher antitumor activity compared with radiation alone,α value, Dq and S2 were 0.768 8 and 0.342 0;1.590 1 and 0.599 5; 0.448 1 and 0.113 5 respectively(P<0.05). Conclusions It indicates that in initial region of survival curve, DNL significantly increased sublethal damage on ACC-M.
, 百拇医药
【Key words】 Lymphocytes ; Carcinoma,adenoid cystic
白细胞介素2(interleukin-2, IL-2)激活的肿瘤引流区淋巴结淋巴细胞(tumor draining lymph node lymphocyte，DNL)已被证实是与肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TIL)具有相似抗瘤效应的淋巴细胞[1，2]。 Robert等[3]曾报道TIL辅以小剂量放射时，小鼠实验性肺转移明显减少。我们用人涎腺腺样囊性癌肺高转移株(adenoid cystic carcinoma, ACC-M)[4]为研究对象，以激活的人口腔癌DNL作效应细胞，观察其对ACC-M的抗瘤效应及放射联合DNL的抗瘤效应。
材料与方法
1.细胞：
, http://www.100md.com
(1)靶细胞 ：ACC-M人涎腺腺样囊性癌肺高转移株(上海第二医科大学口腔医学院口腔颌面外科实验室提供)。
(2)效应细胞：取自1995年5月至1996年2月上海第二医科大学口腔医学院口腔颌面外科收治的6例口腔癌住院患者，均经病理证实为原发性口腔恶性肿瘤，其中鳞癌4例，基底细胞癌1 例，恶性淋巴上皮病1例。术前均未行放、化疗。
2. 效应细胞制备:见参考文献[5]。
3.照射条件:60钴γ射线，剂量率为(70.9～63.2)cGy/min，室温照射。
4.实验设计:实验前用ACC-M 1×108/L细胞接种在50 ml培养瓶中，于含15%小牛血清的RPMI 1640培养液(含青霉素10×105 U/L，链霉素1 mg/L)中,在37 ℃、5%CO2培养箱内培养约40 h。实验时将处于指数生长期的细胞分成对照组和各处理组。
, http://www.100md.com
(1)空白对照组(C): 将ACC-M细胞常规消化，调整细胞浓度至1×109/L，接种一定数量细胞于25 ml培养瓶内。
(2)单纯放射组(R): 将ACC-M单细胞悬液分别经0.5、2、4、6、8 Gy单次照射后，接种于25 ml培养瓶中。
(3)DNL组(D):以效靶比(E∶T)25∶1，将处于抗瘤活性高峰期(培养7～25 d)的DNL和指数生长期ACC-M细胞接种于25 ml培养瓶。
(4)放射结合DNL组(R+D):将不同剂量照射过的ACC-M细胞按R组相应放射剂量组同样数量接种于培养瓶后，以E∶T=25∶1加入DNL细胞。
以上各组实验每个剂量点设3个瓶，处理后置37℃、5%CO2培养箱培养14 d，去培养液后Giemsa染色，计数每瓶生长的克隆数，以光镜下≥50个细胞为1个克隆。
, http://www.100md.com
5.数据分析：每次实验从空白对照组得出集落贴壁率(plating efficiency， PE)，
100%。各处理组的细胞存活率 (survival fraction, S)：
1-S。 剂量修饰因子(dose modifying factor ，DMF)： 
剂量效应曲线分别按单击多靶模式和LQ模型用计算机进行曲线拟合。存活率的比较和生存曲线参数的比较均用Wilcoxon配对符号秩和检验。所有数据用SPSS 6.0软件处理。
结果
1. DNL对ACC-M的抗瘤效应(表1):根据公式计算，DNL对ACC-M抑瘤率为49.06%,与空白对照组比较, 差异有非常显著性。
, 百拇医药
2.ACC-M细胞的放射生物学特性(表2):根据单击多靶模型: Do=0.848 Gy ，Dq=1.590 1 Gy ，N=5.852 1。根据LQ模型：α=0.342 0Gy-1，β=0.078 3 Gy-2，α/β=4.367 8 。以上参数显示ACC-M细胞属于对γ射线中度敏感，在低剂量区放射损伤程度中等的细胞。
3.放射联合DNL与单纯放射生存曲线参数的比较(表2): 曲线参数显示与R组相比，R+D组的α值升高，表明该组低剂量区的放射损伤增加，Dq值降低，意味着曲线肩区部分变窄，细胞对亚致死性损伤的修复能力受损。D0值无明显下降，提示在指数杀灭的高剂量区，细胞的放射敏感性无明显变化；但D0.01水平两组剂量差异有显著性。R+D组与R组相比，在细胞存活率为0.5和0.01水平，剂量修饰因子分别为1.859 7和1.317 8，P>0.05。由此可见无论在低剂量区还是高剂量区，放射与DNL结合均可协同抗瘤。
, 百拇医药
讨论
Einspenner等[6]认为肿瘤放射的改进主要反映在生存曲线的低剂量区即肩区α，Dq，2 Gy生存率(S2)等参数的改变。细胞受照射后，其生存曲线的起始部分是一个细胞系的特征，放射敏感的细胞α值约0.54，放射不敏感的约为0.28[7]，ACC-M单纯照射时α值为0.342 0属放射中等敏感的细胞；照射后经DNL作用，其细胞存活曲线的α值为0.768 8，表明细胞的放射敏感性明显提高。在放射生物学中Dq反映细胞受到照射后亚致死损伤修复能力的大小，Dq值小，表明照射后细胞对亚致死损伤的修复能力较弱，很小剂量便可对更多细胞造成不可逆转的致死性损伤，到达细胞存活曲线指数性杀伤的部分。本实验R+D组的值仅为R组的37.70%，由此可推测，ACC-M细胞受照后，经DNL的作用，其亚致死损伤修复的能力明显下降，即受到同样剂量照射，有更多细胞的亚致死损伤得不到修复，达到致死损伤的效果。S2(照射2 Gy时的集落存活率)被认为是区别各种细胞放射敏感性的指示参数。一般来说，放射敏感、中度敏感和不敏感的细胞的S2分别在0.27、0.43、0.51左右，不论放射损伤的再修复、再增殖、再充氧、再分布等各种情况如何，经30次照射后S(最后细胞存活率)的对数与(S2)30的对数呈线性相关，本实验S2为0.448 1，R+D组S2为0.113 5，R+D组S2的下降提示通过放射和DNL的共同作用，ACC-M细胞的放射敏感性得到提高。
, http://www.100md.com
表1 放射联合DNL与单纯放射ACC-M细胞生存率的比较(
±s) 组别
例数
剂量(Gy)
0
2
4
6
8
单纯放射
18
100
, 百拇医药 44.81±25.800
11.20±9.500
1.48±02.600
0.06±0.100
放射联合淋巴细胞
18
50.94±31.700
11.35±8.900
1.94±0.019
0.03±0.000
0.00±0.000
P值
, 百拇医药
0.000 4
0.027 0
0.027 0
0.000 2
0.000 2
表2 放射联合DNL与单纯放射生存曲线参数比较 组别
D0(Gy)
Dq(Gy)
α(Gy-1)
β(Gy-2)
D0.5(Gy)
, 百拇医药
D0.01(Gy)
单纯放射
0.848 0±0.182 8
1.590 1±0.426 9
0.342 0±0.182 8
0.078 3±0.020 2
1.563 9±0.442 8
5.795 8±0.478 2
放射联合淋 巴细胞
0.792 4±0.131 6
0.599 5±0.568 9
, http://www.100md.com
0.768 8±0.345 8
0.059 7±0.049 1
0.916 2±0.889 7
4.458 8±0.562 7
P值
0.535
0.041
0.041
0.462
0.028
0.006
本实验中α、Dq、S2参数的变化从不同角度证明在放射低剂量区与对照组相比，R+D组抗瘤效应大大改善，表明ACC-M细胞照射后经DNL作用，放射敏感性明显提高，细胞的亚致死损伤的修复受到明显的抑制或损伤。 参考文献
, 百拇医药
1，Skornick Y, Topalian S, Rosenberg SA, et al. Comparative studies of the long-term growth of lymphocytes from tumor infiltrates, tumor-drining lymph nodes,and peripheral blood by repeated in vitro stimulation with autologous tumor.J Biol Response Mod, 1990, 9:431-438.
2，Rosenberg SA, Spiess P,Lafreniere R.A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes. Science,1986,233:1 318-1 321.
, http://www.100md.com 3，Robert BC,Paul JS, Rosneberg SA. Synergistic antitumor activity of tumor-infiltrating lympyocytes,Interleukin-2, and local tumor irradiation.J Exp Med,1990, 171:249-263.
4，关晓峰,邱蔚六,何荣根,等.肺高转移性涎腺腺样囊性癌细胞株的筛选. 中华口腔医学杂志,1996， 31:74-77.
5，郭伟, 邱蔚六, 何荣根,等.口腔癌DNL与LAK细胞体外体内抗癌作用的比较.中华口腔医学杂志, 1994, 29:336-338.
6，Einspenner M, Boulton JE, Borsa J, et al.Variation of radiation sensitivity of friend erythroleukemia cells cultured in the presence of the differentiation inducer DMSO. Radiat Res,1984, 97:55-63.
7，Ferth B, Malaise EP. Intrinsic radiosensitivity of human cell lines is correlated with radioresponsiveness of human tumors: analysis of 101 publiished survival curves. Int J Radia Oncol Biol Phys, 1985, 11:1 699-1 707.
(收稿日期：1999-07-07), 百拇医药
单位：蔡以理(200011 上海第二医科大学口腔医学院口腔颌面外科)；邱蔚六(200011 上海第二医科大学口腔医学院口腔颌面外科)；何荣根(200011 上海第二医科大学口腔医学院口腔颌面外科)；王中和(200011 上海第二医科大学口腔医学院口腔颌面外科)；周晓健(200011 上海第二医科大学口腔医学院口腔颌面外科)
关键词：淋巴细胞；癌；腺样囊性
中华口腔医学杂志000401 【摘要】 目的 探索放射联合肿瘤引流区淋巴结淋巴细胞(tumor draining lymph node lymphocyte, DNL)对肿瘤细胞的作用。方法 取首次治疗病理证实的口腔癌患者颈清扫淋巴结，经常规消化、分离，加白细胞介素2(interleukin-2, IL-2)培养，获取激活的淋巴细胞作为效应细胞，以效靶比(E∶T)25∶1进行集落形成试验,观察对人涎腺腺样囊性癌肺高转移细胞株(adenoid cystic carcinoma, ACC-M)的抗瘤效应，并分别以不同剂量60钴γ射线对ACC-M照射后，随即加入DNL细胞,观察放射结合DNL对ACC-M的抗瘤效应。结果 ACC-M为放射中度敏感细胞。根据线性——二次数学模型(LQ模型)，其α、β值分别为0.342 0，0.078 3。DNL对ACC-M的抑瘤率为49.06% 。放射联合DNL作用时,α值提高到0.768 8；Dq、S2分别从1.590 1、0.448 1降至0.599 5、0.113 5，这3个参数与放射组相比，差异均有显著性(P<0.05)。在高剂量区，与放射组比，放射联合淋巴细胞组的D0. 01和6 Gy、8 Gy剂量点的细胞存活率均明显下降，P<0.01。结论 体外来源于不同病理类型口腔癌的IL-2激活的DNL对ACC-M有明显的抗瘤效应，无论在低剂量还是高剂量区与放射结合都有显著的协同抗瘤效应。
, 百拇医药
Antitumor effect of radiation combined with tumor draining lymphocytes on human ACC-M cell in vitro
CAI Yili，QIU Weiliu，HE Ronggen
(Department of Oral Maxillofacial Surgery， School of Stomatology ，Shanghai Second Medical University ，Shanghai 200011，China)
【Abstract】 Objective To find whether there is any synergistic effect of radiation combined with interleukin-2(IL-2) activated tumor draining lymph nodes lymphocyts (DNL) from oral-carcinoma patients on high-lung metastatic salivary adenoid cystic carcinoma cell line(ACC-M). Methods Colony - forming test was used to investigate antitumor effect and analyzed using linear-quadratic(LQ) equation and single hit multi targets equation. Results The ratio of effect to targets was 25∶1.The cytotoxiclty of DNL was 49.06%.Radiation combined with DNL showed higher antitumor activity compared with radiation alone,α value, Dq and S2 were 0.768 8 and 0.342 0;1.590 1 and 0.599 5; 0.448 1 and 0.113 5 respectively(P<0.05). Conclusions It indicates that in initial region of survival curve, DNL significantly increased sublethal damage on ACC-M.
, 百拇医药
【Key words】 Lymphocytes ; Carcinoma,adenoid cystic
白细胞介素2(interleukin-2, IL-2)激活的肿瘤引流区淋巴结淋巴细胞(tumor draining lymph node lymphocyte，DNL)已被证实是与肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TIL)具有相似抗瘤效应的淋巴细胞[1，2]。 Robert等[3]曾报道TIL辅以小剂量放射时，小鼠实验性肺转移明显减少。我们用人涎腺腺样囊性癌肺高转移株(adenoid cystic carcinoma, ACC-M)[4]为研究对象，以激活的人口腔癌DNL作效应细胞，观察其对ACC-M的抗瘤效应及放射联合DNL的抗瘤效应。
材料与方法
1.细胞：
, http://www.100md.com
(1)靶细胞 ：ACC-M人涎腺腺样囊性癌肺高转移株(上海第二医科大学口腔医学院口腔颌面外科实验室提供)。
(2)效应细胞：取自1995年5月至1996年2月上海第二医科大学口腔医学院口腔颌面外科收治的6例口腔癌住院患者，均经病理证实为原发性口腔恶性肿瘤，其中鳞癌4例，基底细胞癌1 例，恶性淋巴上皮病1例。术前均未行放、化疗。
2. 效应细胞制备:见参考文献[5]。
3.照射条件:60钴γ射线，剂量率为(70.9～63.2)cGy/min，室温照射。
4.实验设计:实验前用ACC-M 1×108/L细胞接种在50 ml培养瓶中，于含15%小牛血清的RPMI 1640培养液(含青霉素10×105 U/L，链霉素1 mg/L)中,在37 ℃、5%CO2培养箱内培养约40 h。实验时将处于指数生长期的细胞分成对照组和各处理组。
, http://www.100md.com
(1)空白对照组(C): 将ACC-M细胞常规消化，调整细胞浓度至1×109/L，接种一定数量细胞于25 ml培养瓶内。
(2)单纯放射组(R): 将ACC-M单细胞悬液分别经0.5、2、4、6、8 Gy单次照射后，接种于25 ml培养瓶中。
(3)DNL组(D):以效靶比(E∶T)25∶1，将处于抗瘤活性高峰期(培养7～25 d)的DNL和指数生长期ACC-M细胞接种于25 ml培养瓶。
(4)放射结合DNL组(R+D):将不同剂量照射过的ACC-M细胞按R组相应放射剂量组同样数量接种于培养瓶后，以E∶T=25∶1加入DNL细胞。
以上各组实验每个剂量点设3个瓶，处理后置37℃、5%CO2培养箱培养14 d，去培养液后Giemsa染色，计数每瓶生长的克隆数，以光镜下≥50个细胞为1个克隆。
, http://www.100md.com
5.数据分析：每次实验从空白对照组得出集落贴壁率(plating efficiency， PE)，
100%。各处理组的细胞存活率 (survival fraction, S)：1-S。 剂量修饰因子(dose modifying factor ，DMF)： 剂量效应曲线分别按单击多靶模式和LQ模型用计算机进行曲线拟合。存活率的比较和生存曲线参数的比较均用Wilcoxon配对符号秩和检验。所有数据用SPSS 6.0软件处理。
结果
1. DNL对ACC-M的抗瘤效应(表1):根据公式计算，DNL对ACC-M抑瘤率为49.06%,与空白对照组比较, 差异有非常显著性。
, 百拇医药
2.ACC-M细胞的放射生物学特性(表2):根据单击多靶模型: Do=0.848 Gy ，Dq=1.590 1 Gy ，N=5.852 1。根据LQ模型：α=0.342 0Gy-1，β=0.078 3 Gy-2，α/β=4.367 8 。以上参数显示ACC-M细胞属于对γ射线中度敏感，在低剂量区放射损伤程度中等的细胞。
3.放射联合DNL与单纯放射生存曲线参数的比较(表2): 曲线参数显示与R组相比，R+D组的α值升高，表明该组低剂量区的放射损伤增加，Dq值降低，意味着曲线肩区部分变窄，细胞对亚致死性损伤的修复能力受损。D0值无明显下降，提示在指数杀灭的高剂量区，细胞的放射敏感性无明显变化；但D0.01水平两组剂量差异有显著性。R+D组与R组相比，在细胞存活率为0.5和0.01水平，剂量修饰因子分别为1.859 7和1.317 8，P>0.05。由此可见无论在低剂量区还是高剂量区，放射与DNL结合均可协同抗瘤。
, 百拇医药
讨论
Einspenner等[6]认为肿瘤放射的改进主要反映在生存曲线的低剂量区即肩区α，Dq，2 Gy生存率(S2)等参数的改变。细胞受照射后，其生存曲线的起始部分是一个细胞系的特征，放射敏感的细胞α值约0.54，放射不敏感的约为0.28[7]，ACC-M单纯照射时α值为0.342 0属放射中等敏感的细胞；照射后经DNL作用，其细胞存活曲线的α值为0.768 8，表明细胞的放射敏感性明显提高。在放射生物学中Dq反映细胞受到照射后亚致死损伤修复能力的大小，Dq值小，表明照射后细胞对亚致死损伤的修复能力较弱，很小剂量便可对更多细胞造成不可逆转的致死性损伤，到达细胞存活曲线指数性杀伤的部分。本实验R+D组的值仅为R组的37.70%，由此可推测，ACC-M细胞受照后，经DNL的作用，其亚致死损伤修复的能力明显下降，即受到同样剂量照射，有更多细胞的亚致死损伤得不到修复，达到致死损伤的效果。S2(照射2 Gy时的集落存活率)被认为是区别各种细胞放射敏感性的指示参数。一般来说，放射敏感、中度敏感和不敏感的细胞的S2分别在0.27、0.43、0.51左右，不论放射损伤的再修复、再增殖、再充氧、再分布等各种情况如何，经30次照射后S(最后细胞存活率)的对数与(S2)30的对数呈线性相关，本实验S2为0.448 1，R+D组S2为0.113 5，R+D组S2的下降提示通过放射和DNL的共同作用，ACC-M细胞的放射敏感性得到提高。
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表1 放射联合DNL与单纯放射ACC-M细胞生存率的比较(
±s) 组别例数
剂量(Gy)
0
2
4
6
8
单纯放射
18
100
, 百拇医药 44.81±25.800
11.20±9.500
1.48±02.600
0.06±0.100
放射联合淋巴细胞
18
50.94±31.700
11.35±8.900
1.94±0.019
0.03±0.000
0.00±0.000
P值
, 百拇医药
0.000 4
0.027 0
0.027 0
0.000 2
0.000 2
表2 放射联合DNL与单纯放射生存曲线参数比较 组别
D0(Gy)
Dq(Gy)
α(Gy-1)
β(Gy-2)
D0.5(Gy)
, 百拇医药
D0.01(Gy)
单纯放射
0.848 0±0.182 8
1.590 1±0.426 9
0.342 0±0.182 8
0.078 3±0.020 2
1.563 9±0.442 8
5.795 8±0.478 2
放射联合淋 巴细胞
0.792 4±0.131 6
0.599 5±0.568 9
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0.768 8±0.345 8
0.059 7±0.049 1
0.916 2±0.889 7
4.458 8±0.562 7
P值
0.535
0.041
0.041
0.462
0.028
0.006
本实验中α、Dq、S2参数的变化从不同角度证明在放射低剂量区与对照组相比，R+D组抗瘤效应大大改善，表明ACC-M细胞照射后经DNL作用，放射敏感性明显提高，细胞的亚致死损伤的修复受到明显的抑制或损伤。 参考文献
, 百拇医药
1，Skornick Y, Topalian S, Rosenberg SA, et al. Comparative studies of the long-term growth of lymphocytes from tumor infiltrates, tumor-drining lymph nodes,and peripheral blood by repeated in vitro stimulation with autologous tumor.J Biol Response Mod, 1990, 9:431-438.
2，Rosenberg SA, Spiess P,Lafreniere R.A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes. Science,1986,233:1 318-1 321.
, http://www.100md.com 3，Robert BC,Paul JS, Rosneberg SA. Synergistic antitumor activity of tumor-infiltrating lympyocytes,Interleukin-2, and local tumor irradiation.J Exp Med,1990, 171:249-263.
4，关晓峰,邱蔚六,何荣根,等.肺高转移性涎腺腺样囊性癌细胞株的筛选. 中华口腔医学杂志,1996， 31:74-77.
5，郭伟, 邱蔚六, 何荣根,等.口腔癌DNL与LAK细胞体外体内抗癌作用的比较.中华口腔医学杂志, 1994, 29:336-338.
6，Einspenner M, Boulton JE, Borsa J, et al.Variation of radiation sensitivity of friend erythroleukemia cells cultured in the presence of the differentiation inducer DMSO. Radiat Res,1984, 97:55-63.
7，Ferth B, Malaise EP. Intrinsic radiosensitivity of human cell lines is correlated with radioresponsiveness of human tumors: analysis of 101 publiished survival curves. Int J Radia Oncol Biol Phys, 1985, 11:1 699-1 707.
(收稿日期：1999-07-07), 百拇医药