脑内血肿吸收机制中相关因素的分析
作者：吴文斌 胡常林 李国秧 吴碧华
单位：李国秧(重庆医科大学附属第一医院)；吴文斌 胡常林 李国秧(重庆医科大学附属第二医院，重庆 400010)
关键词：
现代康复000449
目前对脑内血肿吸收机制的系统研究尚少，这也是妨碍脑内血肿治疗进步的原因之一。我们在临床上动态CT观察脑内血肿吸收情况的基础上，进行了与脑内血肿吸收有关因素的实验观察，试图表明促进脑内血肿及早吸收的关键环节。
1材料与方法
1.1大鼠脑出血模型的建立参照Rosenberg等[1]的方法定量制备脑内血肿模型。实验用Wistar大鼠，体重250～300g,以水合氯醛(0.35g/kg)腹腔注射麻醉后，按包新民等报告的定位方法，将大鼠固定于立体定位仪上。头皮正中切开皮肤，剪开骨膜，暴露前囟，前囟后1mm,中线向左旁3mm处钻孔(直径1mm)，用固定于立体定位仪上的微量进样器沿钻孔进针，深度5.8mm(即尾状核位置)，缓慢注射胶原酶Ⅶlu(以生理盐水配制成1u/μl)。动物苏醒后按Bederson[2]评分标准分别于造模后24h、48h、3d、6d、10d、14d进行神经功能缺失征评分。
, 百拇医药
1.2脑内血肿容积的变化取大鼠70只，分为正常组及造模后24h、48h、3d、6d、10d、14d组，每组10只，按该时刻点迅速处死动物，取脑，切成厚1mm的冠状片，以求积仪测出每一切片前后两面出血面积(S1、S2)，根据公式：
分别计算出血肿容积。
1.3脑含水量的变化按上述选定时间点处死动物，取脑血肿边缘部位脑灰质150mg，以称重法测定脑组织含水量。
1.4血浆凝血酶活性、抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)活性测定分别在上述选定时间点，心脏取血2ml，分离血浆，以发色底物法，严格按试剂盒说明书操作，测定血浆凝血酶活性、AT-Ⅲ活性。
1.5血浆D-二聚体(D-D)含量测定
, 百拇医药
分别按上述时间点，心脏取血2ml，分离血浆，以酶联免疫吸附双抗体夹心法，严格按试剂盒说明书操作，测定血浆D-D含量。
1.6组织病理学观察取大鼠18只，分别于造模后12h、24h、48h、3d、6d、10d、14d处死动物，迅速取脑置10%甲醛浸泡固定5d后制备石蜡切片，光镜观察组织病理学变化。
1.7微血管形态学观察另取大鼠20只，于造模后12h、24h、48h、3d、4d、6d、8d、10d、14d先以生理盐水心脏灌注，至流出液清亮时再以70%墨汁右旋糖酐灌注，直至动物全身皮肤粘膜变黑。灌毕取脑，沿血肿冠状面切下厚3mm脑片，置入10%甲醛中固定，脱水、浸蜡、包埋、切片(10μm)、封片，光镜观察病变区及其附近脑组织微血管开放情况。
1.8统计处理所得结果均以x±s表示，所有数据均经微机运用OXTAT-Ⅱ处理统计软件贮存、转换及运算。各组数据采用配对t检验，检验标准α=0.05。本实验所用试剂除胶原酶Ⅶ购自美国Sigma公司外，其余均为国产分析纯。Wistar大鼠来自本校实验动物中心。
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2结果
2.1血肿容积的变化以胶原酶造模后24h血肿容积增至最大(表1)，至第3d血肿容积无明显缩小，造模后6d血肿容积减小，提示血肿有一定吸收，至第10d血肿容积明显缩小，与24h组比较差异非常显著(P<0.001)，至14d血肿基本吸收。提示该血肿自然吸收约历时2周左右。明显吸收发生于造模后10d。2.2神经功能缺失评分变化造模后1～3d神经功能缺失最严重，全部大鼠均在Ⅲ级，无恢复，第6d40%由Ⅲ级转为Ⅱ级，第10d70%由Ⅱ级转为I级，其中20%转为0级(恢复正常)，第14d80%大鼠神经功能基本恢复。提示神经功能缺失程度与血肿容积变化密切相关(表1)。
2.3脑含水量的变化造模后脑含水量以1～3d最高，3个时点比较无显著性差异，提示脑水肿在造模后3d内无减轻。第6d脑含水量有下降，与24h组比较差异有显著性(P<0.05)，提示脑水肿开始减轻。第10d虽然脑含水量仍高于正常组，但差异无显著，第14d脑含水量已恢复正常水平。提示脑水肿伴血肿的吸收而减轻(表1)。2.4凝血酶活性的变化造模后血浆凝血酶活性在最初3d内显著增高，说明血肿内凝血机制占优势。于第6d其活性显著下降，第14d基本恢复正常，提示随着血肿的吸收凝血机制受到明显抑制(表1)。
, 百拇医药
2.5AT-Ⅲ活性变化正常组血浆AT-Ⅲ活性(58.22±0.66)%，造模后48hAT-Ⅲ活性即开始增高，这种增高的趋势可持续至血肿完全吸收即造模后14d。说明血肿形成后AT-Ⅲ活性增高与血肿容积变化相一致(表1)，AT-Ⅲ活性参与了血肿吸收机制。
2.6血浆D-D含量的变化正常组血浆D-D含量平均为0.30±0.02mg/L，在造模后48h血浆D-D含量明显增加，其增高水平可持续至第6d，第10d后其含量下降，但仍高于正常，第14d恢复接近正常水平。这种含量的变化与血肿吸收有一致趋势，说明血肿吸收过程中纤溶系统参与了血肿吸收机制(表1)。
2.7实验鼠组织病理学变化脑出血后12～48h，组织损伤处可见出血软化明显，小胶质细胞残存，无胶质细胞增生反应，第3～6d软化灶边缘出现胶质细胞反应，胶质细胞增生，少数血管内皮细胞增生，但不活跃；第8d小胶质细胞增生并形成泡沫细胞，血管增生不明显；第10～14d大量泡沫细胞形成，血管增生，脑组织软化区仍明显。在血肿形成后第8d才出现具有吞噬作用的细胞增生，第10d血肿局部微血管才出现明显增生，这些与血肿吸收机制有关的现象发生迟缓，直接影响着血肿区域的组织修复。
, 百拇医药
2.8微血管形态观察微血管造影显示脑出血后3d内血肿及周边区几乎无微血管开放与增生，为明显的无灌注缺血区，至第6～8d才出现少量微血管开放，在第10～14d微血管开放明显增多。这种微血管变化与血肿容积缩小及脑水肿减轻发生的时间一致。提示局部脑灌注的改善对血肿吸收及组织修复有重要影响。
3讨论
脑出血在脑内形成之血肿实质上是凝血过程，其血肿容积的大小与其吸收的早迟直接严重地影响着脑出血的预后。目前针对脑出血水肿的研究日益增多，但针对血肿吸收机理及治疗的研究尚不多见。临床上针对血肿的有效治疗亦缺乏长足的进步。我们在本项研究中观察了与血肿吸收有关因素的作用，以期为探索有效治疗药物与方法奠定理论基础。在本次研究中，我们采用胶原酶定量制备脑内血肿模型，动态观察了一些重要因素对血肿容积变化的作用，分析表明血浆凝血酶活性、AT-Ⅲ活性、D-D含量的变化，吞噬细胞的增生及局部微血管的开放均对血肿的吸收有重要影响。说明脑出血后体内凝血与抗凝血酶系统的变化，纤溶系统的活跃程度，吞噬细胞增生迟、早
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及数量多少以及局部血循环的改善状态，均与血肿溶解吸收早、晚、快、慢及组织修复密切相关。国内外已有报道脑出血病人凝血、纤溶系统的变化，肯定这种变化对血肿吸收有一定影响，但尚缺乏与血肿吸收相关因素的动态或系统观察[3～4]。我们的研究表明在脑出血治疗中除控制脑水肿外，针对血肿的治疗应抑制凝血酶活性，加强抗凝血酶活性，促进纤溶，同时亦应促进吞噬细胞增生，改善局部缺血的状态即改善微循环，均为促使血肿早日溶解吸收的重要环节。因此兼顾以上各方面进行综合性治疗才是有效治疗。本项研究提示寻找针对血肿治疗的药物或方法应能具有调节上述几方面重要因素的功能。
表1 造模后血肿容积、神经功能、脑含水量、凝血酶活性、AT-Ⅲ活性、D-D含量变化比较(
±s)
正常组
24h
, http://www.100md.com
48h
3d
6d
10d
14d
血肿容积
0
26.32±4.61
26.10±3.28
24.77±5.22
21.18±6.49*
1.16±0.87**
, http://www.100md.com 0.26±0.10
神经功能评分
0
2.93±0.56
2.89±0.44
2.71±0.47
1.07±0.62**
0.82±0.35**
0.35±0.27**
脑含水量
78.44±0.21
81.76±0.32**
, http://www.100md.com
81.29±0.11**
81.20±10.20**
79.76±0.20*△
78.87±0.22
78.40±0.33
凝血酶活性
0.12±0.03
0.17±0.04**
0.20±0.04**
0.20±0.03*
0.16±0.09*△
, 百拇医药
0.15±0.04
0.12±0.04
AT-Ⅲ活性
58.22±0.66
59.98±0.52
60.54±0.43*
62.54±0.31*
73.24±0.50**
62.54±0.35*
61.12±0.42*
D-D含量
, 百拇医药 0.30±0.02
0.31±0.03
0.34±0.03*
0.36±0.03*
0.47±0.02**
0.35±0.02
0.29±0.01
注：血肿容积(μl)神经功能(分)与24h组比较，脑含水量(%)(△与24h组比较P<0.05)，凝血酶活性(u/ml)(△与48h组比较P<0.05),AT-Ⅲ活性(%)，D-D含量(mg/L)与正常组比较*P<0.05,**P<0.01
参 考 文 献
, http://www.100md.com
[1]Rosenberg GA,Mun- Bryce S,Wesley M,et al.Collagenase induced inracere bral hemorrhage in rats[J].Stroke,1990, 21:801～ 807
[2]Bederson JB,Pitts LH,Nishimura MC,et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke, 1986,17:472～ 476
[3]Masuda T,Dohrmann GJ,Kwaan HC,et al.Fibrionlytic activity in experimental intracerebral hematoma[J].J Neurosurg, 1988,68:274～ 278
[4]林秀瑾.54例急性高血压性脑出血患者血液凝血因子研究[J].脑与神经疾病杂志，1998，6(1)：51～ 53
收稿：2000-01-18, 百拇医药
单位：李国秧(重庆医科大学附属第一医院)；吴文斌 胡常林 李国秧(重庆医科大学附属第二医院，重庆 400010)
关键词：
现代康复000449
目前对脑内血肿吸收机制的系统研究尚少，这也是妨碍脑内血肿治疗进步的原因之一。我们在临床上动态CT观察脑内血肿吸收情况的基础上，进行了与脑内血肿吸收有关因素的实验观察，试图表明促进脑内血肿及早吸收的关键环节。
1材料与方法
1.1大鼠脑出血模型的建立参照Rosenberg等[1]的方法定量制备脑内血肿模型。实验用Wistar大鼠，体重250～300g,以水合氯醛(0.35g/kg)腹腔注射麻醉后，按包新民等报告的定位方法，将大鼠固定于立体定位仪上。头皮正中切开皮肤，剪开骨膜，暴露前囟，前囟后1mm,中线向左旁3mm处钻孔(直径1mm)，用固定于立体定位仪上的微量进样器沿钻孔进针，深度5.8mm(即尾状核位置)，缓慢注射胶原酶Ⅶlu(以生理盐水配制成1u/μl)。动物苏醒后按Bederson[2]评分标准分别于造模后24h、48h、3d、6d、10d、14d进行神经功能缺失征评分。
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1.2脑内血肿容积的变化取大鼠70只，分为正常组及造模后24h、48h、3d、6d、10d、14d组，每组10只，按该时刻点迅速处死动物，取脑，切成厚1mm的冠状片，以求积仪测出每一切片前后两面出血面积(S1、S2)，根据公式：
分别计算出血肿容积。
1.3脑含水量的变化按上述选定时间点处死动物，取脑血肿边缘部位脑灰质150mg，以称重法测定脑组织含水量。
1.4血浆凝血酶活性、抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)活性测定分别在上述选定时间点，心脏取血2ml，分离血浆，以发色底物法，严格按试剂盒说明书操作，测定血浆凝血酶活性、AT-Ⅲ活性。
1.5血浆D-二聚体(D-D)含量测定
, 百拇医药
分别按上述时间点，心脏取血2ml，分离血浆，以酶联免疫吸附双抗体夹心法，严格按试剂盒说明书操作，测定血浆D-D含量。
1.6组织病理学观察取大鼠18只，分别于造模后12h、24h、48h、3d、6d、10d、14d处死动物，迅速取脑置10%甲醛浸泡固定5d后制备石蜡切片，光镜观察组织病理学变化。
1.7微血管形态学观察另取大鼠20只，于造模后12h、24h、48h、3d、4d、6d、8d、10d、14d先以生理盐水心脏灌注，至流出液清亮时再以70%墨汁右旋糖酐灌注，直至动物全身皮肤粘膜变黑。灌毕取脑，沿血肿冠状面切下厚3mm脑片，置入10%甲醛中固定，脱水、浸蜡、包埋、切片(10μm)、封片，光镜观察病变区及其附近脑组织微血管开放情况。
1.8统计处理所得结果均以x±s表示，所有数据均经微机运用OXTAT-Ⅱ处理统计软件贮存、转换及运算。各组数据采用配对t检验，检验标准α=0.05。本实验所用试剂除胶原酶Ⅶ购自美国Sigma公司外，其余均为国产分析纯。Wistar大鼠来自本校实验动物中心。
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2结果
2.1血肿容积的变化以胶原酶造模后24h血肿容积增至最大(表1)，至第3d血肿容积无明显缩小，造模后6d血肿容积减小，提示血肿有一定吸收，至第10d血肿容积明显缩小，与24h组比较差异非常显著(P<0.001)，至14d血肿基本吸收。提示该血肿自然吸收约历时2周左右。明显吸收发生于造模后10d。2.2神经功能缺失评分变化造模后1～3d神经功能缺失最严重，全部大鼠均在Ⅲ级，无恢复，第6d40%由Ⅲ级转为Ⅱ级，第10d70%由Ⅱ级转为I级，其中20%转为0级(恢复正常)，第14d80%大鼠神经功能基本恢复。提示神经功能缺失程度与血肿容积变化密切相关(表1)。
2.3脑含水量的变化造模后脑含水量以1～3d最高，3个时点比较无显著性差异，提示脑水肿在造模后3d内无减轻。第6d脑含水量有下降，与24h组比较差异有显著性(P<0.05)，提示脑水肿开始减轻。第10d虽然脑含水量仍高于正常组，但差异无显著，第14d脑含水量已恢复正常水平。提示脑水肿伴血肿的吸收而减轻(表1)。2.4凝血酶活性的变化造模后血浆凝血酶活性在最初3d内显著增高，说明血肿内凝血机制占优势。于第6d其活性显著下降，第14d基本恢复正常，提示随着血肿的吸收凝血机制受到明显抑制(表1)。
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2.5AT-Ⅲ活性变化正常组血浆AT-Ⅲ活性(58.22±0.66)%，造模后48hAT-Ⅲ活性即开始增高，这种增高的趋势可持续至血肿完全吸收即造模后14d。说明血肿形成后AT-Ⅲ活性增高与血肿容积变化相一致(表1)，AT-Ⅲ活性参与了血肿吸收机制。
2.6血浆D-D含量的变化正常组血浆D-D含量平均为0.30±0.02mg/L，在造模后48h血浆D-D含量明显增加，其增高水平可持续至第6d，第10d后其含量下降，但仍高于正常，第14d恢复接近正常水平。这种含量的变化与血肿吸收有一致趋势，说明血肿吸收过程中纤溶系统参与了血肿吸收机制(表1)。
2.7实验鼠组织病理学变化脑出血后12～48h，组织损伤处可见出血软化明显，小胶质细胞残存，无胶质细胞增生反应，第3～6d软化灶边缘出现胶质细胞反应，胶质细胞增生，少数血管内皮细胞增生，但不活跃；第8d小胶质细胞增生并形成泡沫细胞，血管增生不明显；第10～14d大量泡沫细胞形成，血管增生，脑组织软化区仍明显。在血肿形成后第8d才出现具有吞噬作用的细胞增生，第10d血肿局部微血管才出现明显增生，这些与血肿吸收机制有关的现象发生迟缓，直接影响着血肿区域的组织修复。
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2.8微血管形态观察微血管造影显示脑出血后3d内血肿及周边区几乎无微血管开放与增生，为明显的无灌注缺血区，至第6～8d才出现少量微血管开放，在第10～14d微血管开放明显增多。这种微血管变化与血肿容积缩小及脑水肿减轻发生的时间一致。提示局部脑灌注的改善对血肿吸收及组织修复有重要影响。
3讨论
脑出血在脑内形成之血肿实质上是凝血过程，其血肿容积的大小与其吸收的早迟直接严重地影响着脑出血的预后。目前针对脑出血水肿的研究日益增多，但针对血肿吸收机理及治疗的研究尚不多见。临床上针对血肿的有效治疗亦缺乏长足的进步。我们在本项研究中观察了与血肿吸收有关因素的作用，以期为探索有效治疗药物与方法奠定理论基础。在本次研究中，我们采用胶原酶定量制备脑内血肿模型，动态观察了一些重要因素对血肿容积变化的作用，分析表明血浆凝血酶活性、AT-Ⅲ活性、D-D含量的变化，吞噬细胞的增生及局部微血管的开放均对血肿的吸收有重要影响。说明脑出血后体内凝血与抗凝血酶系统的变化，纤溶系统的活跃程度，吞噬细胞增生迟、早
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及数量多少以及局部血循环的改善状态，均与血肿溶解吸收早、晚、快、慢及组织修复密切相关。国内外已有报道脑出血病人凝血、纤溶系统的变化，肯定这种变化对血肿吸收有一定影响，但尚缺乏与血肿吸收相关因素的动态或系统观察[3～4]。我们的研究表明在脑出血治疗中除控制脑水肿外，针对血肿的治疗应抑制凝血酶活性，加强抗凝血酶活性，促进纤溶，同时亦应促进吞噬细胞增生，改善局部缺血的状态即改善微循环，均为促使血肿早日溶解吸收的重要环节。因此兼顾以上各方面进行综合性治疗才是有效治疗。本项研究提示寻找针对血肿治疗的药物或方法应能具有调节上述几方面重要因素的功能。
表1 造模后血肿容积、神经功能、脑含水量、凝血酶活性、AT-Ⅲ活性、D-D含量变化比较(
±s)正常组
24h
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48h
3d
6d
10d
14d
血肿容积
0
26.32±4.61
26.10±3.28
24.77±5.22
21.18±6.49*
1.16±0.87**
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神经功能评分
0
2.93±0.56
2.89±0.44
2.71±0.47
1.07±0.62**
0.82±0.35**
0.35±0.27**
脑含水量
78.44±0.21
81.76±0.32**
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81.29±0.11**
81.20±10.20**
79.76±0.20*△
78.87±0.22
78.40±0.33
凝血酶活性
0.12±0.03
0.17±0.04**
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0.20±0.03*
0.16±0.09*△
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0.12±0.04
AT-Ⅲ活性
58.22±0.66
59.98±0.52
60.54±0.43*
62.54±0.31*
73.24±0.50**
62.54±0.35*
61.12±0.42*
D-D含量
, 百拇医药 0.30±0.02
0.31±0.03
0.34±0.03*
0.36±0.03*
0.47±0.02**
0.35±0.02
0.29±0.01
注：血肿容积(μl)神经功能(分)与24h组比较，脑含水量(%)(△与24h组比较P<0.05)，凝血酶活性(u/ml)(△与48h组比较P<0.05),AT-Ⅲ活性(%)，D-D含量(mg/L)与正常组比较*P<0.05,**P<0.01
参 考 文 献
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[1]Rosenberg GA,Mun- Bryce S,Wesley M,et al.Collagenase induced inracere bral hemorrhage in rats[J].Stroke,1990, 21:801～ 807
[2]Bederson JB,Pitts LH,Nishimura MC,et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke, 1986,17:472～ 476
[3]Masuda T,Dohrmann GJ,Kwaan HC,et al.Fibrionlytic activity in experimental intracerebral hematoma[J].J Neurosurg, 1988,68:274～ 278
[4]林秀瑾.54例急性高血压性脑出血患者血液凝血因子研究[J].脑与神经疾病杂志，1998，6(1)：51～ 53
收稿：2000-01-18, 百拇医药