当归补血汤对创伤小鼠血β内啡肽和皮质醇的影响与免疫保护作用
作者：郝江 文家福 成诗黔 潘兴华 宁亚功 乌盛平 陈正明
单位：成都军区昆明总医院急诊科ICU，云南 昆明 650032
关键词：当归补血汤；免疫；β内啡肽；皮质醇；中医药
中国中西医结合急救杂志000415摘要：目的：研究当归补血汤对创伤应激后小鼠的免疫调节作用，探讨其对应激激素释放的影响。方法：昆明种小鼠随机分为中药治疗组、对照组、正常组。中药治疗组及对照组用落体撞击法造成小鼠双下肢股骨一次性闭合性骨折，对照组中取7只于伤后1小时放血处死后取脾行免疫功能检测。中药治疗组及对照组每日2次灌胃注入中药或生理盐水，并分别于伤后第1、2、5日早8：30取血，用放射免疫法测定血β内啡肽(βET)、皮质醇(Cor)含量，3组均于第5日取血后取脾测定淋巴细胞对植物血凝素(PHA)的增殖反应。结果：中药治疗组脾淋巴细胞对PHA的增殖反应性(A值)与对照组比较明显提高，βET、Cor明显降低(P<0.05或P<0.01)，且治疗组伤肢无坏死发生。结论：创伤应激后，当归补血汤治疗可提高脾淋巴细胞增殖反应性，其作用可能与抑制应激后血中βET、Cor水平上升有关。
, http://www.100md.com
中图分类号：R965;R392.1 文献标识码：A 文章编号：10089691(2000)04023403
The influence of Dangguibuxue decoction(当归补血汤) on immunity and the production of β endorphin and cortisol in traumatized mice
HAO Jiang,WEN Jiafu,CHENG Shiqian
PLA Kunming General Hospital,Kunming Yunnan 650032
Abstract:Objective:To elucidate the modulative activitis of Dangguibuxue decoction (DGBX，当归补血汤) on immunity and the production of βendorphin (βET) and cortisol (Cor) in traumatized mice.Methods:Kunming mice were divided randomly into DGBX treated(Ⅰ),traumatized control(Ⅱ) and normal(Ⅲ) groups.The mice of Ⅰ and Ⅱ groups were made closed fracture on two posterior legs by a method of dropping substance strike.After one hour,seven mice of Ⅱ group were killed by hemospasia and the proliferative activity of spleen T cells was measured by MTT assay.The mice of Ⅰ and Ⅱ groups were treated with DGBX or normal saline respectively.Seven mice of each group were sampled at 8:30 of the first,second and fifth day after traumatized,and the βET and Cor concentrations of plasma were measured by radioimmunoassay (RIA).The proliferative activity of spleen T cells was measured at the fifth day.Results:The proliferative activity of spleen T cells was significantly higher than that of traumatized control group.The concentration of βET and Cor were significantly lower than those of traumatized control.There was no necrosis at the traumatized legs of DGBX treated mice.Conclusions:DGBX has the ability to improve the proliferative activity of spleen T cells after traumatized and the immunomodulative activity of DGBX may be correlated with the suppression of βET and Cor production.
, 百拇医药
Key words:Dangguibuxue decoction;immunity;βendorphin;cortisol;traditional Chinese medicine
CLC number:R965;R392.1 Document code:A Artical ID:10089691(2000)04023403
出血、创伤以及休克时常有多种免疫功能异常，由于免疫功能减退导致的内毒素血症、感染是这些急重症后期发生多脏器功能障碍综合征(MODS)的主要原因。研究创伤免疫功能减退的原因，探讨其治疗途径是减少MODS的重要举措。中药免疫治疗除具有提高机体免疫功能外，还因为其整体调节、 平衡作用而受到重视。有关补益类中药对免疫系统功能的增强作用已被公认，但对其在创伤应激后神经体液免疫调控中的作用尚不清楚。进一步阐明相互关系，更好地将黄芪补气、当归生血的效能用于急性创伤后患者的临床救治，在整体平衡调理中有着十分诱人的前景。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 实验动物及致伤模型：将体重16～20 g昆明种小鼠固定后，于双后肢股骨中段放一长镊子，大约将1/4部分放于鼠腿上，以10 cm高度垂直自由落下200 g重砝码砸击镊子，制成双下肢一次性闭合性骨折伤，表现为小鼠两大腿肿胀，畸形，失去支撑功能，手摸有明确骨摩擦感。
1.2 中药配制及给药方法：炙黄芪、当归、石菖蒲等药合煎成水煎剂，以100 g生药煎成500 g/L原液备用。小鼠致伤后4小时开始灌胃，每只0.5 ml，每日2次。
1.3 动物分组及实验方法：小鼠随机分为3组，中药治疗组、对照组和正常组。治疗组及对照组于早8：00致伤，对照组中取7只于伤后1小时放血后处死，即刻取脾，分离并测定脾淋巴细胞增殖反应性。伤后4小时开始分别给上述2组小鼠灌胃注入中药(中药治疗组)或生理盐水(对照组)，每日2次。伤后第1、2、5日上午8：30从眼眶取血0.4～0.7 ml，即行高速离心分离后将血清置-25 ℃低温存放。第5日取血后处死全部小鼠并测定脾淋巴细胞增殖反应性。正常组小鼠也于第5日眼眶取血后处死，并取脾行免疫功能检测。
, 百拇医药
1.4 免疫功能测定：3组小鼠放血活杀后，即刻用“84液”浸泡3～5分钟，无菌取脾，取41/2号针头扎眼6个，用Hanks液挤压冲洗法分离单个核细胞，用淋巴细胞分层液离心(1 800 r/min)15分钟分离淋巴细胞，Hanks液洗涤2次，RPMI1640培养液稀释成每份1 ml，计数细胞数，调细胞浓度为2.5×109/L左右，用96孔板培养细胞，每孔加细胞悬液100 μl，再加含200 mg/L植物血凝素(PHA)的RPMI1640液100 μl，置于5%CO2、37 ℃条件下培养48小时后，采用MTT法以570 nm波长测A值。结果以每105个细胞的A值表示。
1.5 皮质醇(Cor)、β内啡肽(βET)测定：Cor和βET药盒分别由焦作解放军免疫诊断试剂研究所和北京海科锐生物技术中心提供，操作按说明。
1.6 统计学方法：数据以均数±标准差(x±s)表示，数据经第四军医大学Nosa统计软件包处理。
, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 一般状态：正常组动物活泼，精神状态良好；对照组伤后精神萎靡，竖毛懒动，其中有40%发生伤肢坏死(黑色)；中药治疗组精神状态明显好于对照组，无肢体坏死发生。
2.2 中药对致伤小鼠免疫功能的保护作用：创伤后1小时小鼠免疫功能已开始出现轻度抑制；伤后5日对照组小鼠对PHA诱导的脾淋巴细胞增殖量仅有0.760 0±0.112 9，较正常组鼠减少约40%；中药保护后，淋巴细胞增殖量可达1.024 0±0.045.6，为正常的80%，与对照组伤后5日比较差异显著(P=0.001 3)。
表1 中药对创伤应激小鼠脾淋巴细胞增殖反应性的影响 组别
脾淋巴细胞A值(
±s)
, http://www.100md.com
P值
正常组 第5日
1.290 0±0.061 5
0.000 1
对照组 伤后第1小时
1.150 0±0.003 8
0.039 0△
伤后第5日
0.760 0±0.112 9
中药治疗组 伤后第5日
1.024 0±0.045 6
, 百拇医药
0.001 3
注：与对照组伤后第5日比较；△与正常组比较；n=7
2.3 断肢应激后小鼠血清中应激激素的变化：伤后1小时动物血中Cor和βET水平已有升高，至第5日逐渐恢复正常。伤后第1日中药治疗组Cor水平与对照组比较有一定下降(P<0.05)，βET水平也得到显著控制，2组比较有显著差异(P<0.01)。
3 讨 论
创伤后产生的过强生理应激反应是导致机体内环境调节紊乱的一个重要因素，多种应激激素对免疫功能有抑制作用〔1〕。探索如何防治过度应激反应给机体带来的危害越来越受到重视，但目前仍以去除应激因素和对症治疗为主，尚无整体调整的好方法。临床使用的各种激素和细胞因子，虽然发挥了一定的治疗作用，但体内各系统间的调节关系极为复杂，终将难以平衡多系统失调。
, 百拇医药
现代应激的神经内分泌免疫调节网络学说与中医的整体学说和扶正祛邪等治疗原则相符〔2〕。对机体免疫功能具有促进作用的补益类中药分为补气、补血、补阳、补阴4大类，黄芪、当归分别是补气与补血的代表药〔3〕，我们选择这两味代表药，研究其对细胞免疫功能和应激条件下Cor、βET的影响和调节作用，进一步证实由黄芪、当归为主组成的补气生血、镇静安神方剂可增强断肢应激伤后小鼠脾淋巴细胞对PHA的增殖作用。实验还表明，断肢应激后数日内小鼠免疫功能障碍仍持续存在，伤后2日内血浆中Cor和βET水平明显偏高，中药对伤后小鼠体内βET水平有明显抑制作用，对Cor也有一定程度的抑制作用。
表2 伤后不同时间应激小鼠血浆中Cor和βET含量的变化(±s) 组别
Cor(μg/L)
, 百拇医药
βET(ng/L)
第1小时
第1日
第2日
第5日
第1小时
第1日
第2日
第5日
正常组
12.6±2.3
24.2±2.5
对照组
, 百拇医药
18.4±1.0▲▲
20.9±3.2▲▲
19.7±2.3
17.6±1.9
27.1±1.7
33.2±2.3▲
35.3±2.8
23.6±2.9
中药治疗组
17.3±2.1△
, http://www.100md.com 18.9±1.9
12.8±2.5△
4.0±0.9△△
11.9±1.9△△
18.2±2.4△
注：与对照组比较：△P<0.05，△△P<0.01；与正常组比较：▲P<0.05，▲▲P<0.01；n=7
目前有关补益类中药的免疫增强机制还不清楚。1977年Basedorsky首先提出“神经内分泌免疫调节网络学说(NIM)”，认为生物活性物质分子间有相互作用与调节功能。近年的研究发现，淋巴细胞、单核细胞及其它一些免疫活性细胞上有许多特异性内分泌物的受体，包括皮质激素释放激素受体、儿茶酚胺受体以及内源性鸦片样多肽等受体，并经实验证实，免疫与神经内分泌两大系统间存在着双向信息交流，许多神经内分泌激素都有免疫调节作用，如生理应激状态下增多的内源性鸦片样多肽βET,就是抗体产生的强有力抑制剂，对T、B淋巴细胞功能均有抑制作用，皮质激素也有免疫抑制作用〔4〕。由于创伤等应激而导致患者循环血中这些多肽的增加必然导致对各类细菌及毒素的易感性增强。本项研究在证实当归补血汤对创伤应激有免疫保护作用的同时，还发现对部分应激激素有抑制作用。Levy等〔5〕证实，创伤患者循环血中βET较正常增加5倍，并持续至伤后4日以上，此期淋巴细胞PHA反应性明显抑制，5日后方逐渐恢复，与 βET含量呈负相关。因此可以认为，当归补血汤对伤后小鼠的免疫保护作用与其对βET抑制效应有关，同时该方对伤肢的局部循环也有改善效果，可考虑作为创伤应激初期的一剂良方。
, 百拇医药
基金项目：成都军区科研基金资助项目(99A004)
作者简介：郝 江(1959)，女(汉族)，山西长治人，主治医师。
参考文献：
〔1〕王迪浔主编.病理生理学.第1版.北京：人民卫生出版社，1996.98.
〔2〕陈家旭，杨维益.神经内分泌免疫网络研究概况及其与中医肝脏关系的探讨.北京中医药大学学报，1995，18(4)：7.
〔3〕李仪奎，姜名瑛主编.中药药理学.第1版.北京：中国中医药出版社，1992.184201.
〔4〕汤文浩译.生理应激和细胞缺血免疫抑制与脓毒症易感性.国外医学创伤与外科基本问题分册，1992，13(2)：81.
〔5〕Levy E M,Mcintosh T,Black P H.Elevation of circulating βendorphin levels with concomitant depression of immune parameters after traumatic injury.J Trauma,1986,26(3):246.
(收稿日期：2000-06-06)
(修回日期：2000-07-12), 百拇医药
单位：成都军区昆明总医院急诊科ICU，云南 昆明 650032
关键词：当归补血汤；免疫；β内啡肽；皮质醇；中医药
中国中西医结合急救杂志000415摘要：目的：研究当归补血汤对创伤应激后小鼠的免疫调节作用，探讨其对应激激素释放的影响。方法：昆明种小鼠随机分为中药治疗组、对照组、正常组。中药治疗组及对照组用落体撞击法造成小鼠双下肢股骨一次性闭合性骨折，对照组中取7只于伤后1小时放血处死后取脾行免疫功能检测。中药治疗组及对照组每日2次灌胃注入中药或生理盐水，并分别于伤后第1、2、5日早8：30取血，用放射免疫法测定血β内啡肽(βET)、皮质醇(Cor)含量，3组均于第5日取血后取脾测定淋巴细胞对植物血凝素(PHA)的增殖反应。结果：中药治疗组脾淋巴细胞对PHA的增殖反应性(A值)与对照组比较明显提高，βET、Cor明显降低(P<0.05或P<0.01)，且治疗组伤肢无坏死发生。结论：创伤应激后，当归补血汤治疗可提高脾淋巴细胞增殖反应性，其作用可能与抑制应激后血中βET、Cor水平上升有关。
, http://www.100md.com
中图分类号：R965;R392.1 文献标识码：A 文章编号：10089691(2000)04023403
The influence of Dangguibuxue decoction(当归补血汤) on immunity and the production of β endorphin and cortisol in traumatized mice
HAO Jiang,WEN Jiafu,CHENG Shiqian
PLA Kunming General Hospital,Kunming Yunnan 650032
Abstract:Objective:To elucidate the modulative activitis of Dangguibuxue decoction (DGBX，当归补血汤) on immunity and the production of βendorphin (βET) and cortisol (Cor) in traumatized mice.Methods:Kunming mice were divided randomly into DGBX treated(Ⅰ),traumatized control(Ⅱ) and normal(Ⅲ) groups.The mice of Ⅰ and Ⅱ groups were made closed fracture on two posterior legs by a method of dropping substance strike.After one hour,seven mice of Ⅱ group were killed by hemospasia and the proliferative activity of spleen T cells was measured by MTT assay.The mice of Ⅰ and Ⅱ groups were treated with DGBX or normal saline respectively.Seven mice of each group were sampled at 8:30 of the first,second and fifth day after traumatized,and the βET and Cor concentrations of plasma were measured by radioimmunoassay (RIA).The proliferative activity of spleen T cells was measured at the fifth day.Results:The proliferative activity of spleen T cells was significantly higher than that of traumatized control group.The concentration of βET and Cor were significantly lower than those of traumatized control.There was no necrosis at the traumatized legs of DGBX treated mice.Conclusions:DGBX has the ability to improve the proliferative activity of spleen T cells after traumatized and the immunomodulative activity of DGBX may be correlated with the suppression of βET and Cor production.
, 百拇医药
Key words:Dangguibuxue decoction;immunity;βendorphin;cortisol;traditional Chinese medicine
CLC number:R965;R392.1 Document code:A Artical ID:10089691(2000)04023403
出血、创伤以及休克时常有多种免疫功能异常，由于免疫功能减退导致的内毒素血症、感染是这些急重症后期发生多脏器功能障碍综合征(MODS)的主要原因。研究创伤免疫功能减退的原因，探讨其治疗途径是减少MODS的重要举措。中药免疫治疗除具有提高机体免疫功能外，还因为其整体调节、 平衡作用而受到重视。有关补益类中药对免疫系统功能的增强作用已被公认，但对其在创伤应激后神经体液免疫调控中的作用尚不清楚。进一步阐明相互关系，更好地将黄芪补气、当归生血的效能用于急性创伤后患者的临床救治，在整体平衡调理中有着十分诱人的前景。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 实验动物及致伤模型：将体重16～20 g昆明种小鼠固定后，于双后肢股骨中段放一长镊子，大约将1/4部分放于鼠腿上，以10 cm高度垂直自由落下200 g重砝码砸击镊子，制成双下肢一次性闭合性骨折伤，表现为小鼠两大腿肿胀，畸形，失去支撑功能，手摸有明确骨摩擦感。
1.2 中药配制及给药方法：炙黄芪、当归、石菖蒲等药合煎成水煎剂，以100 g生药煎成500 g/L原液备用。小鼠致伤后4小时开始灌胃，每只0.5 ml，每日2次。
1.3 动物分组及实验方法：小鼠随机分为3组，中药治疗组、对照组和正常组。治疗组及对照组于早8：00致伤，对照组中取7只于伤后1小时放血后处死，即刻取脾，分离并测定脾淋巴细胞增殖反应性。伤后4小时开始分别给上述2组小鼠灌胃注入中药(中药治疗组)或生理盐水(对照组)，每日2次。伤后第1、2、5日上午8：30从眼眶取血0.4～0.7 ml，即行高速离心分离后将血清置-25 ℃低温存放。第5日取血后处死全部小鼠并测定脾淋巴细胞增殖反应性。正常组小鼠也于第5日眼眶取血后处死，并取脾行免疫功能检测。
, 百拇医药
1.4 免疫功能测定：3组小鼠放血活杀后，即刻用“84液”浸泡3～5分钟，无菌取脾，取41/2号针头扎眼6个，用Hanks液挤压冲洗法分离单个核细胞，用淋巴细胞分层液离心(1 800 r/min)15分钟分离淋巴细胞，Hanks液洗涤2次，RPMI1640培养液稀释成每份1 ml，计数细胞数，调细胞浓度为2.5×109/L左右，用96孔板培养细胞，每孔加细胞悬液100 μl，再加含200 mg/L植物血凝素(PHA)的RPMI1640液100 μl，置于5%CO2、37 ℃条件下培养48小时后，采用MTT法以570 nm波长测A值。结果以每105个细胞的A值表示。
1.5 皮质醇(Cor)、β内啡肽(βET)测定：Cor和βET药盒分别由焦作解放军免疫诊断试剂研究所和北京海科锐生物技术中心提供，操作按说明。
1.6 统计学方法：数据以均数±标准差(x±s)表示，数据经第四军医大学Nosa统计软件包处理。
, http://www.100md.com
2 结 果
2.1 一般状态：正常组动物活泼，精神状态良好；对照组伤后精神萎靡，竖毛懒动，其中有40%发生伤肢坏死(黑色)；中药治疗组精神状态明显好于对照组，无肢体坏死发生。
2.2 中药对致伤小鼠免疫功能的保护作用：创伤后1小时小鼠免疫功能已开始出现轻度抑制；伤后5日对照组小鼠对PHA诱导的脾淋巴细胞增殖量仅有0.760 0±0.112 9，较正常组鼠减少约40%；中药保护后，淋巴细胞增殖量可达1.024 0±0.045.6，为正常的80%，与对照组伤后5日比较差异显著(P=0.001 3)。
表1 中药对创伤应激小鼠脾淋巴细胞增殖反应性的影响 组别
脾淋巴细胞A值(
±s), http://www.100md.com
P值
正常组 第5日
1.290 0±0.061 5
0.000 1
对照组 伤后第1小时
1.150 0±0.003 8
0.039 0△
伤后第5日
0.760 0±0.112 9
中药治疗组 伤后第5日
1.024 0±0.045 6
, 百拇医药
0.001 3
注：与对照组伤后第5日比较；△与正常组比较；n=7
2.3 断肢应激后小鼠血清中应激激素的变化：伤后1小时动物血中Cor和βET水平已有升高，至第5日逐渐恢复正常。伤后第1日中药治疗组Cor水平与对照组比较有一定下降(P<0.05)，βET水平也得到显著控制，2组比较有显著差异(P<0.01)。
3 讨 论
创伤后产生的过强生理应激反应是导致机体内环境调节紊乱的一个重要因素，多种应激激素对免疫功能有抑制作用〔1〕。探索如何防治过度应激反应给机体带来的危害越来越受到重视，但目前仍以去除应激因素和对症治疗为主，尚无整体调整的好方法。临床使用的各种激素和细胞因子，虽然发挥了一定的治疗作用，但体内各系统间的调节关系极为复杂，终将难以平衡多系统失调。
, 百拇医药
现代应激的神经内分泌免疫调节网络学说与中医的整体学说和扶正祛邪等治疗原则相符〔2〕。对机体免疫功能具有促进作用的补益类中药分为补气、补血、补阳、补阴4大类，黄芪、当归分别是补气与补血的代表药〔3〕，我们选择这两味代表药，研究其对细胞免疫功能和应激条件下Cor、βET的影响和调节作用，进一步证实由黄芪、当归为主组成的补气生血、镇静安神方剂可增强断肢应激伤后小鼠脾淋巴细胞对PHA的增殖作用。实验还表明，断肢应激后数日内小鼠免疫功能障碍仍持续存在，伤后2日内血浆中Cor和βET水平明显偏高，中药对伤后小鼠体内βET水平有明显抑制作用，对Cor也有一定程度的抑制作用。
表2 伤后不同时间应激小鼠血浆中Cor和βET含量的变化(
±s) 组别Cor(μg/L)
, 百拇医药
βET(ng/L)
第1小时
第1日
第2日
第5日
第1小时
第1日
第2日
第5日
正常组
12.6±2.3
24.2±2.5
对照组
, 百拇医药
18.4±1.0▲▲
20.9±3.2▲▲
19.7±2.3
17.6±1.9
27.1±1.7
33.2±2.3▲
35.3±2.8
23.6±2.9
中药治疗组
17.3±2.1△
, http://www.100md.com 18.9±1.9
12.8±2.5△
4.0±0.9△△
11.9±1.9△△
18.2±2.4△
注：与对照组比较：△P<0.05，△△P<0.01；与正常组比较：▲P<0.05，▲▲P<0.01；n=7
目前有关补益类中药的免疫增强机制还不清楚。1977年Basedorsky首先提出“神经内分泌免疫调节网络学说(NIM)”，认为生物活性物质分子间有相互作用与调节功能。近年的研究发现，淋巴细胞、单核细胞及其它一些免疫活性细胞上有许多特异性内分泌物的受体，包括皮质激素释放激素受体、儿茶酚胺受体以及内源性鸦片样多肽等受体，并经实验证实，免疫与神经内分泌两大系统间存在着双向信息交流，许多神经内分泌激素都有免疫调节作用，如生理应激状态下增多的内源性鸦片样多肽βET,就是抗体产生的强有力抑制剂，对T、B淋巴细胞功能均有抑制作用，皮质激素也有免疫抑制作用〔4〕。由于创伤等应激而导致患者循环血中这些多肽的增加必然导致对各类细菌及毒素的易感性增强。本项研究在证实当归补血汤对创伤应激有免疫保护作用的同时，还发现对部分应激激素有抑制作用。Levy等〔5〕证实，创伤患者循环血中βET较正常增加5倍，并持续至伤后4日以上，此期淋巴细胞PHA反应性明显抑制，5日后方逐渐恢复，与 βET含量呈负相关。因此可以认为，当归补血汤对伤后小鼠的免疫保护作用与其对βET抑制效应有关，同时该方对伤肢的局部循环也有改善效果，可考虑作为创伤应激初期的一剂良方。
, 百拇医药
基金项目：成都军区科研基金资助项目(99A004)
作者简介：郝 江(1959)，女(汉族)，山西长治人，主治医师。
参考文献：
〔1〕王迪浔主编.病理生理学.第1版.北京：人民卫生出版社，1996.98.
〔2〕陈家旭，杨维益.神经内分泌免疫网络研究概况及其与中医肝脏关系的探讨.北京中医药大学学报，1995，18(4)：7.
〔3〕李仪奎，姜名瑛主编.中药药理学.第1版.北京：中国中医药出版社，1992.184201.
〔4〕汤文浩译.生理应激和细胞缺血免疫抑制与脓毒症易感性.国外医学创伤与外科基本问题分册，1992，13(2)：81.
〔5〕Levy E M,Mcintosh T,Black P H.Elevation of circulating βendorphin levels with concomitant depression of immune parameters after traumatic injury.J Trauma,1986,26(3):246.
(收稿日期：2000-06-06)
(修回日期：2000-07-12), 百拇医药