人非小细胞肺癌中FHIT基因转录本异常的研究
作者：陈军 周清华 覃扬 孙芝琳 孙泽芳 王允 李潞 秦建军
单位：陈军 周清华 王允 秦建军(610041 成都，华西医科大学附属第一医院胸心外科)；李潞(肿瘤中心)；覃扬 孙芝琳 孙泽芳(华西医科大学生化教研室)
关键词：肺肿瘤；FHIT基因；转录表达异常；nested RT-PCR；DNA序列分析
中国肺癌杂志000402
【摘要】 目的 探讨FHIT基因转录表达异常在人肺癌发生、发展中的作用。方法 应用nested RT-PCR方法对35例人非小细胞肺癌(NSCLC)组织、癌旁组织和远癌肺组织，10例肺良性病变肺组织以及4株肺癌细胞株中FHIT基因转录表达异常进行了研究。结果 35例肺癌中14例肺癌组织存在FHIT转录表达异常，异常率为40%；在这14例癌组织转录本异常病例中，5例癌旁组织亦见转录本异常(35.71%，5/14)。远癌肺组织和肺良性病变组织均未见转录本异常。4株肺癌细胞株均检测到转录本异常。在鳞癌中FHIT基因转录本异常率(58.82%)显著高于腺癌(22.22%)(P<0.05)。FHIT基因转录本异常与肺癌细胞的分化程度、P-TNM分期、原发肿瘤大小、肿瘤部位，以及患者年龄等均无明显关系(P>0.05)。结论 本研究结果表明在NSCLC中存在FHIT基因转录表达异常。FHIT基因异常主要发生在肺鳞癌中，且可能是肺癌发生的早期分子事件。
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【中图分类号】 R734.2；Q754
A study on transcript abnormalities of FHIT gene in human non-small cell lung cancer
CHEN Jun ZHOU Qinghua QIN Yang SUN Zhilin SUN Zefang WANG Yun LI Lu QIN Jianjun (Department of Thoracocardiac Surgery, The First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu, Sichuan 610041, P.R.China)
【Abstract】 Objective To explore the role of abnormalities in RNA transcript of FHIT gene in human non-small cell lung cancer(NSCLC). Methods Transcript abnormalities of FHIT gene were detected in 35 cancer samples and their corresponding paracancer tissues and normal tissues, four lung cancer cell lines, and 10 lung tissues of benign pulmonary lesions as control by nested RT-PCR. Results Fourteen of 35 cancer tissues (40%) had abnormalities in RNA transcripts of FHIT. There were 5 paracancer tissues with transcript abnormalities of FHIT gene out of the 14 lung cancers with transcript abnormalities of FHIT gene, with an abnormality rate of 35.71%. All of 4 lung cancer cell lines had transcript abnormalities of FHIT gene. The aberrant rate of FHIT gene in squamous cell carcinoma tissues (58.82%) was significantly higher than that in adenocarcinoma tissues (22.22%) (P<0.05). No relationship was found among the transcript abnormality of the FHIT gene and differentiated degree of the tumor cell, stages of the cancer, size of the primary tumor, location of cancer, and age of the patients (P>0.05). Conclusion The results show that there are transcript abnormalities of FHIT gene in NSCLC. FHIT transcript abnormality preferentially occur in squamous cell carcinomas, and it might be the early molecular phenomenon of lung cancer.
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【Key words】 Lung neoplasms FHIT gene Transcript abnormality nested RT-PCR DNA sequence
癌基因的激活和抑癌基因的失活在肺癌的发生中起重要作用，癌基因和抑癌基因在肿瘤发生、发展中的分子机理，一直是肿瘤学领域的研究热点。然而，现有的研究表明，以往发现和鉴定的癌基因和抑癌基因绝大多数仅在肿瘤的晚期出现基因的异常，即它们的改变多是肿瘤的晚期分子事件。因此，多年来人们一直在寻找新的、在肿瘤初期甚至在癌前期就有结构和功能异常的基因。1996年，Ohta等[1]利用外显子捕获法发现的FHIT(fragile histidine triad, FHIT)基因可能就属于此类肿瘤抑制基因。
FHIT基因定位于人染色体3p14.2，全长约500kb，含10个外显子，其cDNA约1.1kb，编码由147个氨基酸组成的16.8ku蛋白质[2]。FHIT基因结构上有两大特点：一是含有t(3；8) (p14.2；q24)易位断裂点，而t(3；8)染色体易位常与早发、双侧、多灶的肾透明细胞癌相关[3]；二是含有脆性部位FRA3B，而FRA3B又是人类基因组最常见的Apaphidicolin诱导的脆性部位[4]。结构的特性决定了FHIT易发生基因异常。
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现有的研究表明FHIT异常和众多肿瘤发生相关[5]。目前关于FHIT基因对肿瘤作用的研究在不同肿瘤之间甚至同一肿瘤不同研究者的结果之间都存在着差异，支持和不支持其作为抑癌基因的观点并存。说明FHIT基因在肿瘤发生、发展中的作用尚有待更多和更深入地研究。为了探讨肺癌中是否有FHIT基因转录表达异常，FHIT基因转录表达异常与肺癌临床病理生理特征有何关系，以及肺癌中FHIT基因转录表达异常是否与肺癌的发生有关，本研究应用nested RT-PCR方法检测了35例人非小细胞肺癌(NSCLC)、10例肺良性病变肺组织以及肺癌细胞株中FHIT基因转录表达异常情况，现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 标本来源 人肺组织标本来源于华西医科大学附属第一医院胸心外科1999年4月至1999年7月手术的患者。肺组织离体后立即放入液氮保存。共收集35例肺癌标本，年龄25～80岁，平均59岁。男性28例，女性7例。鳞癌17例(低分化9例，中高分化8例；Ⅰ～Ⅱ期12例，Ⅲ～Ⅳ期5例)，腺癌18例(低分化9例，中高分化9例；Ⅰ～Ⅱ期7例，Ⅲ～Ⅳ期11例)。其中伴有淋巴结或/和不同肺叶及远处转移者12例，不伴有转移者23例。每个肺癌病例取癌灶、癌旁(离癌灶2cm，肉眼不见癌)和远离癌灶肺组织。另收集10例肺良性病变肺组织标本作对照，年龄35～64岁，平均49岁。男性6例，女性4例，其中肺结核5例，肺炎性假瘤5例。所有病例均有病理学证据，肺癌病理分期采用国际抗癌联盟(UICC)1997年修订的分期标准。
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肺癌细胞株：A549(人肺腺癌细胞)、SPAC-1(人肺腺癌细胞)和L3-8 Lewis系由我校肿瘤研究所细胞分子生物学实验室提供。PLA-801D(人肺巨细胞癌细胞)系由中科院上海细胞生物学研究所提供。
1.2 肺组织和肺癌细胞株总RNA的提取 采用酸性酚—氯仿一步法[6]。
1.3 nested RT-PCR 外引物：Exon 1-10 F 5′-CATCCTGGAAGCTTTGAAGCTCA-3′，R 5′-TCACTGGTTGAAGAA-TACAGG-3′；内引物：Exon 3-10 F 5′-TCCGTAGTGCTATCTACAT-3′，R 5′-CATGCTGATTCAGTTCCTCTTGG-3′；内参照β-actin：F 5′-GACTACCTCATGAAGATC-3′，R 5′-GATCCACATCTGCTGGAA-3′。本实验所用引物均在北京赛百盛生物工程公司合成。RT-PCR反应系统组成为：1×一步法RNA PCR缓冲液，5mmol/L MgCl2，1μmol/L dNTPs，20U RNase抑制剂，2.5U RNA逆转录酶，2.5U Taq酶，0.4μmol/L引物和1μg总RNA，加入无RNA酶的dH2O至总体积25μl。于PCR扩增仪内：50℃逆转录50分钟，94℃ 5分钟灭活逆转录酶。94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次。末次循环后72℃延伸7分钟。
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先用外引物行RT-PCR，同时亦用β-actin引物作为内参照。第一次RT-PCR结束后，取外引物循环后的PCR产物2μl，作为内引物PCR循环的模板，其循环参数同第一次PCR循环参数。之后取PCR产物10μl用2%琼脂糖电泳鉴定，并同时电泳β-actin作为内参照。
1.4 PCR产物的克隆和测序 经nested RT-PCR扩增后的产物采用玻璃乳DNA分离法纯化回收。PCR产物的克隆应用PGEM-T Vector systems (Promega)，用氯化钙法转化宿主菌JM109。重组质粒DNA均采用碱裂解法提取，聚乙二醇沉淀法纯化。质粒DNA测序由北京赛百盛生物工程公司完成。
1.5 统计学处理 采用χ2检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 肺组织总RNA鉴定 肺组织总RNA采用酸性酚—氯仿一步法提取，纯化后测定260nm/280nm OD值，比值为1.8～2.0，说明无蛋白污染。经1%琼脂电泳鉴定见总RNA有清晰的28S和18S两条条带(图1)，说明RNA无降解，无DNA污染。RNA样品溶于DEPC处理后的消毒dH2O，-70℃保存备用。
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图 1 肺组织总RNA电泳图
Fig 1 Agarose electrophoresis of pulmonary total RNA
Lane 1: Primary cancer tissue; Lane 2: Para-cancer tissue; Lane 3: Corresponding normal lung tissue; Lane 4: Lymph node tissue
2.2 FHIT基因在人肺癌中的转录本表达 经nested RT-PCR扩增后FHIT基因转录本片段大小为700bp，β-actin经RT-PCR扩增后片段大小为500bp，与理论值相符。在35例肺癌患者中，有14例发生了FHIT基因转录本的异常表达，转录本异常率为40%(14/35)。FHIT基因转录本异常在肿瘤组织中主要表现为经nested RT-PCR扩增的产物电泳后，肿瘤组织有正常大小的条带和异常大小条带并存，异常条带以小于700bp为主，多出现在300～400bp；在本组病例中有2例肿瘤组织仅出现异常的条带，未见正常大小条带；有一例转录本表现为完全缺失，而相应的远癌肺组织未见异常。35例患者的远癌肺组织和肺良性病变组织扩增均获得成功，且未见有异常条带存在，但在14例癌组织转录本异常病例中，5例癌旁组织亦见异常的转录条带，占该14例患者的35.71%(5/14)(图2，表1)。
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图 2 肺癌中FHIT基因转录表达
Fig 2 Transcription expression of FHIT gene in human lung cancer
(A): Expression of the FHIT gene by nested RT-PCR analysis in human lung cancer. M: DL 2000 DNA marker; T: tumors; P:para-tumors; N:matched normal tissues; A: A549 cell line; S: SPAC-1 cell line. T1 indicated a complete deletion, P1 showed a normal transcript and a abnormal band (～300bp); T2 presented two abnormal bands of ～360bp and～380-400bp and a little normal transcript. A549 cell line also showed a complete deletion, and SPCA-1 cell line had only a abnormal sized product (～360bp).
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(B): Expression of the β-actin gene by RT-PCR analysis of corresponding tissues in Fig 2(A). Every example showed a normal-sized product(500bp).
(C): FHIT amplified products by nested RT-PCR. T1 showed a normal-sized product and a abnormal band of ～400bp; T2 showed only a abnormal bands of-500bp. The corresponding expression of β-actin was not showed.
表 1 14例FHIT基因转录本异常肺癌患者的病理生理特征
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Tab 1 Pathophysiological characteristics in 14 patients with lung cancer with abnormal transcripts of FHIT gene Case
Age/sex
Smoking
Location
Histology
Metastasis
Stage
RT-PCR results
1
, http://www.100md.com 55/M
Yes
P
SCC，poor
Lymph node
T3N2M0,ⅢA
～360bp，N
2
59/M
Yes
P
SCC,mod
No
, 百拇医药
T3N1M0,ⅢA
～500bp
3
54/M
Yes
C
ACC,mod-well
Lymph node
T3N2M0,ⅢA
～300bp，N
4
56/M
, http://www.100md.com Yes
C
SCC,poor
No
T3N0M0,ⅡB
～360,380bp,N
5
60/M
No
P
ACC,mod
Lymph node,different lobe
, 百拇医药 T2N2M1,Ⅳ
～360bp,N
6
64/M
Yes
P
SCC,mod
No
T2N0M0,ⅠB
～380bp,N
7
43/F
No
, 百拇医药
P
ACC poor
Lymph node,different lobe
T3N2M1,Ⅳ
～360bp,N
8
59/M
No
C
SCC,ppor
No
T4N0M0,ⅢB
, 百拇医药
～360bp,N
9
58/M
Yes
C
SCC,mod
No
T3N0M0,ⅡB
～300bp,N
10
57/M
Yes
P
, 百拇医药
SCC,mod
No
T3N0M0,ⅡB
～400bp,N
11
66/M
Yes
P
SCC,mod
Lymph node
T3N2M0,ⅢA
～400bp,N
, http://www.100md.com 12
64/M
Yes
P
SCC,poor
No
T2N0M0,ⅠB
～500bp
13
59/M
Yes
P
SCC,poor
, 百拇医药
No
T3N0M0,ⅡB
Complete deletion
14
51/F
No
P
ACC,poor
No
T2N0M0,ⅠB
～400bp,N
M：Male; F:Female; P:Periphery; C:Center; N:Normal sized products; ACC: Adenocarcinoma; SCC: Squamous cell carcinoma 4株肺癌细胞株均显示转录本异常，其中Lewis和A549表现为转录本的完全缺失，SPAC-1转录本仅检测到一条～360bp左右的异常带，PAL-801D转录本除有一条正常条带外，还有一条约～400bp的异常条带。
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2.3 PCR产物克隆和测序 将测序结果用NCBI(National Center for Biotechnology Information)上的Blast程序与FHIT基因全长cDNA比较，分析测序的结果，图3所示为31号病例肺癌组织的异常转录条带丢失了外显子5～7。
图 3 FHIT异常带测序图(31号)显示外显子5-8丢失，外显子4与外显子8直接连接
Fig 3 Sequence of FHIT transcript product of No.31 case. Arrow indicated loss of exons 5-8 and junctions between exons 4 and 8.
2.4 FHIT基因转录本异常与肺癌患者临床病理特征的关系(表2) FHIT基因转录异常率在鳞癌组织中(58.82%，10/17)明显高于腺癌(22.22%，4/18)，二组间比较差异具有显著性(P<0.05)。而FHIT基因转录本异常与肺癌病理分期、细胞分化程度、原发肿瘤大小、有无转移和部位，以及其它临床病理生理特征之间均无明显关系(P>0.05)。
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表 2 35例肺癌患者FHIT基因异常与临床病理特征的关系
Tab 2 The relationship between the abnormal expression of FHIT gene and
the clinicopathological characteristics of 35 patients with lung cancer Characteristics
FHIT
Statistical significance
Abnormal
(n＝14)
Normal
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(n＝21)
Age(years,
±s)
58±3
60±4
NS
Sex
NS
Female
2
Male
12
Tumor size(cm,±s)
, 百拇医药
5.4±3
5.0±2
NS
Localization
NS
Center
4
6
Peripheral
10
15
Histological classification
, http://www.100md.com
P<0.05
Squamous cell carcinoma
10
7
Adenocarcinoma
4
14
Differentiated degree
NS
Poorly
7
11
, http://www.100md.com
Mod-well
7
10
TNM
NS
Ⅰ+Ⅱ
8
11
Ⅲ+Ⅳ
6
10
Metastasis
NS
, 百拇医药
With
5
7
Without
9
14
NS：not significant
3 讨论
自1996年Ohta发现FHIT基因以来，由于FHIT覆盖染色体3p上的脆性位点FRA3B和家族性肾细胞癌
t(3；8)断裂点，而脆性位点与肿瘤发生的关系一直是人们关注的热点。关于FHIT是否作为拟定的抑癌基因，目前的争论点主要有：肿瘤组织中是否存在其异常，以及FHIT基因异常是否同时存在于正常组织和肿瘤组织中，即FHIT异常仅是结构上的异常，还是伴有功能上的异常。
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本研究通过nested RT-PCR扩增FHIT外显子1～10区域来检测FHIT基因的转录本异常情况，结果在35例肺癌中有14例发生了转录本的异常(40%)，相应的远癌肺组织和肺良性病变组织中均未见FHIT的转录异常，而4株肺癌细胞株均检测到FHIT基因转录本异常，从而提示了在肺癌中存在FHIT基因转录表达的异常。在14例有FHIT基因转录异常的患者中，5例癌旁肺组织亦检测到FHIT的转录异常，占该14例患者的35.71%，这进一步提示了FHIT基因的异常可能发生在肺癌的早期。且在19例Ⅰ～Ⅱ期肺癌中，有8例出现FHIT基因转录本异常，也表明了FHIT基因转录本异常可能是肺癌发生发展的早期分子事件。
1996年，Sozzi等[7]报道80%的小细胞肺癌(SCLC)和40%的NSCLC存在FHIT基因的mRNA转录异常，76%存在FHIT基因的杂合缺失。SCLC患者FHIT基因转录本缺失有两种类型：第一种为丢失外显子3～7，第二种为丢失外显子4～8，两者都丢失外显子5，但第二种类型常包含外显子8。而NSCLC的患者转录本异常类型较多，但有一共同点是丢失的区域常包含外显子5。在本研究14例FHIT基因转录异常的病例中，FHIT基因转录本的异常形式主要表现为PCR扩增后既有正常大小的条带，又出现异常条带；其中有两例只有～500bp异常条带，而无正常条带；一例表现为转录本的完全缺失；一例转录本异常条带测序示肿瘤组织丢失FHIT基因外显子5～7。
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分析FHIT基因转录本异常与肺癌患者的临床病理生理特征发现，在鳞癌中FHIT基因的转录本异常率(58.82%)明显高于腺癌(22.22%) (P<0.05)，提示FHIT基因转录本异常主要发生在鳞癌中。本研究结果显示，FHIT基因转录本异常与肺癌TNM分期、细胞分化程度、原发肿瘤大小、有无转移，以及肿瘤部位等均无明显关系(P>0.05)。1997年Sozzi等[8]报道，吸烟组80%存在FHIT基因一个或两个微卫星灶缺失，而不吸烟组仅有23%(P<0.01)，提示FHIT基因可能是烟草致肺癌的靶点。
目前，关于FHIT基因的作用机理尚未完全阐明，FHIT蛋白质可能主要参与调节体内Ap4A和Ap3A的量变化。而Ap4A和Ap3A一方面可增强DNA聚合酶的活性，利于DNA的合成和增殖[9]，另一方面也被认为是细胞对环境应激时的报警物质[10]。FHIT基因的异常改变了Ap4A和Ap3A的代谢，从而影响了这些重要的生理功能。
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本研究受国家自然科学基金(39870299)、国家教委博士点基金(9849)资助
参考文献
1，Ohta M, Inoue H, Cotticelli MG, et al. The FHIT gene, spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinoma-associated t(3；8) breakpoint, is abnormal in digestive tract cancer. Cell,1996,84(2)∶587-597.
2，Huang Y, Garrison PN, Barnes LD. Cloning of the Schizosaccharomyces pombe gene encoding diadenosine 5′, 5 P1, P4-tetraphosphate (Ap4A) asymmetrical hydrolase: sequence similarity with the histidine triad (HIT) protein family. Biochem J,1995,312(pt3)∶925-932.
, 百拇医药
3，Cohen AJ, Li FP, Berg S, et al. Hereditary renal cell carcinoma associated with achromosomal translocation. N Eng J Med,1979,301(11)∶592-595.
4，Glover TW, Berger C, Coyle J, et al. DNA polymerase a alpha inhibition by aphidicolin induces gaps and breaks at common fragile sites in human chromosomes. Hum Genet, 1984,67(2)∶136-142.
5，陈军，周清华. FHIT基因与肺癌.中国肺癌杂志，2000,3(1)∶71-74.
6，Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987,162(1)∶156-159.
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7，Sozzi G, Veronese ML, Negrini M, et al. The FHIT gene at 3p14.2 is abnormal in lung cancer. Cell, 1996,85(1)∶17-26.
8，Sozzi G, Sard L, De Gregorio L, et al. Association between cigarette smoking and FHIT gene alterations in lung cancer. Cancer Res, 1997,57(11)∶5207-5212.
9，Vartanian A, Narovlyansky A, Amchenkova A, et al. Interferons induce accumulation of diadenosine triphosphate (Ap3A) in human cultured cells. FEBS Lett,1996,381(1-2)∶32-34.
10，Segal E, Le Pecq JB. Relationship between cellular diadenosine 5′, 5-P1, P4 tetraphosphate level, cell density, cell growth stimulation and toxic stresses. Exp Cell Res,1986,167(1)∶119-126.
(收稿：1999-10-13，修回：2000-03-20), 百拇医药
单位：陈军 周清华 王允 秦建军(610041 成都，华西医科大学附属第一医院胸心外科)；李潞(肿瘤中心)；覃扬 孙芝琳 孙泽芳(华西医科大学生化教研室)
关键词：肺肿瘤；FHIT基因；转录表达异常；nested RT-PCR；DNA序列分析
中国肺癌杂志000402
【摘要】 目的 探讨FHIT基因转录表达异常在人肺癌发生、发展中的作用。方法 应用nested RT-PCR方法对35例人非小细胞肺癌(NSCLC)组织、癌旁组织和远癌肺组织，10例肺良性病变肺组织以及4株肺癌细胞株中FHIT基因转录表达异常进行了研究。结果 35例肺癌中14例肺癌组织存在FHIT转录表达异常，异常率为40%；在这14例癌组织转录本异常病例中，5例癌旁组织亦见转录本异常(35.71%，5/14)。远癌肺组织和肺良性病变组织均未见转录本异常。4株肺癌细胞株均检测到转录本异常。在鳞癌中FHIT基因转录本异常率(58.82%)显著高于腺癌(22.22%)(P<0.05)。FHIT基因转录本异常与肺癌细胞的分化程度、P-TNM分期、原发肿瘤大小、肿瘤部位，以及患者年龄等均无明显关系(P>0.05)。结论 本研究结果表明在NSCLC中存在FHIT基因转录表达异常。FHIT基因异常主要发生在肺鳞癌中，且可能是肺癌发生的早期分子事件。
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【中图分类号】 R734.2；Q754
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CHEN Jun ZHOU Qinghua QIN Yang SUN Zhilin SUN Zefang WANG Yun LI Lu QIN Jianjun (Department of Thoracocardiac Surgery, The First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu, Sichuan 610041, P.R.China)
【Abstract】 Objective To explore the role of abnormalities in RNA transcript of FHIT gene in human non-small cell lung cancer(NSCLC). Methods Transcript abnormalities of FHIT gene were detected in 35 cancer samples and their corresponding paracancer tissues and normal tissues, four lung cancer cell lines, and 10 lung tissues of benign pulmonary lesions as control by nested RT-PCR. Results Fourteen of 35 cancer tissues (40%) had abnormalities in RNA transcripts of FHIT. There were 5 paracancer tissues with transcript abnormalities of FHIT gene out of the 14 lung cancers with transcript abnormalities of FHIT gene, with an abnormality rate of 35.71%. All of 4 lung cancer cell lines had transcript abnormalities of FHIT gene. The aberrant rate of FHIT gene in squamous cell carcinoma tissues (58.82%) was significantly higher than that in adenocarcinoma tissues (22.22%) (P<0.05). No relationship was found among the transcript abnormality of the FHIT gene and differentiated degree of the tumor cell, stages of the cancer, size of the primary tumor, location of cancer, and age of the patients (P>0.05). Conclusion The results show that there are transcript abnormalities of FHIT gene in NSCLC. FHIT transcript abnormality preferentially occur in squamous cell carcinomas, and it might be the early molecular phenomenon of lung cancer.
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【Key words】 Lung neoplasms FHIT gene Transcript abnormality nested RT-PCR DNA sequence
癌基因的激活和抑癌基因的失活在肺癌的发生中起重要作用，癌基因和抑癌基因在肿瘤发生、发展中的分子机理，一直是肿瘤学领域的研究热点。然而，现有的研究表明，以往发现和鉴定的癌基因和抑癌基因绝大多数仅在肿瘤的晚期出现基因的异常，即它们的改变多是肿瘤的晚期分子事件。因此，多年来人们一直在寻找新的、在肿瘤初期甚至在癌前期就有结构和功能异常的基因。1996年，Ohta等[1]利用外显子捕获法发现的FHIT(fragile histidine triad, FHIT)基因可能就属于此类肿瘤抑制基因。
FHIT基因定位于人染色体3p14.2，全长约500kb，含10个外显子，其cDNA约1.1kb，编码由147个氨基酸组成的16.8ku蛋白质[2]。FHIT基因结构上有两大特点：一是含有t(3；8) (p14.2；q24)易位断裂点，而t(3；8)染色体易位常与早发、双侧、多灶的肾透明细胞癌相关[3]；二是含有脆性部位FRA3B，而FRA3B又是人类基因组最常见的Apaphidicolin诱导的脆性部位[4]。结构的特性决定了FHIT易发生基因异常。
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现有的研究表明FHIT异常和众多肿瘤发生相关[5]。目前关于FHIT基因对肿瘤作用的研究在不同肿瘤之间甚至同一肿瘤不同研究者的结果之间都存在着差异，支持和不支持其作为抑癌基因的观点并存。说明FHIT基因在肿瘤发生、发展中的作用尚有待更多和更深入地研究。为了探讨肺癌中是否有FHIT基因转录表达异常，FHIT基因转录表达异常与肺癌临床病理生理特征有何关系，以及肺癌中FHIT基因转录表达异常是否与肺癌的发生有关，本研究应用nested RT-PCR方法检测了35例人非小细胞肺癌(NSCLC)、10例肺良性病变肺组织以及肺癌细胞株中FHIT基因转录表达异常情况，现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 标本来源 人肺组织标本来源于华西医科大学附属第一医院胸心外科1999年4月至1999年7月手术的患者。肺组织离体后立即放入液氮保存。共收集35例肺癌标本，年龄25～80岁，平均59岁。男性28例，女性7例。鳞癌17例(低分化9例，中高分化8例；Ⅰ～Ⅱ期12例，Ⅲ～Ⅳ期5例)，腺癌18例(低分化9例，中高分化9例；Ⅰ～Ⅱ期7例，Ⅲ～Ⅳ期11例)。其中伴有淋巴结或/和不同肺叶及远处转移者12例，不伴有转移者23例。每个肺癌病例取癌灶、癌旁(离癌灶2cm，肉眼不见癌)和远离癌灶肺组织。另收集10例肺良性病变肺组织标本作对照，年龄35～64岁，平均49岁。男性6例，女性4例，其中肺结核5例，肺炎性假瘤5例。所有病例均有病理学证据，肺癌病理分期采用国际抗癌联盟(UICC)1997年修订的分期标准。
, 百拇医药
肺癌细胞株：A549(人肺腺癌细胞)、SPAC-1(人肺腺癌细胞)和L3-8 Lewis系由我校肿瘤研究所细胞分子生物学实验室提供。PLA-801D(人肺巨细胞癌细胞)系由中科院上海细胞生物学研究所提供。
1.2 肺组织和肺癌细胞株总RNA的提取 采用酸性酚—氯仿一步法[6]。
1.3 nested RT-PCR 外引物：Exon 1-10 F 5′-CATCCTGGAAGCTTTGAAGCTCA-3′，R 5′-TCACTGGTTGAAGAA-TACAGG-3′；内引物：Exon 3-10 F 5′-TCCGTAGTGCTATCTACAT-3′，R 5′-CATGCTGATTCAGTTCCTCTTGG-3′；内参照β-actin：F 5′-GACTACCTCATGAAGATC-3′，R 5′-GATCCACATCTGCTGGAA-3′。本实验所用引物均在北京赛百盛生物工程公司合成。RT-PCR反应系统组成为：1×一步法RNA PCR缓冲液，5mmol/L MgCl2，1μmol/L dNTPs，20U RNase抑制剂，2.5U RNA逆转录酶，2.5U Taq酶，0.4μmol/L引物和1μg总RNA，加入无RNA酶的dH2O至总体积25μl。于PCR扩增仪内：50℃逆转录50分钟，94℃ 5分钟灭活逆转录酶。94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次。末次循环后72℃延伸7分钟。
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先用外引物行RT-PCR，同时亦用β-actin引物作为内参照。第一次RT-PCR结束后，取外引物循环后的PCR产物2μl，作为内引物PCR循环的模板，其循环参数同第一次PCR循环参数。之后取PCR产物10μl用2%琼脂糖电泳鉴定，并同时电泳β-actin作为内参照。
1.4 PCR产物的克隆和测序 经nested RT-PCR扩增后的产物采用玻璃乳DNA分离法纯化回收。PCR产物的克隆应用PGEM-T Vector systems (Promega)，用氯化钙法转化宿主菌JM109。重组质粒DNA均采用碱裂解法提取，聚乙二醇沉淀法纯化。质粒DNA测序由北京赛百盛生物工程公司完成。
1.5 统计学处理 采用χ2检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 肺组织总RNA鉴定 肺组织总RNA采用酸性酚—氯仿一步法提取，纯化后测定260nm/280nm OD值，比值为1.8～2.0，说明无蛋白污染。经1%琼脂电泳鉴定见总RNA有清晰的28S和18S两条条带(图1)，说明RNA无降解，无DNA污染。RNA样品溶于DEPC处理后的消毒dH2O，-70℃保存备用。
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图 1 肺组织总RNA电泳图
Fig 1 Agarose electrophoresis of pulmonary total RNA
Lane 1: Primary cancer tissue; Lane 2: Para-cancer tissue; Lane 3: Corresponding normal lung tissue; Lane 4: Lymph node tissue
2.2 FHIT基因在人肺癌中的转录本表达 经nested RT-PCR扩增后FHIT基因转录本片段大小为700bp，β-actin经RT-PCR扩增后片段大小为500bp，与理论值相符。在35例肺癌患者中，有14例发生了FHIT基因转录本的异常表达，转录本异常率为40%(14/35)。FHIT基因转录本异常在肿瘤组织中主要表现为经nested RT-PCR扩增的产物电泳后，肿瘤组织有正常大小的条带和异常大小条带并存，异常条带以小于700bp为主，多出现在300～400bp；在本组病例中有2例肿瘤组织仅出现异常的条带，未见正常大小条带；有一例转录本表现为完全缺失，而相应的远癌肺组织未见异常。35例患者的远癌肺组织和肺良性病变组织扩增均获得成功，且未见有异常条带存在，但在14例癌组织转录本异常病例中，5例癌旁组织亦见异常的转录条带，占该14例患者的35.71%(5/14)(图2，表1)。
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图 2 肺癌中FHIT基因转录表达
Fig 2 Transcription expression of FHIT gene in human lung cancer
(A): Expression of the FHIT gene by nested RT-PCR analysis in human lung cancer. M: DL 2000 DNA marker; T: tumors; P:para-tumors; N:matched normal tissues; A: A549 cell line; S: SPAC-1 cell line. T1 indicated a complete deletion, P1 showed a normal transcript and a abnormal band (～300bp); T2 presented two abnormal bands of ～360bp and～380-400bp and a little normal transcript. A549 cell line also showed a complete deletion, and SPCA-1 cell line had only a abnormal sized product (～360bp).
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(B): Expression of the β-actin gene by RT-PCR analysis of corresponding tissues in Fig 2(A). Every example showed a normal-sized product(500bp).
(C): FHIT amplified products by nested RT-PCR. T1 showed a normal-sized product and a abnormal band of ～400bp; T2 showed only a abnormal bands of-500bp. The corresponding expression of β-actin was not showed.
表 1 14例FHIT基因转录本异常肺癌患者的病理生理特征
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Tab 1 Pathophysiological characteristics in 14 patients with lung cancer with abnormal transcripts of FHIT gene Case
Age/sex
Smoking
Location
Histology
Metastasis
Stage
RT-PCR results
1
, http://www.100md.com 55/M
Yes
P
SCC，poor
Lymph node
T3N2M0,ⅢA
～360bp，N
2
59/M
Yes
P
SCC,mod
No
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T3N1M0,ⅢA
～500bp
3
54/M
Yes
C
ACC,mod-well
Lymph node
T3N2M0,ⅢA
～300bp，N
4
56/M
, http://www.100md.com Yes
C
SCC,poor
No
T3N0M0,ⅡB
～360,380bp,N
5
60/M
No
P
ACC,mod
Lymph node,different lobe
, 百拇医药 T2N2M1,Ⅳ
～360bp,N
6
64/M
Yes
P
SCC,mod
No
T2N0M0,ⅠB
～380bp,N
7
43/F
No
, 百拇医药
P
ACC poor
Lymph node,different lobe
T3N2M1,Ⅳ
～360bp,N
8
59/M
No
C
SCC,ppor
No
T4N0M0,ⅢB
, 百拇医药
～360bp,N
9
58/M
Yes
C
SCC,mod
No
T3N0M0,ⅡB
～300bp,N
10
57/M
Yes
P
, 百拇医药
SCC,mod
No
T3N0M0,ⅡB
～400bp,N
11
66/M
Yes
P
SCC,mod
Lymph node
T3N2M0,ⅢA
～400bp,N
, http://www.100md.com 12
64/M
Yes
P
SCC,poor
No
T2N0M0,ⅠB
～500bp
13
59/M
Yes
P
SCC,poor
, 百拇医药
No
T3N0M0,ⅡB
Complete deletion
14
51/F
No
P
ACC,poor
No
T2N0M0,ⅠB
～400bp,N
M：Male; F:Female; P:Periphery; C:Center; N:Normal sized products; ACC: Adenocarcinoma; SCC: Squamous cell carcinoma 4株肺癌细胞株均显示转录本异常，其中Lewis和A549表现为转录本的完全缺失，SPAC-1转录本仅检测到一条～360bp左右的异常带，PAL-801D转录本除有一条正常条带外，还有一条约～400bp的异常条带。
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2.3 PCR产物克隆和测序 将测序结果用NCBI(National Center for Biotechnology Information)上的Blast程序与FHIT基因全长cDNA比较，分析测序的结果，图3所示为31号病例肺癌组织的异常转录条带丢失了外显子5～7。
图 3 FHIT异常带测序图(31号)显示外显子5-8丢失，外显子4与外显子8直接连接
Fig 3 Sequence of FHIT transcript product of No.31 case. Arrow indicated loss of exons 5-8 and junctions between exons 4 and 8.
2.4 FHIT基因转录本异常与肺癌患者临床病理特征的关系(表2) FHIT基因转录异常率在鳞癌组织中(58.82%，10/17)明显高于腺癌(22.22%，4/18)，二组间比较差异具有显著性(P<0.05)。而FHIT基因转录本异常与肺癌病理分期、细胞分化程度、原发肿瘤大小、有无转移和部位，以及其它临床病理生理特征之间均无明显关系(P>0.05)。
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表 2 35例肺癌患者FHIT基因异常与临床病理特征的关系
Tab 2 The relationship between the abnormal expression of FHIT gene and
the clinicopathological characteristics of 35 patients with lung cancer Characteristics
FHIT
Statistical significance
Abnormal
(n＝14)
Normal
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(n＝21)
Age(years,
±s)58±3
60±4
NS
Sex
NS
Female
2
Male
12
Tumor size(cm,
±s), 百拇医药
5.4±3
5.0±2
NS
Localization
NS
Center
4
6
Peripheral
10
15
Histological classification
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P<0.05
Squamous cell carcinoma
10
7
Adenocarcinoma
4
14
Differentiated degree
NS
Poorly
7
11
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Mod-well
7
10
TNM
NS
Ⅰ+Ⅱ
8
11
Ⅲ+Ⅳ
6
10
Metastasis
NS
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With
5
7
Without
9
14
NS：not significant
3 讨论
自1996年Ohta发现FHIT基因以来，由于FHIT覆盖染色体3p上的脆性位点FRA3B和家族性肾细胞癌
t(3；8)断裂点，而脆性位点与肿瘤发生的关系一直是人们关注的热点。关于FHIT是否作为拟定的抑癌基因，目前的争论点主要有：肿瘤组织中是否存在其异常，以及FHIT基因异常是否同时存在于正常组织和肿瘤组织中，即FHIT异常仅是结构上的异常，还是伴有功能上的异常。
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本研究通过nested RT-PCR扩增FHIT外显子1～10区域来检测FHIT基因的转录本异常情况，结果在35例肺癌中有14例发生了转录本的异常(40%)，相应的远癌肺组织和肺良性病变组织中均未见FHIT的转录异常，而4株肺癌细胞株均检测到FHIT基因转录本异常，从而提示了在肺癌中存在FHIT基因转录表达的异常。在14例有FHIT基因转录异常的患者中，5例癌旁肺组织亦检测到FHIT的转录异常，占该14例患者的35.71%，这进一步提示了FHIT基因的异常可能发生在肺癌的早期。且在19例Ⅰ～Ⅱ期肺癌中，有8例出现FHIT基因转录本异常，也表明了FHIT基因转录本异常可能是肺癌发生发展的早期分子事件。
1996年，Sozzi等[7]报道80%的小细胞肺癌(SCLC)和40%的NSCLC存在FHIT基因的mRNA转录异常，76%存在FHIT基因的杂合缺失。SCLC患者FHIT基因转录本缺失有两种类型：第一种为丢失外显子3～7，第二种为丢失外显子4～8，两者都丢失外显子5，但第二种类型常包含外显子8。而NSCLC的患者转录本异常类型较多，但有一共同点是丢失的区域常包含外显子5。在本研究14例FHIT基因转录异常的病例中，FHIT基因转录本的异常形式主要表现为PCR扩增后既有正常大小的条带，又出现异常条带；其中有两例只有～500bp异常条带，而无正常条带；一例表现为转录本的完全缺失；一例转录本异常条带测序示肿瘤组织丢失FHIT基因外显子5～7。
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分析FHIT基因转录本异常与肺癌患者的临床病理生理特征发现，在鳞癌中FHIT基因的转录本异常率(58.82%)明显高于腺癌(22.22%) (P<0.05)，提示FHIT基因转录本异常主要发生在鳞癌中。本研究结果显示，FHIT基因转录本异常与肺癌TNM分期、细胞分化程度、原发肿瘤大小、有无转移，以及肿瘤部位等均无明显关系(P>0.05)。1997年Sozzi等[8]报道，吸烟组80%存在FHIT基因一个或两个微卫星灶缺失，而不吸烟组仅有23%(P<0.01)，提示FHIT基因可能是烟草致肺癌的靶点。
目前，关于FHIT基因的作用机理尚未完全阐明，FHIT蛋白质可能主要参与调节体内Ap4A和Ap3A的量变化。而Ap4A和Ap3A一方面可增强DNA聚合酶的活性，利于DNA的合成和增殖[9]，另一方面也被认为是细胞对环境应激时的报警物质[10]。FHIT基因的异常改变了Ap4A和Ap3A的代谢，从而影响了这些重要的生理功能。
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本研究受国家自然科学基金(39870299)、国家教委博士点基金(9849)资助
参考文献
1，Ohta M, Inoue H, Cotticelli MG, et al. The FHIT gene, spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinoma-associated t(3；8) breakpoint, is abnormal in digestive tract cancer. Cell,1996,84(2)∶587-597.
2，Huang Y, Garrison PN, Barnes LD. Cloning of the Schizosaccharomyces pombe gene encoding diadenosine 5′, 5 P1, P4-tetraphosphate (Ap4A) asymmetrical hydrolase: sequence similarity with the histidine triad (HIT) protein family. Biochem J,1995,312(pt3)∶925-932.
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3，Cohen AJ, Li FP, Berg S, et al. Hereditary renal cell carcinoma associated with achromosomal translocation. N Eng J Med,1979,301(11)∶592-595.
4，Glover TW, Berger C, Coyle J, et al. DNA polymerase a alpha inhibition by aphidicolin induces gaps and breaks at common fragile sites in human chromosomes. Hum Genet, 1984,67(2)∶136-142.
5，陈军，周清华. FHIT基因与肺癌.中国肺癌杂志，2000,3(1)∶71-74.
6，Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987,162(1)∶156-159.
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7，Sozzi G, Veronese ML, Negrini M, et al. The FHIT gene at 3p14.2 is abnormal in lung cancer. Cell, 1996,85(1)∶17-26.
8，Sozzi G, Sard L, De Gregorio L, et al. Association between cigarette smoking and FHIT gene alterations in lung cancer. Cancer Res, 1997,57(11)∶5207-5212.
9，Vartanian A, Narovlyansky A, Amchenkova A, et al. Interferons induce accumulation of diadenosine triphosphate (Ap3A) in human cultured cells. FEBS Lett,1996,381(1-2)∶32-34.
10，Segal E, Le Pecq JB. Relationship between cellular diadenosine 5′, 5-P1, P4 tetraphosphate level, cell density, cell growth stimulation and toxic stresses. Exp Cell Res,1986,167(1)∶119-126.
(收稿：1999-10-13，修回：2000-03-20), 百拇医药