多发伤合并休克早期大鼠小肠中发生细胞凋亡
作者：官健 金大地 金丽娟
单位：官健 金大地(第一军医大学南方医院骨科，广州 510515)；金丽娟(第一军医大学病理生理学教研室)
关键词：多发伤；休克；小肠；细胞凋亡
中国急救医学000401 [摘 要] 目的 探讨多发伤合并休克早期大鼠小肠中细胞凋亡的发生情况及其意义。方法 DNA琼脂糖凝胶电泳、光镜和电镜、原位末端标记法(ISEL)，并测定DNA片段百分率(ap%)。结果 检测到凋亡所特有的DNA梯形条带，说明创伤后小肠细胞凋亡的存在。复苏后6 h各组ap%随创伤程度加重而增大；在6处创伤合并休克组，复苏后1 h ap%已显著升高，3 h达顶峰，以后逐渐下降，24 h仍高于伤前对照组。ISEL法发现大量肠粘膜细胞呈阳性染色。形态学检查显示，凋亡主要发生于小肠绒毛底部的粘膜上皮细胞及固有层的淋巴细胞和嗜酸粒细胞。结论 多发伤合并休克早期大鼠小肠细胞大量凋亡，可能是导致肠道内生菌移位和继发多器官衰竭的原因之一。
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[中图分类号] R 605.971；R 574.5；Q 255 [文献标识码] A
[文章编号] 1002-1949(2000)04-0195-03
Apoptosis in intestine of rats in early stage of polytrauma combined with shock
GUAN Jian,JIN Da-di,JIN Li-juan.
(Department of Orthopaedics, Nanfang Hospital of the First Military Medical University, Guangzhou 510515,China)
[Abstract] Objective Apoptosis in intestine of rats in early stage of polytrauma combined with shock was discussed.Methods DNA agarose gel electrophoresis, in situ end labeling(ISEL), light and electron microscope were used and DNA fragmentation percentage(ap%) was detected.Results Entercyte apoptosis was confirmed by special ladder pattern for apoptosis. At 6 h after resuscitation, the ap% increased together with the severity of trauma. In six-site trauma combined with shock group, the ap% increased significantly at 1 h after resuscitation, reached peak at 3 h, and declined gradually afterward, also higher than control at 24 h. A great many of intestinal epithelial cells appeared positive by ISEL. It was shown by morphological examination that intestinal epithelial cells at the base of crypt, lymphocytes and eosinophils in lamina propria was induced to apoptosis.Conclusion Rat entercyte apoptosis was induced greatly in early stage of polytrauma combined with shock, which may be one of the factors that caused intrstinal bacterial translocation and sequential multiple organ failure.
, 百拇医药
[Key words] Polytrauma; Shock; Intestine; Apoptosis
细胞凋亡(apoptosis)是近年的研究热点，它广泛发生于多种生理和病理过程中。多发伤合并休克是常见危重病，也是多器官衰竭(multiple organ failure, MOF)的重要病因之一。随着严重创伤后肠道内生菌移位及肠源性感染的发现，以前不受重视的小肠已被视为MOF的启动器官。以往的观点认为，在这种急性损伤下，肠粘膜因缺血、缺氧发生坏死、脱落。本实验将重点研究细胞凋亡是否也参与了多发伤合并休克早期的肠屏障损害，并探讨它在肠道内生菌移位和MOF发生发展中的可能作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康成年SD大鼠，体重200～250 g，雌雄各半，随机分成6组：伤前对照组(A组，6只)、假手术组(N组，6只)、失血性休克组(S组，6只)、2处创伤合并休克组(B组，6只)、4处创伤合并休克组(C组，6只)、6处创伤合并休克组(D组，30只)。D组分5个时间点：复苏后1、3、6、12、24 h各6只。
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1.2 实验设计 N组只做1%戊巴比妥钠麻醉及颈外静脉、颈总动脉插管，术后拔管及结扎血管。S组麻醉及插管后，自动脉放血致血压降至5.3～6.6 kPa，维持1 h后自静脉回输所放的血，并加输生理盐水4 ml，拔管。B组在放血前用特制夹钳夹双侧股骨至骨折，余同S组。C组夹双侧股骨+双侧胫腓骨。N、S、B、C组均于复苏后6 h自后腔静脉放血处死。D组夹双侧股骨+双侧胫腓骨+双侧肱骨，在复苏后5个时间点同法处死。
1.3 DNA碎片的提取及电泳[1，2] 动物处死后，取下全部小肠(部分留作形态学检查)，刮取肠粘膜，准确称取1.0 g，加入4℃预冷之缓冲液(50 mmol/L phosphate, 120 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA, pH 7.4)制成20%匀浆(镜下见细胞绝大部分破裂)，27 000×g离心20 min，取上清500 μl，酚法抽提，无水乙醇沉淀，1.8%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭(10 μg/ml)染色，紫外灯下观察，照相。
, 百拇医药
1.4 DNA片段百分率(ap%)的测定[3] 采用二苯胺法分别测定上述离心后上清及沉淀中的DNA含量，计算DNA片段百分率=上清DNA含量/上清+沉淀的DNA含量×100%。
1.5 形态学检查 光镜HE染色和透射电镜。 1.6 原位末端标记法(in situ end labeling,ISEL) 具体按Wijsman等[4]的方法进行，采用苏木素复染，光镜下观察。
1.7 统计方法 所有数据均以均数±标准差(
±s)表示，各组及时间点与A组比较均采用t检验。
2 结果
2.1 各组动物小肠的DNA片段琼脂糖凝胶电泳见图1。B、C、D组3～24 h均可见较清晰的梯形条带，以D3h的条带荧光强度为最大，D6h次之。所用Marker(M)为λ DNA EcoR I/hindⅢ。阴性对照(-)为正常小鼠胸腺细胞基因组DNA，阳性对照(+)为小鼠胸腺细胞经地塞米松(10-5 mol/L)处理24 h后DNA电泳结果。
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2.2 各组动物小肠ap%的变化及伤前的比较见图2。
图1 各组动物小肠DNA片段琼脂糖凝胶电泳
图2 各组动物小肠ap%的变化及与A组的比较，P<0.01
2.3 光镜HE染色结果 D组复苏后1 h小肠改变轻微；3～6 h见小肠绒部底部大量粘膜上皮细胞核固缩浓染，而顶部上皮细胞少见此现象；12～24 h见小肠粘膜成片脱落，绒毛断裂。
2.4 ISEL法结果 D组复苏后3 h小肠绒毛底部大量阳性细胞，呈棕黄色，而阴性细胞被染成蓝色(图3)。
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图3 D 3 h小肠绒毛底部大量阳性细胞(棕黄色)ISEL×400
2.5 透射电镜结果 D组复苏后3 h小肠腺泡内部分上皮细胞体积缩小，核固缩(图4)；固有层淋巴细胞出现核固缩、边集(图5)；嗜酸粒细胞明显增多，部分发生凋亡，但罕见中性粒细胞的浸润(图6)；罕见凋亡小体的形成。
3 讨论
早在80年代，许多国内外学者的动物实验证实了肠源性感染的存在[5，6]。严重创伤后，肠道内生菌和内毒素入血和淋巴系统，一方面直接损害机体，另一方面可激活体内多种细胞并分泌炎症介质，造成全身性炎症反应。全身炎症反应不仅损害其它脏器，也造成肠粘膜屏障的继续破坏，致使更多的细菌及内毒素入血，形成炎症介质和肠粘膜损伤的恶性循环。因此有人视肠为MOF的启动器官[7]。
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图4 D 3 h小肠腺泡内凋亡的上皮细胞(
)EM×1500 
图5 D 3 h小肠固有层淋巴细胞凋亡()EM×3000 
图6 D 3 h小肠内嗜酸粒细胞增多(↑)，并发生凋亡()EM×3000
Xu等(1996)[8]的体外实验中，大鼠肠上皮细胞经脂多糖(LPS，25 mg/ml)处理18 h后，再应激以热休克(43 ℃，90 min)，发现细胞活力较单纯LPS、单纯热休克或热休后LPS处理各组均显著下降，而凋亡细胞比例显著升高，与此同时，细菌移位数亦显著增多。说明细菌移位与肠细胞凋亡有关。本实验中，我们以多发伤合并休克为致伤因素，于体内检测了大鼠小肠粘膜中细胞凋亡的情况。图1显示，B、C组及D组3、6、12 h均呈明显的梯形条带，证实有细胞凋亡的存在。从图2可看出，复苏后6 h，S、B、C、D各组ap%均显著高于A组(即伤前)，且随创伤程度的加重而逐渐升高，说明肠粘膜细胞凋亡量与创伤程度间存在依赖关系；在D组，复苏后1 h的ap%已显著高于A组，3 h即达顶峰，以后逐渐下降，24 h仍高于A组，说明在24 h内凋亡一直存在，且主要发生在早期。ISEL法显示大量阳性染色的肠粘膜上皮细胞也支持上述结果。另外，形态学检查还发现，凋亡主要发生于小肠绒毛底部的粘膜上皮细胞及固有层淋巴细胞和嗜酸粒细胞，且早期以凋亡为主，后期表现为粘膜脱落和绒毛断裂。
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综合我们的实验结果、Xu等及前人的研究成果，可得出如下推论：创伤后小肠细胞早期即发生大量凋亡，使肠屏障功能受损，可能是造成肠道内生菌移位和肠源性感染的直接原因。其机制可能有以下几个方面：小肠绒毛底部上皮细胞的大量凋亡导致细胞间的紧密连接丧失，细菌或内毒素可通过细胞间隙直接入血或淋巴循环；固有层的淋巴细胞凋亡导致免疫防御能力的下降；早期缺乏中性粒细胞的浸润，而代之以嗜酸粒细胞的增多，不利于机体有效地消灭细菌。
在我们以前的实验中[9]，N、S、B、C组大部分可活过72 h，N、S组无一出现MOF，B、C组MOF发生率不超过20%，而D组动物60 h内全部死亡，平均生存27.6 h，MOF发生率高达95%。这是否与D组动物早期出现的肠粘膜细胞大量凋亡有关呢?确值得深入研究。
[基金来源] 军队“九五”指令性课题基金资助
[参考文献]
, http://www.100md.com
[1]Wyllie AH. Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation[J]. Nature, 1980, 284:555.
[2]Leist M, Gantner F, Bohlinger I, et al. Murine hepatocyte apoptosis induced in vitro and in vivo by TNF-α requires transcriptional arrest[J]. J Immunol, 1994,153:1778.
[3]Burton K. A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid[J]. Biochem J, 1956,62:315.
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[4]Wijsman JH, Jonker RR, Keijzer R,et al. A new method to detect apoptosis in paraffin sections:in situ end-labeling of fragmented DNA[J]. J Histochem Cytochem, 1993,41:7.
[5]马利，肖光夏，黎鳌，等.肠源性感染的研究[J].第三军医大学学报，1990，12：1.
[6]Deith EA, Mali, Berg J, et al. Bacterial translocation from gut:a mechanism of infection[J]. JBCR, 1987,8:475.
[7]Meakins TL. The gastrointestinal tract: the “motor”of MOF[J]. Arch Surg, 1986, 121:197.
, 百拇医药
[8]Xu DZ, Lu Q, Swank GM, et al. Effect of heat shock and endotoxin stress on entercyte viabillity apoptosis and function varies based on whether the cells are exposed to heat shock or endotoxin first[J]. Arch Surg, 1996,131:1222.
[9]官健，金大地，金丽娟，等.多发伤合并失血性休克导致大鼠多器官功能障碍综合征的实验研究[A].第四届全国创伤学术交流会论文摘要汇编[C].
[收稿：1999-05-04，修回：1999-09-20], 百拇医药
单位：官健 金大地(第一军医大学南方医院骨科，广州 510515)；金丽娟(第一军医大学病理生理学教研室)
关键词：多发伤；休克；小肠；细胞凋亡
中国急救医学000401 [摘 要] 目的 探讨多发伤合并休克早期大鼠小肠中细胞凋亡的发生情况及其意义。方法 DNA琼脂糖凝胶电泳、光镜和电镜、原位末端标记法(ISEL)，并测定DNA片段百分率(ap%)。结果 检测到凋亡所特有的DNA梯形条带，说明创伤后小肠细胞凋亡的存在。复苏后6 h各组ap%随创伤程度加重而增大；在6处创伤合并休克组，复苏后1 h ap%已显著升高，3 h达顶峰，以后逐渐下降，24 h仍高于伤前对照组。ISEL法发现大量肠粘膜细胞呈阳性染色。形态学检查显示，凋亡主要发生于小肠绒毛底部的粘膜上皮细胞及固有层的淋巴细胞和嗜酸粒细胞。结论 多发伤合并休克早期大鼠小肠细胞大量凋亡，可能是导致肠道内生菌移位和继发多器官衰竭的原因之一。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R 605.971；R 574.5；Q 255 [文献标识码] A
[文章编号] 1002-1949(2000)04-0195-03
Apoptosis in intestine of rats in early stage of polytrauma combined with shock
GUAN Jian,JIN Da-di,JIN Li-juan.
(Department of Orthopaedics, Nanfang Hospital of the First Military Medical University, Guangzhou 510515,China)
[Abstract] Objective Apoptosis in intestine of rats in early stage of polytrauma combined with shock was discussed.Methods DNA agarose gel electrophoresis, in situ end labeling(ISEL), light and electron microscope were used and DNA fragmentation percentage(ap%) was detected.Results Entercyte apoptosis was confirmed by special ladder pattern for apoptosis. At 6 h after resuscitation, the ap% increased together with the severity of trauma. In six-site trauma combined with shock group, the ap% increased significantly at 1 h after resuscitation, reached peak at 3 h, and declined gradually afterward, also higher than control at 24 h. A great many of intestinal epithelial cells appeared positive by ISEL. It was shown by morphological examination that intestinal epithelial cells at the base of crypt, lymphocytes and eosinophils in lamina propria was induced to apoptosis.Conclusion Rat entercyte apoptosis was induced greatly in early stage of polytrauma combined with shock, which may be one of the factors that caused intrstinal bacterial translocation and sequential multiple organ failure.
, 百拇医药
[Key words] Polytrauma; Shock; Intestine; Apoptosis
细胞凋亡(apoptosis)是近年的研究热点，它广泛发生于多种生理和病理过程中。多发伤合并休克是常见危重病，也是多器官衰竭(multiple organ failure, MOF)的重要病因之一。随着严重创伤后肠道内生菌移位及肠源性感染的发现，以前不受重视的小肠已被视为MOF的启动器官。以往的观点认为，在这种急性损伤下，肠粘膜因缺血、缺氧发生坏死、脱落。本实验将重点研究细胞凋亡是否也参与了多发伤合并休克早期的肠屏障损害，并探讨它在肠道内生菌移位和MOF发生发展中的可能作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康成年SD大鼠，体重200～250 g，雌雄各半，随机分成6组：伤前对照组(A组，6只)、假手术组(N组，6只)、失血性休克组(S组，6只)、2处创伤合并休克组(B组，6只)、4处创伤合并休克组(C组，6只)、6处创伤合并休克组(D组，30只)。D组分5个时间点：复苏后1、3、6、12、24 h各6只。
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1.2 实验设计 N组只做1%戊巴比妥钠麻醉及颈外静脉、颈总动脉插管，术后拔管及结扎血管。S组麻醉及插管后，自动脉放血致血压降至5.3～6.6 kPa，维持1 h后自静脉回输所放的血，并加输生理盐水4 ml，拔管。B组在放血前用特制夹钳夹双侧股骨至骨折，余同S组。C组夹双侧股骨+双侧胫腓骨。N、S、B、C组均于复苏后6 h自后腔静脉放血处死。D组夹双侧股骨+双侧胫腓骨+双侧肱骨，在复苏后5个时间点同法处死。
1.3 DNA碎片的提取及电泳[1，2] 动物处死后，取下全部小肠(部分留作形态学检查)，刮取肠粘膜，准确称取1.0 g，加入4℃预冷之缓冲液(50 mmol/L phosphate, 120 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA, pH 7.4)制成20%匀浆(镜下见细胞绝大部分破裂)，27 000×g离心20 min，取上清500 μl，酚法抽提，无水乙醇沉淀，1.8%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭(10 μg/ml)染色，紫外灯下观察，照相。
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1.4 DNA片段百分率(ap%)的测定[3] 采用二苯胺法分别测定上述离心后上清及沉淀中的DNA含量，计算DNA片段百分率=上清DNA含量/上清+沉淀的DNA含量×100%。
1.5 形态学检查 光镜HE染色和透射电镜。 1.6 原位末端标记法(in situ end labeling,ISEL) 具体按Wijsman等[4]的方法进行，采用苏木素复染，光镜下观察。
1.7 统计方法 所有数据均以均数±标准差(
±s)表示，各组及时间点与A组比较均采用t检验。2 结果
2.1 各组动物小肠的DNA片段琼脂糖凝胶电泳见图1。B、C、D组3～24 h均可见较清晰的梯形条带，以D3h的条带荧光强度为最大，D6h次之。所用Marker(M)为λ DNA EcoR I/hindⅢ。阴性对照(-)为正常小鼠胸腺细胞基因组DNA，阳性对照(+)为小鼠胸腺细胞经地塞米松(10-5 mol/L)处理24 h后DNA电泳结果。
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2.2 各组动物小肠ap%的变化及伤前的比较见图2。
图1 各组动物小肠DNA片段琼脂糖凝胶电泳
图2 各组动物小肠ap%的变化及与A组的比较，P<0.01
2.3 光镜HE染色结果 D组复苏后1 h小肠改变轻微；3～6 h见小肠绒部底部大量粘膜上皮细胞核固缩浓染，而顶部上皮细胞少见此现象；12～24 h见小肠粘膜成片脱落，绒毛断裂。
2.4 ISEL法结果 D组复苏后3 h小肠绒毛底部大量阳性细胞，呈棕黄色，而阴性细胞被染成蓝色(图3)。
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图3 D 3 h小肠绒毛底部大量阳性细胞(棕黄色)ISEL×400
2.5 透射电镜结果 D组复苏后3 h小肠腺泡内部分上皮细胞体积缩小，核固缩(图4)；固有层淋巴细胞出现核固缩、边集(图5)；嗜酸粒细胞明显增多，部分发生凋亡，但罕见中性粒细胞的浸润(图6)；罕见凋亡小体的形成。
3 讨论
早在80年代，许多国内外学者的动物实验证实了肠源性感染的存在[5，6]。严重创伤后，肠道内生菌和内毒素入血和淋巴系统，一方面直接损害机体，另一方面可激活体内多种细胞并分泌炎症介质，造成全身性炎症反应。全身炎症反应不仅损害其它脏器，也造成肠粘膜屏障的继续破坏，致使更多的细菌及内毒素入血，形成炎症介质和肠粘膜损伤的恶性循环。因此有人视肠为MOF的启动器官[7]。
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图4 D 3 h小肠腺泡内凋亡的上皮细胞(
)EM×1500 图5 D 3 h小肠固有层淋巴细胞凋亡(
)EM×3000 图6 D 3 h小肠内嗜酸粒细胞增多(↑)，并发生凋亡(
)EM×3000Xu等(1996)[8]的体外实验中，大鼠肠上皮细胞经脂多糖(LPS，25 mg/ml)处理18 h后，再应激以热休克(43 ℃，90 min)，发现细胞活力较单纯LPS、单纯热休克或热休后LPS处理各组均显著下降，而凋亡细胞比例显著升高，与此同时，细菌移位数亦显著增多。说明细菌移位与肠细胞凋亡有关。本实验中，我们以多发伤合并休克为致伤因素，于体内检测了大鼠小肠粘膜中细胞凋亡的情况。图1显示，B、C组及D组3、6、12 h均呈明显的梯形条带，证实有细胞凋亡的存在。从图2可看出，复苏后6 h，S、B、C、D各组ap%均显著高于A组(即伤前)，且随创伤程度的加重而逐渐升高，说明肠粘膜细胞凋亡量与创伤程度间存在依赖关系；在D组，复苏后1 h的ap%已显著高于A组，3 h即达顶峰，以后逐渐下降，24 h仍高于A组，说明在24 h内凋亡一直存在，且主要发生在早期。ISEL法显示大量阳性染色的肠粘膜上皮细胞也支持上述结果。另外，形态学检查还发现，凋亡主要发生于小肠绒毛底部的粘膜上皮细胞及固有层淋巴细胞和嗜酸粒细胞，且早期以凋亡为主，后期表现为粘膜脱落和绒毛断裂。
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综合我们的实验结果、Xu等及前人的研究成果，可得出如下推论：创伤后小肠细胞早期即发生大量凋亡，使肠屏障功能受损，可能是造成肠道内生菌移位和肠源性感染的直接原因。其机制可能有以下几个方面：小肠绒毛底部上皮细胞的大量凋亡导致细胞间的紧密连接丧失，细菌或内毒素可通过细胞间隙直接入血或淋巴循环；固有层的淋巴细胞凋亡导致免疫防御能力的下降；早期缺乏中性粒细胞的浸润，而代之以嗜酸粒细胞的增多，不利于机体有效地消灭细菌。
在我们以前的实验中[9]，N、S、B、C组大部分可活过72 h，N、S组无一出现MOF，B、C组MOF发生率不超过20%，而D组动物60 h内全部死亡，平均生存27.6 h，MOF发生率高达95%。这是否与D组动物早期出现的肠粘膜细胞大量凋亡有关呢?确值得深入研究。
[基金来源] 军队“九五”指令性课题基金资助
[参考文献]
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[1]Wyllie AH. Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation[J]. Nature, 1980, 284:555.
[2]Leist M, Gantner F, Bohlinger I, et al. Murine hepatocyte apoptosis induced in vitro and in vivo by TNF-α requires transcriptional arrest[J]. J Immunol, 1994,153:1778.
[3]Burton K. A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid[J]. Biochem J, 1956,62:315.
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[4]Wijsman JH, Jonker RR, Keijzer R,et al. A new method to detect apoptosis in paraffin sections:in situ end-labeling of fragmented DNA[J]. J Histochem Cytochem, 1993,41:7.
[5]马利，肖光夏，黎鳌，等.肠源性感染的研究[J].第三军医大学学报，1990，12：1.
[6]Deith EA, Mali, Berg J, et al. Bacterial translocation from gut:a mechanism of infection[J]. JBCR, 1987,8:475.
[7]Meakins TL. The gastrointestinal tract: the “motor”of MOF[J]. Arch Surg, 1986, 121:197.
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[8]Xu DZ, Lu Q, Swank GM, et al. Effect of heat shock and endotoxin stress on entercyte viabillity apoptosis and function varies based on whether the cells are exposed to heat shock or endotoxin first[J]. Arch Surg, 1996,131:1222.
[9]官健，金大地，金丽娟，等.多发伤合并失血性休克导致大鼠多器官功能障碍综合征的实验研究[A].第四届全国创伤学术交流会论文摘要汇编[C].
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