MHC分子在诱导口腔鳞癌CTL中的作用
作者：杨宏宇 李金荣 赵怡芳 王秀丽 卢海蓉
单位：杨宏宇(430079 武汉，湖北医科大学口腔医学院口腔颌面外科；现在中山医科大学第三附属医院口腔科，510630)；李金荣(430079 武汉，湖北医科大学口腔医学院口腔颌面外科)；赵怡芳(430079 武汉，湖北医科大学口腔医学院口腔颌面外科)；王秀丽(430079 武汉，湖北医科大学口腔医学院口腔颌面外科)；卢海蓉(武汉生物制品研究所肿瘤研究室)
关键词：癌；鳞状细胞；口腔肿瘤；T淋巴细胞；细胞毒性
中华口腔医学杂志000414 【摘要】 目的 探讨肿瘤细胞上的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)分子在诱导自体口腔鳞癌细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)中的作用。方法 对9例口腔鳞癌中的肿瘤细胞表面人类白细胞抗原 (human leukocyte antigen，HLA)-ABC和HLA-DR抗原进行检测，将其中5例HLA-ABC抗原表达>50%和HLA-DR抗原表达>35%的病例作为研究对象：①自体肿瘤细胞经处理后作刺激细胞，并用MHC单抗阻断刺激细胞上的HLA-ABC和(或)HLA-DR抗原，检测自体肿瘤细胞诱导的CTL的特异性杀伤活性及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α的分泌水平。②阻断靶细胞上HLA-ABC和(或)HLA-DR抗原，观察MHC单抗对自体刺激细胞(未加单抗处理)诱导的CTL细胞毒的抑制作用。结果 ①各病例的各实验组刺激细胞诱导的CTL杀伤活性均显著低于对照组，依次为：DR抗原阳性刺激细胞组>ABC抗原阳性刺激细胞组>ABC和DR抗原均阴性刺激细胞组，抗ABC 单抗可完全阻断CTL特异性分泌TNF-α；②各实验组单抗对CTL的杀伤活性的平均抑制率分别为：抗ABC单抗为52%；抗DR 单抗为27%；抗ABC 单抗+抗DR 单抗为72%。 结论口腔鳞癌细胞上的MHC-I、II类抗原在诱导自体CTL中起重要作用。
, 百拇医药
The role of MHC molecules on OSCC cells in the induction of autologous cytotoxic T lymphocytes
YANG Hongyu，LI Jinrong，ZHAO Yifang
(Department of Stomatology，The Third Affiliated Hospital ，Sun Yet-Sen University of Medical Sciences， Guangzhou 510630，China)
【Abstract】 Objective To investigate the role of major histocompatibility complex(MHC) molecules in the induction of cytotoxic T lymphocyte(CTL) from oral squamous cell carcinoma. Methods ①The treated autologous tumor cells served as stimulating cells，on which the MHC mAb was used to block the HLA-ABC and/or HLA-DR antigens.The specific cytotoxicity of CTL induced by stimulating cells and the level of released TNF-α were then detected. ② By blocking the HLA-ABC and/or HLA-DR antigens on target cells , the inhibition effect of MHC mAb on CTL cytotoxicity induced by autologous stimulating cells (not treated with mAb) was measured. Results ①The cytotoxicity induced by stimulating cells in experimental groups was significantly lower than that of the control group. The successive order was: the DR antigen positive stimulating cell group > ABC antigen positive stimulating cell gooup > both ABC and DR antigen negative stimulating cell group . The specific TNF-α released by CTL was completely blocked by anti-ABC mAb.②The average inhibition rate by mAb on cytotoxicity of CTL was: 52%,27% and 72% by anti-ABC mAb, anti-DR mAb, and anti-ABC mAb plus anti-DR mAb respectively. Conclusion Both MHC-class I and class Ⅱantigens on OSCC cells play an important role in inducing CTL.
, 百拇医药
【Key words】 Carcinoma，squamous cell； Mouth neoplasms； T-lymphocytes，cytotoxic
多数肿瘤的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)-I类抗原均有丢失或不同程度的降低，这种降低或丢失可能会影响MHC-I类抗原诱导的细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)或CTL细胞毒作用。关于人黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌中MHC-I类分子限制性肿瘤特异的CTL的研究已有较多报道。人头颈鳞癌中MHC-I类抗原表达较高，而MHC-Ⅱ类抗原相对较低[1-3]。那么表达MHC-I类抗原的口腔鳞状细胞癌的CTL及CTL细胞毒活性是否也存在MHC的限制性呢？我们对此进行初步探讨 。
材料及方法
1.病例选择： 经病理证实的口腔鳞癌患者9例，术前均未经放疗及化疗。男7例，女2例，年龄41～67岁。其中颊癌3例，舌癌5例, 口底癌1例。为探讨口腔鳞癌细胞MHC抗原在诱导CTL或CTL细胞毒中的作用，对9例口腔鳞癌新鲜分离的肿瘤细胞表面HLA-ABC和HLA- DR抗原进行检测，选其中5例HLA-ABC抗原表达>50%和HLA- DR抗原表达均>35%的病例作为本实验的研究对象。
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2.方法：
(1) 肿瘤浸润淋巴细胞的分离： 用酶消化和不连续梯度密度的淋巴细胞分离液将肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞分离 。然后将分离的肿瘤细胞进行体外培养或冻存，作为细胞毒测定中的靶细胞或自体肿瘤刺激细胞。肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltration lymphocyte，TIL)以2.5×108 个细胞/ L的浓度置于含10%胎牛血清、PG 5×104IU/ L、链霉素50 mg/ L、庆大霉素50 mg/ L、rIL-2 1 ×106 U/ L的完全培养液中在37℃，5%CO2的培养箱培养。
(2)刺激细胞的制备：①复苏的自体肿瘤细胞中加丝裂霉素C，50 mg/L,37℃ ，30 min；②用培养液洗4次；③肿瘤细胞再悬于完全培养基中，每个病例分4组；④分别加入鼠抗人HLA-ABC 单抗(monoclonal antibody, mAb), HLA- DR mAb, HLA-ABC mAb + HLA- DR mAb，20 mg/L, 4℃, 1 h后作为刺激细胞，对照组不加单抗(单抗购于解放军军事医学科学院)。
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(3)肿瘤细胞表面HLA-ABC和HLA-DR抗原的检测： ①取5×108/L的被测瘤细胞，按适当比例加入人抗鼠HLA-ABC mAb 和HLA- DR mAb，1组不加单抗，4℃孵育30 min，洗涤3次；再加入适当比例异硫氰酸荧光素标记的兔抗鼠IgG，4℃孵育30 min，洗涤3次，FACS检测。
(4)CTL的诱导：采用淋巴细胞和肿瘤细胞混合培养法诱生CTL 。 5×109 个细胞/L TIL和5×108 U/ L丝裂霉素C处理的自体肿瘤细胞5%CO2 ，37℃条件下共培养。5 d后，再加入rIL-2 1×106 U/ L，培养2周，每2～3 d换液1次，并补充rIL-2。
(5)细胞毒活性的测定：采用3H-TdR(购于中国原子能研究院，比活度为3.7×104 MBq/L 4 h释放法[4]检测MHC诱导的CTL的细胞毒活性，效靶比为50∶1。
, 百拇医药
(6)抗HLA-ABC和HLA-DR单抗对CTL细胞毒活性的抑制作用：①靶细胞的制备： 每孔加入50 μl自体肿瘤细胞，每孔加入1.85 ×104 Bq 3 H-TdR, 37℃、5%CO2 12 h ，充分清洗后，加入50 μl anti-HLA-ABC mAb或(和)anti-HLA-DR mAb, 4℃ 下1 h， 每个实验条件设3组复孔。②效应细胞的制备：自体肿瘤细胞经丝裂霉素C处理后，洗涤4次， 然后按刺激细胞：TIL＝1∶10加入自体TIL，37℃ 、5% CO2 培养5 d 后，加入rIL-2 1 ×106 U/ L, 再培养2周。③以效应细胞∶靶细胞＝50∶1，测杀伤活性。
(7)特异性TNF-α的分泌：将抗体阻断和未阻断的刺激细胞与自体TIL(50∶1)共同培养24～72 h后收集上清液，用ELISA法检测TNF-α (解放军军事医学科学院)。
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结果
1. HLA-ABC和DR抗原在口腔鳞癌细胞中的表达： 5例口腔鳞癌细胞HLA-ABC抗原的表达为57.98%～83.24%, HLA-DR抗原表达为35.87%～41.89%。
2. HLA-ABC和DR在诱导CTL中的作用：对照组(HLA-ABC和DR双阳性的刺激细胞)诱导的CTL杀伤活性最强。与各自的对照组相比，各个病例的各实验组诱导的CTL杀伤活性均显著降低。5例统计学分析结果表明，各实验组均小于对照组，依次为：DR抗原阳性刺激细胞组(P<0.005) >ABC抗原阳性刺激细胞组(P<0.002 5)>ABC和DR抗原均阴性刺激细胞组(P<0.001)。
3. MHC抗原在诱导CTL细胞毒中的抑制作用：为了证实MHC抗原在诱导CTL细胞毒中的抑制作用，将经丝裂霉素C处理的自体肿瘤细胞作刺激细胞(HLA-ABC和DR抗原均阳性细胞)，诱导CTL。然后将靶细胞上MHC抗原用HLA-ABC和DR单抗阻断，结果显示：抗HLA-ABC单抗阻断组，抑制率可达45%～59%，平均为52%；抗HLA-DR单抗阻断组，抑制率为21%～38%，平均为27%；抗HLA-ABC单抗+DR单抗阻断后，抑制率为64%～77%，平均72%。
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4. TNF-α的特异性释放：抗HLA-ABC单抗能完全阻断CTL特异性释放TNF-α ，抗HLA-DR单抗能部分阻断CTL释放TNF-α。
讨论
TIL的抗瘤作用主要依赖于其中的CTL直接杀伤肿瘤细胞。但CTL抗原对癌细胞的识别及CTL对癌细胞的杀伤效应具有高度特异性，它只杀伤表面带有特异性肿瘤抗原和MHC-I类分子的靶细胞。抗肿瘤T细胞的免疫效应包括两种T细胞亚群的功能, 即MHC-I类抗原限制的CD8+T细胞和MHC-Ⅱ类抗原限制的CD4+T细胞。T细胞对靶细胞的识别必须同时识别靶细胞上的特异抗原和MHC分子， 形成T细胞受体(TCR)- 多肽 - MHC分子复合体， 向CTL传递识别信号。因此弄清CTL抗肿瘤作用与MHC分子的关系对提高肿瘤的免疫治疗效果具有重要意义。
MHC-I类抗原编码的基因位点和抗原系列包括HLA-A、-B、-C， MHC-Ⅱ类抗原包括HLA-D、-DR、-DQ、-DP。本研究结果表明：HLA-ABC和HLA-DR抗原均阳性的刺激细胞(未加单抗)诱导的CTL对自体肿瘤细胞的杀伤活性最强，其余依次为HLA-ABC阳性刺激细胞(DR阻断)> HLA-DR阳性刺激细胞(ABC阻断)> HLA-ABC和DR均阴性刺激细胞(ABC和DR均阻断)。而将靶细胞上HLA-ABC和DR抗原阻断后，对自体刺激细胞(HLA-ABC和DR抗原均阳性)诱导的CTL的杀伤活性的抑制率分别为：HLA-ABC 和DR 抗原均阻断组为72%， ABC抗原 阻断组为52%，DR阻断组平均为27%。刺激细胞中ABC抗原阻断后， 诱导的CTL仍有杀伤活性及靶细胞上ABC抗原阻断后仍不能完全阻断CTL的杀伤活性，说明了CTL的异质性。我们过去的研究表明， TIL中主要为CD4+和CD8+T细胞及少量NK细胞。因此，我们认为，本实验中5例口腔鳞癌诱导的CTL中存在MHC-I类抗原限制的CD8+T 细胞和MHC-Ⅱ类抗原限制的CD4+T细胞。有研究表明，在黑色素瘤中，只有DR阳性的黑色素瘤细胞才能诱导TIL的增殖，DR在自体TIL中有重要作用[5]。在自体肿瘤刺激下，CD4+ T细胞 可产生IL-2、GM-CSF，从而诱导和维持CD8+T细胞的增殖[6，7]。本研究也证实了DR抗原在诱导CTL中的作用。因为将DR抗原阻断后，可抑制CTL 21%～38%的杀伤活性，也说明与DR抗原结合的CD4+T细胞在调节免疫反应中起重要作用。
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本研究中， 阻断靶细胞上HLA-ABC和DR抗原后， 仍然不能完全阻断 CTL 的杀伤活 性，表明CTL中存在不受MHC抗原限制的杀伤细胞，如NK细胞。
由于TNF-α的抗肿瘤及对CTL的正向调节作用而备受重视，但CTL在未活化前自分泌细胞因子能力很差。本研究表明，抗HLA-ABC单抗虽不能完全阻断CTL的杀伤活性，却可以完全阻断CTL分泌TNF-α。用HLA-DR抗原不能刺激CTL释放TNF-α，说明本研究中CTL释放的TNF-α主要为CD8+T细胞分泌。
以上说明，表达HLA-ABC和DR抗原的口腔鳞癌细胞诱导的CTL中存在MHC-I类抗原限制的TC细胞、MHC-Ⅱ类抗原限制性的TH细胞及非MHC限制性的NK细胞，它们共同完成对自体肿瘤的杀伤功能。
基金项目：湖北省自然科学基金资助项目(95129)
, http://www.100md.com
参考文献
1，Vora AR, Rodgers S, Parker AJ, et al. An immunohistochemical study of altered immunomodulatory molecule expression in head and neck squamous cell carcinoma. Br J Cancer, 1997,76: 836-844.
2，Mattijsen V, De Mulder PHM,Schalkwijk L,et al. HLA antigen expression routinely processed head and neck squamous cell carcinoma primary lesions of different sites. Int J Cancer, 1991 Suppl 6:95-100.
, 百拇医药 3，Houck JR, Sexton FM, Zajdel G . HLA class I and class Ⅱantigen expression on squamous cell carcinoma of the head and neck . Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 1990,116:1 181-1 185.
4，吴厚生，谢琪，姜小玲，等. 3 H-TdR释放法测量细胞介导的细胞毒功能.上海免疫学杂志，1987，7：230-233.
5，Fossati G, Taramelli D, Balsari A, et al. Primary but not metastatic human melanomas expressing DR antigens stimulate autologous lymphocytes. Int J Cancer, 1984,33:591-597.
, http://www.100md.com
6，Okada K, Yasumura S, Muller-Fleckenstein I, et al. Interactions between autologous CD4+ and CD8+ T lymphocytes and human squamous cell carcinoma of the head and neck. Cell Immunol, 1997,177: 35-48.
7，Katsumoto Y, Monden T,Takoda T,et al. Analysis of cytotoxic activity of the CD4+ T lymphocytes generated by local immunotherapy . Br J Cancer, 1996,73:110-116.
(收稿日期：1999-08-20), 百拇医药
单位：杨宏宇(430079 武汉，湖北医科大学口腔医学院口腔颌面外科；现在中山医科大学第三附属医院口腔科，510630)；李金荣(430079 武汉，湖北医科大学口腔医学院口腔颌面外科)；赵怡芳(430079 武汉，湖北医科大学口腔医学院口腔颌面外科)；王秀丽(430079 武汉，湖北医科大学口腔医学院口腔颌面外科)；卢海蓉(武汉生物制品研究所肿瘤研究室)
关键词：癌；鳞状细胞；口腔肿瘤；T淋巴细胞；细胞毒性
中华口腔医学杂志000414 【摘要】 目的 探讨肿瘤细胞上的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)分子在诱导自体口腔鳞癌细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)中的作用。方法 对9例口腔鳞癌中的肿瘤细胞表面人类白细胞抗原 (human leukocyte antigen，HLA)-ABC和HLA-DR抗原进行检测，将其中5例HLA-ABC抗原表达>50%和HLA-DR抗原表达>35%的病例作为研究对象：①自体肿瘤细胞经处理后作刺激细胞，并用MHC单抗阻断刺激细胞上的HLA-ABC和(或)HLA-DR抗原，检测自体肿瘤细胞诱导的CTL的特异性杀伤活性及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α的分泌水平。②阻断靶细胞上HLA-ABC和(或)HLA-DR抗原，观察MHC单抗对自体刺激细胞(未加单抗处理)诱导的CTL细胞毒的抑制作用。结果 ①各病例的各实验组刺激细胞诱导的CTL杀伤活性均显著低于对照组，依次为：DR抗原阳性刺激细胞组>ABC抗原阳性刺激细胞组>ABC和DR抗原均阴性刺激细胞组，抗ABC 单抗可完全阻断CTL特异性分泌TNF-α；②各实验组单抗对CTL的杀伤活性的平均抑制率分别为：抗ABC单抗为52%；抗DR 单抗为27%；抗ABC 单抗+抗DR 单抗为72%。 结论口腔鳞癌细胞上的MHC-I、II类抗原在诱导自体CTL中起重要作用。
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The role of MHC molecules on OSCC cells in the induction of autologous cytotoxic T lymphocytes
YANG Hongyu，LI Jinrong，ZHAO Yifang
(Department of Stomatology，The Third Affiliated Hospital ，Sun Yet-Sen University of Medical Sciences， Guangzhou 510630，China)
【Abstract】 Objective To investigate the role of major histocompatibility complex(MHC) molecules in the induction of cytotoxic T lymphocyte(CTL) from oral squamous cell carcinoma. Methods ①The treated autologous tumor cells served as stimulating cells，on which the MHC mAb was used to block the HLA-ABC and/or HLA-DR antigens.The specific cytotoxicity of CTL induced by stimulating cells and the level of released TNF-α were then detected. ② By blocking the HLA-ABC and/or HLA-DR antigens on target cells , the inhibition effect of MHC mAb on CTL cytotoxicity induced by autologous stimulating cells (not treated with mAb) was measured. Results ①The cytotoxicity induced by stimulating cells in experimental groups was significantly lower than that of the control group. The successive order was: the DR antigen positive stimulating cell group > ABC antigen positive stimulating cell gooup > both ABC and DR antigen negative stimulating cell group . The specific TNF-α released by CTL was completely blocked by anti-ABC mAb.②The average inhibition rate by mAb on cytotoxicity of CTL was: 52%,27% and 72% by anti-ABC mAb, anti-DR mAb, and anti-ABC mAb plus anti-DR mAb respectively. Conclusion Both MHC-class I and class Ⅱantigens on OSCC cells play an important role in inducing CTL.
, 百拇医药
【Key words】 Carcinoma，squamous cell； Mouth neoplasms； T-lymphocytes，cytotoxic
多数肿瘤的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)-I类抗原均有丢失或不同程度的降低，这种降低或丢失可能会影响MHC-I类抗原诱导的细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)或CTL细胞毒作用。关于人黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌中MHC-I类分子限制性肿瘤特异的CTL的研究已有较多报道。人头颈鳞癌中MHC-I类抗原表达较高，而MHC-Ⅱ类抗原相对较低[1-3]。那么表达MHC-I类抗原的口腔鳞状细胞癌的CTL及CTL细胞毒活性是否也存在MHC的限制性呢？我们对此进行初步探讨 。
材料及方法
1.病例选择： 经病理证实的口腔鳞癌患者9例，术前均未经放疗及化疗。男7例，女2例，年龄41～67岁。其中颊癌3例，舌癌5例, 口底癌1例。为探讨口腔鳞癌细胞MHC抗原在诱导CTL或CTL细胞毒中的作用，对9例口腔鳞癌新鲜分离的肿瘤细胞表面HLA-ABC和HLA- DR抗原进行检测，选其中5例HLA-ABC抗原表达>50%和HLA- DR抗原表达均>35%的病例作为本实验的研究对象。
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2.方法：
(1) 肿瘤浸润淋巴细胞的分离： 用酶消化和不连续梯度密度的淋巴细胞分离液将肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞分离 。然后将分离的肿瘤细胞进行体外培养或冻存，作为细胞毒测定中的靶细胞或自体肿瘤刺激细胞。肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltration lymphocyte，TIL)以2.5×108 个细胞/ L的浓度置于含10%胎牛血清、PG 5×104IU/ L、链霉素50 mg/ L、庆大霉素50 mg/ L、rIL-2 1 ×106 U/ L的完全培养液中在37℃，5%CO2的培养箱培养。
(2)刺激细胞的制备：①复苏的自体肿瘤细胞中加丝裂霉素C，50 mg/L,37℃ ，30 min；②用培养液洗4次；③肿瘤细胞再悬于完全培养基中，每个病例分4组；④分别加入鼠抗人HLA-ABC 单抗(monoclonal antibody, mAb), HLA- DR mAb, HLA-ABC mAb + HLA- DR mAb，20 mg/L, 4℃, 1 h后作为刺激细胞，对照组不加单抗(单抗购于解放军军事医学科学院)。
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(3)肿瘤细胞表面HLA-ABC和HLA-DR抗原的检测： ①取5×108/L的被测瘤细胞，按适当比例加入人抗鼠HLA-ABC mAb 和HLA- DR mAb，1组不加单抗，4℃孵育30 min，洗涤3次；再加入适当比例异硫氰酸荧光素标记的兔抗鼠IgG，4℃孵育30 min，洗涤3次，FACS检测。
(4)CTL的诱导：采用淋巴细胞和肿瘤细胞混合培养法诱生CTL 。 5×109 个细胞/L TIL和5×108 U/ L丝裂霉素C处理的自体肿瘤细胞5%CO2 ，37℃条件下共培养。5 d后，再加入rIL-2 1×106 U/ L，培养2周，每2～3 d换液1次，并补充rIL-2。
(5)细胞毒活性的测定：采用3H-TdR(购于中国原子能研究院，比活度为3.7×104 MBq/L 4 h释放法[4]检测MHC诱导的CTL的细胞毒活性，效靶比为50∶1。
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(6)抗HLA-ABC和HLA-DR单抗对CTL细胞毒活性的抑制作用：①靶细胞的制备： 每孔加入50 μl自体肿瘤细胞，每孔加入1.85 ×104 Bq 3 H-TdR, 37℃、5%CO2 12 h ，充分清洗后，加入50 μl anti-HLA-ABC mAb或(和)anti-HLA-DR mAb, 4℃ 下1 h， 每个实验条件设3组复孔。②效应细胞的制备：自体肿瘤细胞经丝裂霉素C处理后，洗涤4次， 然后按刺激细胞：TIL＝1∶10加入自体TIL，37℃ 、5% CO2 培养5 d 后，加入rIL-2 1 ×106 U/ L, 再培养2周。③以效应细胞∶靶细胞＝50∶1，测杀伤活性。
(7)特异性TNF-α的分泌：将抗体阻断和未阻断的刺激细胞与自体TIL(50∶1)共同培养24～72 h后收集上清液，用ELISA法检测TNF-α (解放军军事医学科学院)。
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结果
1. HLA-ABC和DR抗原在口腔鳞癌细胞中的表达： 5例口腔鳞癌细胞HLA-ABC抗原的表达为57.98%～83.24%, HLA-DR抗原表达为35.87%～41.89%。
2. HLA-ABC和DR在诱导CTL中的作用：对照组(HLA-ABC和DR双阳性的刺激细胞)诱导的CTL杀伤活性最强。与各自的对照组相比，各个病例的各实验组诱导的CTL杀伤活性均显著降低。5例统计学分析结果表明，各实验组均小于对照组，依次为：DR抗原阳性刺激细胞组(P<0.005) >ABC抗原阳性刺激细胞组(P<0.002 5)>ABC和DR抗原均阴性刺激细胞组(P<0.001)。
3. MHC抗原在诱导CTL细胞毒中的抑制作用：为了证实MHC抗原在诱导CTL细胞毒中的抑制作用，将经丝裂霉素C处理的自体肿瘤细胞作刺激细胞(HLA-ABC和DR抗原均阳性细胞)，诱导CTL。然后将靶细胞上MHC抗原用HLA-ABC和DR单抗阻断，结果显示：抗HLA-ABC单抗阻断组，抑制率可达45%～59%，平均为52%；抗HLA-DR单抗阻断组，抑制率为21%～38%，平均为27%；抗HLA-ABC单抗+DR单抗阻断后，抑制率为64%～77%，平均72%。
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4. TNF-α的特异性释放：抗HLA-ABC单抗能完全阻断CTL特异性释放TNF-α ，抗HLA-DR单抗能部分阻断CTL释放TNF-α。
讨论
TIL的抗瘤作用主要依赖于其中的CTL直接杀伤肿瘤细胞。但CTL抗原对癌细胞的识别及CTL对癌细胞的杀伤效应具有高度特异性，它只杀伤表面带有特异性肿瘤抗原和MHC-I类分子的靶细胞。抗肿瘤T细胞的免疫效应包括两种T细胞亚群的功能, 即MHC-I类抗原限制的CD8+T细胞和MHC-Ⅱ类抗原限制的CD4+T细胞。T细胞对靶细胞的识别必须同时识别靶细胞上的特异抗原和MHC分子， 形成T细胞受体(TCR)- 多肽 - MHC分子复合体， 向CTL传递识别信号。因此弄清CTL抗肿瘤作用与MHC分子的关系对提高肿瘤的免疫治疗效果具有重要意义。
MHC-I类抗原编码的基因位点和抗原系列包括HLA-A、-B、-C， MHC-Ⅱ类抗原包括HLA-D、-DR、-DQ、-DP。本研究结果表明：HLA-ABC和HLA-DR抗原均阳性的刺激细胞(未加单抗)诱导的CTL对自体肿瘤细胞的杀伤活性最强，其余依次为HLA-ABC阳性刺激细胞(DR阻断)> HLA-DR阳性刺激细胞(ABC阻断)> HLA-ABC和DR均阴性刺激细胞(ABC和DR均阻断)。而将靶细胞上HLA-ABC和DR抗原阻断后，对自体刺激细胞(HLA-ABC和DR抗原均阳性)诱导的CTL的杀伤活性的抑制率分别为：HLA-ABC 和DR 抗原均阻断组为72%， ABC抗原 阻断组为52%，DR阻断组平均为27%。刺激细胞中ABC抗原阻断后， 诱导的CTL仍有杀伤活性及靶细胞上ABC抗原阻断后仍不能完全阻断CTL的杀伤活性，说明了CTL的异质性。我们过去的研究表明， TIL中主要为CD4+和CD8+T细胞及少量NK细胞。因此，我们认为，本实验中5例口腔鳞癌诱导的CTL中存在MHC-I类抗原限制的CD8+T 细胞和MHC-Ⅱ类抗原限制的CD4+T细胞。有研究表明，在黑色素瘤中，只有DR阳性的黑色素瘤细胞才能诱导TIL的增殖，DR在自体TIL中有重要作用[5]。在自体肿瘤刺激下，CD4+ T细胞 可产生IL-2、GM-CSF，从而诱导和维持CD8+T细胞的增殖[6，7]。本研究也证实了DR抗原在诱导CTL中的作用。因为将DR抗原阻断后，可抑制CTL 21%～38%的杀伤活性，也说明与DR抗原结合的CD4+T细胞在调节免疫反应中起重要作用。
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本研究中， 阻断靶细胞上HLA-ABC和DR抗原后， 仍然不能完全阻断 CTL 的杀伤活 性，表明CTL中存在不受MHC抗原限制的杀伤细胞，如NK细胞。
由于TNF-α的抗肿瘤及对CTL的正向调节作用而备受重视，但CTL在未活化前自分泌细胞因子能力很差。本研究表明，抗HLA-ABC单抗虽不能完全阻断CTL的杀伤活性，却可以完全阻断CTL分泌TNF-α。用HLA-DR抗原不能刺激CTL释放TNF-α，说明本研究中CTL释放的TNF-α主要为CD8+T细胞分泌。
以上说明，表达HLA-ABC和DR抗原的口腔鳞癌细胞诱导的CTL中存在MHC-I类抗原限制的TC细胞、MHC-Ⅱ类抗原限制性的TH细胞及非MHC限制性的NK细胞，它们共同完成对自体肿瘤的杀伤功能。
基金项目：湖北省自然科学基金资助项目(95129)
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参考文献
1，Vora AR, Rodgers S, Parker AJ, et al. An immunohistochemical study of altered immunomodulatory molecule expression in head and neck squamous cell carcinoma. Br J Cancer, 1997,76: 836-844.
2，Mattijsen V, De Mulder PHM,Schalkwijk L,et al. HLA antigen expression routinely processed head and neck squamous cell carcinoma primary lesions of different sites. Int J Cancer, 1991 Suppl 6:95-100.
, 百拇医药 3，Houck JR, Sexton FM, Zajdel G . HLA class I and class Ⅱantigen expression on squamous cell carcinoma of the head and neck . Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 1990,116:1 181-1 185.
4，吴厚生，谢琪，姜小玲，等. 3 H-TdR释放法测量细胞介导的细胞毒功能.上海免疫学杂志，1987，7：230-233.
5，Fossati G, Taramelli D, Balsari A, et al. Primary but not metastatic human melanomas expressing DR antigens stimulate autologous lymphocytes. Int J Cancer, 1984,33:591-597.
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6，Okada K, Yasumura S, Muller-Fleckenstein I, et al. Interactions between autologous CD4+ and CD8+ T lymphocytes and human squamous cell carcinoma of the head and neck. Cell Immunol, 1997,177: 35-48.
7，Katsumoto Y, Monden T,Takoda T,et al. Analysis of cytotoxic activity of the CD4+ T lymphocytes generated by local immunotherapy . Br J Cancer, 1996,73:110-116.
(收稿日期：1999-08-20), 百拇医药