复方丹参注射液球后注射对大鼠视网膜缺血再灌注损伤防护的实验研究
作者：李岱 陈长征 易明望 管志华
单位：湖北医科大学附属第二医院眼科，武汉 430071
关键词：视网膜；缺血再灌注；丹参
中国中医眼科杂志000402 [摘 要]目的 观察复方丹参注射液球后注射对视网膜缺血再灌注(retinal ischemia reperfusion, RIR)损伤的防护作用。方法 应用前房灌注液体升高眼内压的方法建立大鼠RIR模型并随机分为防护组和对照组。防护组大鼠损伤前30min球后注射复方丹参注射液0.05ml，对照组球后注射生理盐水0.05ml。两组均缺血60min后分别在恢复灌注30min、24h和72h进行视网膜电图(ERG)和视网膜光学显微镜组织学观察。结果 防护组ERG标准化b波振幅均高于对照组(P<0.01)。防护组组织病理损害与对照组相比明显较轻。结论 复方丹参注射液球后注射对RIR损伤有一定的防护作用。
, 百拇医药
中图分类号：R285.5；R770.43 文献标识码：A
文章编号：1002-4379(2000)04-0191-04
A experimental research on protective effect of compound injection salvia miltiorrhiza for damage of retinal ischemia reperfusion in rat retinopathy with retrobulbar injection
LI Dai，CHEN Changzheng,YI Mingwang，et al.
(Department of Ophthalmology,Second Affiliated Hospital,Huben Medical University,Wuhan 430071,China)
, 百拇医药
[Abstract]OBJECTIVE To investigate the protective effect of compound injection salvia miltiorrhiza retrobulbar injection in retinal ischemia reperfusion(RIR) applied by retrobulbar injection. METHODS Increasing the intraocular pressure with anterior chambers infused liquid induced the models of Retinal ischemia reperfusion of rats, and they were random divided into defended group and control group. A retrobulbar injection of compound injection salvia miltiorrhiza was performed at a dose of 0.05ml at 30 min before retinal ischemia in the defended group and normal saline 0.05ml in the control group. Their elctroretinography (ERG) and light microscopy observation were performed at 30 minutes, 24 hours or 72 hours in 60 minutes when ischemia had been persisted. RESULTS The amplitudes of standardization b-wave was higher in the defended group than in the control group (P<0.01). The histopathologic damages of retina were not severe in the defend group than in the control group.CONCLUSION Retrobulbar injection of compound injection salvia miltiorrhiza may be effect on protection from retinal damages induced by RIR.
, 百拇医药
[Key words]retina;ischemia reperfusion；salvia miltiorrhiza
视网膜血管阻断性疾病、高眼压及影响视网膜血流量的眼科手术等都可引起视网膜缺血再灌注的损伤(retinal ischemia reperfusion,RIR)，从而导致视网膜神经组织的损伤，引起永久性视力障碍和伤残，因此有关RIR的防治已普受关注。中药制剂种类繁多，成份复杂，作用广泛，且副作用少，开发中药防治RIR是一个方向。丹参是我国传统的活血化瘀类药物，近几年来，匡培根等〔1～3〕通过一系列试验证实丹参对脑缺血再灌注损伤具有防护作用，而视网膜为中枢神经系统周边部分，是中枢神经系统一个简化模式，从理论推测丹参对RIR有一定的防治作用，为此于1999年3月～7月我们采用复方丹参注射液作为保护剂，以球后注射给药，对RIR的动物模型进行防护实验，通过观察视网膜电图、组织形态等指标的变化，探讨复方丹参注射液球后注射对RIR的防护作用，旨为临床提供实验依据。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物及模型制做：取雌雄不限SD大鼠，体重175～250?g，由湖北医科大学动物实验中心提供，饲养在正常昼夜周期的环境中。1%戊巴比妥钠30?mg/kg腹腔注射麻醉(于球后注射前完成)。将连接生理盐水瓶输液管的7号头皮针刺入大鼠前房，然后升高输液瓶至与动物垂直距离150cm外，此高度在眼内形成14.63?kPa眼压。外观可见球结膜苍白。+8～+10检眼镜检查可见：眼底血管断流，视网膜苍白水肿。实验过程中利用室内空调，维持动物体温36.5℃～37℃，并间断用抗生素点眼维持角膜湿润和防止感染。复方丹参注射液为2mg/ml，由上海第一制药厂提供。
1.1.2 实验分组：SD大鼠48只随机分成6组，如表1所示。每只大鼠的一眼为处理眼，另一眼则为正常对照眼。所有动物缺血前测双眼ERG，测定后进行缺血再灌注处理，且分别在再灌注30min、24h或72h进行相应的ERG、LM等检测。
, http://www.100md.com
实验分组：Ⅰ组即复方丹参防护组：球后注射复方丹参注射液0.05ml,30min后缺血60min，再灌注30min/24h/72h；Ⅱ组即生理盐水对照组：球后注射生理盐水0.05ml,30min后缺血60min，再灌注30min/24h/72h。
1.2 观察指标及测定方法
ERG测定〔4〕：大鼠暗适应过夜后，用1%戊巴比妥钠麻醉，0.5%托吡卡胺点眼散大瞳孔，固定头部，测量眼安放自制螺旋状银丝电极，电极尽量与角膜最大接触，避免产生尖端接触，电极线固定，参考电极置于舌头，接地电极置于背部皮下组织，整个操作过程在暗红光下进行。操作时白光闪耀，反应持续10μs,光强度10.02cd/(m2*s)，每个时间点至少测量3次，间歇期间点0.9%生理盐水，防止发生暴露性角膜炎，室温维持在20℃～25℃。记录b波振幅与处理前b波振幅比值，再用对侧对照眼的比值进行标化所得的百分比，以期消除温度等各方面因素影响。
, 百拇医药
光镜切片制作；断头处死大鼠，迅速摘除眼球，玻璃体腔内注射AGFD溶液(丙酮50ml、冰酸2ml、甲醛4ml、蒸馏水3ml)0.1ml，后浸入AGFD溶液中固定72h，每日更换固定液，再用火棉胶包埋。3d后处理，眼球纵轴方向切片，HE染色。
1.3 统计分析
ERG b波经对侧眼标化后用基线百分比表示，数据以均数±标准差表示，均数之间比较用成组设计的其检验。
2 结果
2.1 ERG测定
Ⅱ组相应时段b波恢复明显低于Ⅰ组(表1、图1～图3)。
表1 复方丹参注射液对视网膜缺血再灌注损伤的
视网膜电图的影响(基线百分比) 组 别
, 百拇医药
眼数
缺血再灌注时间
30min
24h
72h
丹参防护组
8
80.12±4.04
85.66±2.80
95.40±7.87
生理盐水
对照组
8
, 百拇医药
7.69±1.29
15.78±2.61
12.80±2.59
注：不同时间两组比较：t=48.42，51.38，26.52 均P<0.001
图1 正常视网膜电图b波(X轴为时间，20ms/DIU,Y轴为b波振幅，48.82μV/DIU下同)
图2 生理盐水对照组，缺血60min
再灌注24h视网膜电图b波
, http://www.100md.com
图3 丹参保护组，缺血60min再灌注24h视网膜电图b波
2.2 光镜改变
正常的视网膜结构清晰完整(图4)。生理盐水对照组：色素上皮变成球形粘附于感光细胞外节的游离界，视细胞外节肿胀、疏松、空泡化。内颗粒层肿胀，胞核疏松、部分丢失。神经节细胞减少(图5)。保护组：视网膜各层结构较清晰，外节稍疏松肿胀但较完整，具有较高密度的内节，各层表现轻微的肿胀，未见明显的色素上皮改变(图6)。3 讨论
用升高眼压致视网膜血管断流以建立视网膜缺血模型的方法还用于兔、猫等动物模型。提高输液瓶高度至150cm可形成14.63 kPa的压力，此压力接近SD大鼠的体循环收缩压，故完全能够造成其视网膜血管断流。这种方法较结扎视网膜中央动脉简便。Buchi认为该方法引起视网膜损伤是压力因素而非缺血。为此，Buchi进行了深入研究并认为增加眼内压引起的视网膜损伤是由于缺血再灌注所致〔5，6〕。本实验结果中的病理组织改变在某种程度也可映证此点。缺血再灌注损伤的主要表现在电生理、生化、形态特征等方面的变化，其中最先发生的是电生理变化，而视网膜电图是视觉电生理中的代表性部分，业已证实：当视网膜缺血时首先影响b波，因产生b波组织对缺血影响比产生a波和c波的组织更明显〔7〕，因此有利于RIR损伤后b波恢复的药物，对RIR具有防治作用。
, http://www.100md.com
图4 正常视网膜结构清晰、完整
r：色素上皮层；o：外核层；i：内核层；g：神经节细胞层 HE ×660
图6 丹参防护组，缺血60min再灌注
24h，视网膜各层结构较清晰，外节稍
疏松肿胀但较完整，具有较高密度的内节，未见明显的色素上皮改变 HE ×660
图5 生理盐水对照组，缺血再灌注
60min再灌注24h，色素上皮变成球形
, 百拇医药
粘附于感光细胞外节的游离界，视细
胞外节肿胀、疏松、空泡化，内颗粒
层肿胀，胞核疏松部分丢失，神经节
细胞减少 HE ×660
结果表明：于缺血前球后注射复方丹参注射液，可显著提高b波振幅的恢复，所需丹参剂量较少，此种给药途径易于获得较高的细胞内药物浓度，从而较好的达到防治目的。分析其机制可能与复方丹参具有清除氧自由基、拮抗钙离子、降低一氧化氮毒性等有关〔8〕。
参考文献
1，Kuang P G,Wu Wp,Liu Jx,et al.The effect of radix salviae miltiorrhizae on substance P in cerebral ischemia:an animal experiment study[J].J Trad Chin Med,1991,11(2):123-127.
, http://www.100md.com
2，Zhang X S,Kuang P G,Wu Wp,et al.The effect of radix salviae miltiorrhizae on peroxidation of low density lipoprotein due to coppor dichloride[J].J Trad Chin Med.1994,14(3):195-201.
3，Kuang P G,Xiang J.Effect of radix salviae miltiorrhizae on EAA and IAA during cerebral ischemia in girbils:a microdialysis study[J].J Trad Chin Med,1994,14(1):45-50.
4，Stlinhorst W H,Chen E P,Hatchell P L,et al.Aclacinmycin A in the treatment of experiment proliferative Vitreo-retinopathy efficacy and toxicity in the rabit eye[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1993,34:1752-1760.
, 百拇医药
5，Buchi E R,Suiviazdis I,Fu J.Pressue-induced retinal ischemia in rat:an experirental model for quantitative study[J].Opthalmologica,1991,203:138-147.
6，Buchi E R.Cell death in the rat retina after pressure induced ischemia-reperfusion insult:an eleetron microscopic study I.Ganglion cell layer and inner nuclear layer[J].Exp Eye Res,1992,55:605-613.
7，刘哲峰.视网膜缺血的电生理变化和形态学研究的进展[J].眼科新进展，1986，6(2)：42-46.
8，刘 军，匡培根，李 斌，等.丹参对小鼠脑缺血再灌注损伤保护机制的实验研究[J].中国免疫学和神经病学杂志，1998，5(2)：79.
收稿日期：2000-06-19, 百拇医药
单位：湖北医科大学附属第二医院眼科，武汉 430071
关键词：视网膜；缺血再灌注；丹参
中国中医眼科杂志000402 [摘 要]目的 观察复方丹参注射液球后注射对视网膜缺血再灌注(retinal ischemia reperfusion, RIR)损伤的防护作用。方法 应用前房灌注液体升高眼内压的方法建立大鼠RIR模型并随机分为防护组和对照组。防护组大鼠损伤前30min球后注射复方丹参注射液0.05ml，对照组球后注射生理盐水0.05ml。两组均缺血60min后分别在恢复灌注30min、24h和72h进行视网膜电图(ERG)和视网膜光学显微镜组织学观察。结果 防护组ERG标准化b波振幅均高于对照组(P<0.01)。防护组组织病理损害与对照组相比明显较轻。结论 复方丹参注射液球后注射对RIR损伤有一定的防护作用。
, 百拇医药
中图分类号：R285.5；R770.43 文献标识码：A
文章编号：1002-4379(2000)04-0191-04
A experimental research on protective effect of compound injection salvia miltiorrhiza for damage of retinal ischemia reperfusion in rat retinopathy with retrobulbar injection
LI Dai，CHEN Changzheng,YI Mingwang，et al.
(Department of Ophthalmology,Second Affiliated Hospital,Huben Medical University,Wuhan 430071,China)
, 百拇医药
[Abstract]OBJECTIVE To investigate the protective effect of compound injection salvia miltiorrhiza retrobulbar injection in retinal ischemia reperfusion(RIR) applied by retrobulbar injection. METHODS Increasing the intraocular pressure with anterior chambers infused liquid induced the models of Retinal ischemia reperfusion of rats, and they were random divided into defended group and control group. A retrobulbar injection of compound injection salvia miltiorrhiza was performed at a dose of 0.05ml at 30 min before retinal ischemia in the defended group and normal saline 0.05ml in the control group. Their elctroretinography (ERG) and light microscopy observation were performed at 30 minutes, 24 hours or 72 hours in 60 minutes when ischemia had been persisted. RESULTS The amplitudes of standardization b-wave was higher in the defended group than in the control group (P<0.01). The histopathologic damages of retina were not severe in the defend group than in the control group.CONCLUSION Retrobulbar injection of compound injection salvia miltiorrhiza may be effect on protection from retinal damages induced by RIR.
, 百拇医药
[Key words]retina;ischemia reperfusion；salvia miltiorrhiza
视网膜血管阻断性疾病、高眼压及影响视网膜血流量的眼科手术等都可引起视网膜缺血再灌注的损伤(retinal ischemia reperfusion,RIR)，从而导致视网膜神经组织的损伤，引起永久性视力障碍和伤残，因此有关RIR的防治已普受关注。中药制剂种类繁多，成份复杂，作用广泛，且副作用少，开发中药防治RIR是一个方向。丹参是我国传统的活血化瘀类药物，近几年来，匡培根等〔1～3〕通过一系列试验证实丹参对脑缺血再灌注损伤具有防护作用，而视网膜为中枢神经系统周边部分，是中枢神经系统一个简化模式，从理论推测丹参对RIR有一定的防治作用，为此于1999年3月～7月我们采用复方丹参注射液作为保护剂，以球后注射给药，对RIR的动物模型进行防护实验，通过观察视网膜电图、组织形态等指标的变化，探讨复方丹参注射液球后注射对RIR的防护作用，旨为临床提供实验依据。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物及模型制做：取雌雄不限SD大鼠，体重175～250?g，由湖北医科大学动物实验中心提供，饲养在正常昼夜周期的环境中。1%戊巴比妥钠30?mg/kg腹腔注射麻醉(于球后注射前完成)。将连接生理盐水瓶输液管的7号头皮针刺入大鼠前房，然后升高输液瓶至与动物垂直距离150cm外，此高度在眼内形成14.63?kPa眼压。外观可见球结膜苍白。+8～+10检眼镜检查可见：眼底血管断流，视网膜苍白水肿。实验过程中利用室内空调，维持动物体温36.5℃～37℃，并间断用抗生素点眼维持角膜湿润和防止感染。复方丹参注射液为2mg/ml，由上海第一制药厂提供。
1.1.2 实验分组：SD大鼠48只随机分成6组，如表1所示。每只大鼠的一眼为处理眼，另一眼则为正常对照眼。所有动物缺血前测双眼ERG，测定后进行缺血再灌注处理，且分别在再灌注30min、24h或72h进行相应的ERG、LM等检测。
, http://www.100md.com
实验分组：Ⅰ组即复方丹参防护组：球后注射复方丹参注射液0.05ml,30min后缺血60min，再灌注30min/24h/72h；Ⅱ组即生理盐水对照组：球后注射生理盐水0.05ml,30min后缺血60min，再灌注30min/24h/72h。
1.2 观察指标及测定方法
ERG测定〔4〕：大鼠暗适应过夜后，用1%戊巴比妥钠麻醉，0.5%托吡卡胺点眼散大瞳孔，固定头部，测量眼安放自制螺旋状银丝电极，电极尽量与角膜最大接触，避免产生尖端接触，电极线固定，参考电极置于舌头，接地电极置于背部皮下组织，整个操作过程在暗红光下进行。操作时白光闪耀，反应持续10μs,光强度10.02cd/(m2*s)，每个时间点至少测量3次，间歇期间点0.9%生理盐水，防止发生暴露性角膜炎，室温维持在20℃～25℃。记录b波振幅与处理前b波振幅比值，再用对侧对照眼的比值进行标化所得的百分比，以期消除温度等各方面因素影响。
, 百拇医药
光镜切片制作；断头处死大鼠，迅速摘除眼球，玻璃体腔内注射AGFD溶液(丙酮50ml、冰酸2ml、甲醛4ml、蒸馏水3ml)0.1ml，后浸入AGFD溶液中固定72h，每日更换固定液，再用火棉胶包埋。3d后处理，眼球纵轴方向切片，HE染色。
1.3 统计分析
ERG b波经对侧眼标化后用基线百分比表示，数据以均数±标准差表示，均数之间比较用成组设计的其检验。
2 结果
2.1 ERG测定
Ⅱ组相应时段b波恢复明显低于Ⅰ组(表1、图1～图3)。
表1 复方丹参注射液对视网膜缺血再灌注损伤的
视网膜电图的影响(基线百分比) 组 别
, 百拇医药
眼数
缺血再灌注时间
30min
24h
72h
丹参防护组
8
80.12±4.04
85.66±2.80
95.40±7.87
生理盐水
对照组
8
, 百拇医药
7.69±1.29
15.78±2.61
12.80±2.59
注：不同时间两组比较：t=48.42，51.38，26.52 均P<0.001
图1 正常视网膜电图b波(X轴为时间，20ms/DIU,Y轴为b波振幅，48.82μV/DIU下同)
图2 生理盐水对照组，缺血60min
再灌注24h视网膜电图b波
, http://www.100md.com
图3 丹参保护组，缺血60min再灌注24h视网膜电图b波
2.2 光镜改变
正常的视网膜结构清晰完整(图4)。生理盐水对照组：色素上皮变成球形粘附于感光细胞外节的游离界，视细胞外节肿胀、疏松、空泡化。内颗粒层肿胀，胞核疏松、部分丢失。神经节细胞减少(图5)。保护组：视网膜各层结构较清晰，外节稍疏松肿胀但较完整，具有较高密度的内节，各层表现轻微的肿胀，未见明显的色素上皮改变(图6)。3 讨论
用升高眼压致视网膜血管断流以建立视网膜缺血模型的方法还用于兔、猫等动物模型。提高输液瓶高度至150cm可形成14.63 kPa的压力，此压力接近SD大鼠的体循环收缩压，故完全能够造成其视网膜血管断流。这种方法较结扎视网膜中央动脉简便。Buchi认为该方法引起视网膜损伤是压力因素而非缺血。为此，Buchi进行了深入研究并认为增加眼内压引起的视网膜损伤是由于缺血再灌注所致〔5，6〕。本实验结果中的病理组织改变在某种程度也可映证此点。缺血再灌注损伤的主要表现在电生理、生化、形态特征等方面的变化，其中最先发生的是电生理变化，而视网膜电图是视觉电生理中的代表性部分，业已证实：当视网膜缺血时首先影响b波，因产生b波组织对缺血影响比产生a波和c波的组织更明显〔7〕，因此有利于RIR损伤后b波恢复的药物，对RIR具有防治作用。
, http://www.100md.com
图4 正常视网膜结构清晰、完整
r：色素上皮层；o：外核层；i：内核层；g：神经节细胞层 HE ×660
图6 丹参防护组，缺血60min再灌注
24h，视网膜各层结构较清晰，外节稍
疏松肿胀但较完整，具有较高密度的内节，未见明显的色素上皮改变 HE ×660
图5 生理盐水对照组，缺血再灌注
60min再灌注24h，色素上皮变成球形
, 百拇医药
粘附于感光细胞外节的游离界，视细
胞外节肿胀、疏松、空泡化，内颗粒
层肿胀，胞核疏松部分丢失，神经节
细胞减少 HE ×660
结果表明：于缺血前球后注射复方丹参注射液，可显著提高b波振幅的恢复，所需丹参剂量较少，此种给药途径易于获得较高的细胞内药物浓度，从而较好的达到防治目的。分析其机制可能与复方丹参具有清除氧自由基、拮抗钙离子、降低一氧化氮毒性等有关〔8〕。
参考文献
1，Kuang P G,Wu Wp,Liu Jx,et al.The effect of radix salviae miltiorrhizae on substance P in cerebral ischemia:an animal experiment study[J].J Trad Chin Med,1991,11(2):123-127.
, http://www.100md.com
2，Zhang X S,Kuang P G,Wu Wp,et al.The effect of radix salviae miltiorrhizae on peroxidation of low density lipoprotein due to coppor dichloride[J].J Trad Chin Med.1994,14(3):195-201.
3，Kuang P G,Xiang J.Effect of radix salviae miltiorrhizae on EAA and IAA during cerebral ischemia in girbils:a microdialysis study[J].J Trad Chin Med,1994,14(1):45-50.
4，Stlinhorst W H,Chen E P,Hatchell P L,et al.Aclacinmycin A in the treatment of experiment proliferative Vitreo-retinopathy efficacy and toxicity in the rabit eye[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1993,34:1752-1760.
, 百拇医药
5，Buchi E R,Suiviazdis I,Fu J.Pressue-induced retinal ischemia in rat:an experirental model for quantitative study[J].Opthalmologica,1991,203:138-147.
6，Buchi E R.Cell death in the rat retina after pressure induced ischemia-reperfusion insult:an eleetron microscopic study I.Ganglion cell layer and inner nuclear layer[J].Exp Eye Res,1992,55:605-613.
7，刘哲峰.视网膜缺血的电生理变化和形态学研究的进展[J].眼科新进展，1986，6(2)：42-46.
8，刘 军，匡培根，李 斌，等.丹参对小鼠脑缺血再灌注损伤保护机制的实验研究[J].中国免疫学和神经病学杂志，1998，5(2)：79.
收稿日期：2000-06-19, 百拇医药