新精氨酸类似物抑制大鼠腹腔巨噬细胞内一氧化氮生成的研究
作者：杨军珂 吴赛珠 周忠江
单位：广州第一军医大学南方医院心内科，510515
关键词：
中国急救医学000418 一氧化氮是近年来一个研究热点，在许多生理、病理过程中均起一定作用。各种一氧化氮合酶抑制剂的研究开发有望对败血性休克等疾病的治疗有益。本文旨在观察一种新合成的精氨酸类似物(以下简称新化合物)对巨噬细胞生成一氧化氮的影响。
1 材料和方法
1.1 主要试剂与仪器 新化合物(北京医科大学药学院中德联合实验室合成并提供)，左旋硝基精氨酸(SIGMA公司)，LPS(大肠杆菌O127B8，SIGMA公司)，756-MC紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)，一氧化氮测试盒(北京军事医学科学院放射医学研究所)。
, http://www.100md.com
1.2 腹腔巨噬细胞的获取和培养 SD大鼠，雌雄各半，体重190～230 g，南方医院动物所提供。将大鼠颈椎脱臼处死后，躯体用75%酒精浸泡消毒后，剖腹注入10 ml D-Hank′s液，轻揉腹部，吸取含巨噬细胞的腹腔洗液，放入离心管，1000 r/min离心5分钟，去除上清，加入DMEM培养液，配制成106 cells/ml的细胞悬液，置于24孔细胞培养板中，每孔1 ml，置37℃ CO2培养箱(5% CO2)，孵育2 h，弃上清和未贴壁细胞，重新加等量DMEM培养液。分为以下三组：①巨噬细胞(109 cells/L)+LPS(10 mg/L)+新化合物(10-4 mol/L)；②巨噬细胞(109 cells/L)+LPS(10 mg/L)+左旋硝基精氨酸(10-4 mol/L)；③巨噬细胞(109 cells/L)+LPS(10 mg/L)继续培养。
, 百拇医药
1.3 巨噬细胞一氧化氮的测定 继续培养48 h后取细胞培养上清0.1 ml加0.6 ml 0.15%硫酸锌混匀，加双蒸水0.4 ml混匀，加0.1 ml 4%氧氢化钠混匀，冰上孵育60分钟，12 000转离心2分钟，取上清0.6 ml加0.4 ml双蒸水及0.1 ml 0.3%磺胺冰上孵育15分钟，之后加0.1 ml 6 mmol/L萘乙烯二胺盐酸盐，室温放置1小时，在分光光度计波长545 nm比色，读OD值。对照亚硝酸钠标准曲线查得相应浓度。
1.4 统计方法 数据以
±s表示，不同组资料的数据以配合组设计的方差分析和Q检验来比较。
2 结果
新化合物对巨噬细胞产生一氧化氮的影响：在LPS的诱导下，巨噬细胞产生大量一氧化氮，继而代谢生成稳定的亚硝基，通过检测亚硝基的含量来间接确定一氧化氮的产量。附表示不同情况下巨噬细胞产生一氧化氮的量。显示新化合物明显抑制巨噬细胞产生一氧化氮，抑制作用远大于左旋硝基精氨酸。
, 百拇医药
附表 不同化合物对巨噬细胞产生一氧化氮的影响 化合物(10-4mol/L)
n
NO(μmol/48h.109cells)
新化合物组
8
19.185±7.534
左旋硝基精氨酸组
8
72.017±6.249
空白组
8
, 百拇医药
107.649±8.207
三组之间比较均为P<0.01
3 讨论
巨噬细胞属于单核吞噬细胞系统，广泛分布于身体的各种组织和器官内。Stueher等人首先发现巨噬细胞被LPS和肿瘤坏死因子γ(IFN-γ)等激活时，在NOS的作用下，利用L-精氨酸生成一氧化氮[1]。与内皮细胞内的NOS不同，巨噬细胞内的NOS属于iNOS，iNOS基因在静息状态下不表达，它的激活需要LPS、IFN-γ、白细胞介素1(IL-1)等因子的诱导，且激活不依赖钙离子或钙调蛋白，iNOS一旦表达，可产生大量的一氧化氮，并维持较长时间[2]。在炎性疾病如败血性休克时，在LPS及细胞因子的诱导下，巨噬细胞内的iNOS可产生过量的一氧化氮，作用时间较长，使血管过度扩张，血压持续于低水平，促使休克的发展[3]。有研究认为，败血性休克时产生的一氧化氮主要来自于巨噬细胞[4]。因此抑制在病理状态下巨噬细胞产生一氧化氮有一定的治疗意义。
, 百拇医药
精氨酸类似物是一类认识较早、研究较广泛的一氧化氮合酶抑制剂，现已知的精氨酸类似物都存在抑制iNOS活性不强、选择性不强等问题[5]。北京医科大学药学院中德联合实验室研究并发出新型的精氨酸类似物，以期在活性、选择性等方面有所突破。我们的此项研究表明，左旋硝基精氨酸能部分抑制内毒素诱导的巨噬细胞产生一氧化氮，而新型的一氧化氮合酶抑制剂对巨噬细胞产生一氧化氮则有更强烈的抑制作用。这种活性高的化合物对败血性休克等疾病的治疗可能有益。事实上我们在败血性休克动物模型上研究已经显示出此种化合物优于左旋硝基精氨酸的升血压作用。
[基金来源] 国家新药基金资助课题
[参考文献]
[1]Stuehr DJ,Marletta MA .Mammalian nitrate biosynthesis:mouse macrophages produce nitrite and nitrate in response to Escherichia coli lipopolysaccharide .Proc Natl Acad Sci USA,1985,85(22):7738-44.
, 百拇医药
[2]Marletta MA ,Yoon PS,lyengar R,et al .Macrophage oxidation of L-arginine to nitrite and nitrate :nitric oxide is an intermediate .Biochemistry ,1988,27(24):8706-10.
[3]Gomez J,Salgado A,Mourelle M,et al .L-arginine :nitric oxide pathway in endotoxemia and human septic shock .Crit Care Med ,1995 Feb ,23(2):253-8.
[4]Cook H, Bune J, Jansen S, et al. Cellular localization of inducible nitric oxide synthase in experimental endotoxic shock in the rat. Clinical Science, 1994, 87: 179-186.
[5]Liaudet L,Rosselet A,Schallar M,et al .Nonselective versus selective in inhibition of inducible nitric oxide synthase in experimental endotoxic shock .J infect dis ,1998 Jan ,177(1):127-32.
[收稿：1998-12-16，修回：1999-08-10], 百拇医药
单位：广州第一军医大学南方医院心内科，510515
关键词：
中国急救医学000418 一氧化氮是近年来一个研究热点，在许多生理、病理过程中均起一定作用。各种一氧化氮合酶抑制剂的研究开发有望对败血性休克等疾病的治疗有益。本文旨在观察一种新合成的精氨酸类似物(以下简称新化合物)对巨噬细胞生成一氧化氮的影响。
1 材料和方法
1.1 主要试剂与仪器 新化合物(北京医科大学药学院中德联合实验室合成并提供)，左旋硝基精氨酸(SIGMA公司)，LPS(大肠杆菌O127B8，SIGMA公司)，756-MC紫外分光光度计(上海第三分析仪器厂)，一氧化氮测试盒(北京军事医学科学院放射医学研究所)。
, http://www.100md.com
1.2 腹腔巨噬细胞的获取和培养 SD大鼠，雌雄各半，体重190～230 g，南方医院动物所提供。将大鼠颈椎脱臼处死后，躯体用75%酒精浸泡消毒后，剖腹注入10 ml D-Hank′s液，轻揉腹部，吸取含巨噬细胞的腹腔洗液，放入离心管，1000 r/min离心5分钟，去除上清，加入DMEM培养液，配制成106 cells/ml的细胞悬液，置于24孔细胞培养板中，每孔1 ml，置37℃ CO2培养箱(5% CO2)，孵育2 h，弃上清和未贴壁细胞，重新加等量DMEM培养液。分为以下三组：①巨噬细胞(109 cells/L)+LPS(10 mg/L)+新化合物(10-4 mol/L)；②巨噬细胞(109 cells/L)+LPS(10 mg/L)+左旋硝基精氨酸(10-4 mol/L)；③巨噬细胞(109 cells/L)+LPS(10 mg/L)继续培养。
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1.3 巨噬细胞一氧化氮的测定 继续培养48 h后取细胞培养上清0.1 ml加0.6 ml 0.15%硫酸锌混匀，加双蒸水0.4 ml混匀，加0.1 ml 4%氧氢化钠混匀，冰上孵育60分钟，12 000转离心2分钟，取上清0.6 ml加0.4 ml双蒸水及0.1 ml 0.3%磺胺冰上孵育15分钟，之后加0.1 ml 6 mmol/L萘乙烯二胺盐酸盐，室温放置1小时，在分光光度计波长545 nm比色，读OD值。对照亚硝酸钠标准曲线查得相应浓度。
1.4 统计方法 数据以
±s表示，不同组资料的数据以配合组设计的方差分析和Q检验来比较。2 结果
新化合物对巨噬细胞产生一氧化氮的影响：在LPS的诱导下，巨噬细胞产生大量一氧化氮，继而代谢生成稳定的亚硝基，通过检测亚硝基的含量来间接确定一氧化氮的产量。附表示不同情况下巨噬细胞产生一氧化氮的量。显示新化合物明显抑制巨噬细胞产生一氧化氮，抑制作用远大于左旋硝基精氨酸。
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附表 不同化合物对巨噬细胞产生一氧化氮的影响 化合物(10-4mol/L)
n
NO(μmol/48h.109cells)
新化合物组
8
19.185±7.534
左旋硝基精氨酸组
8
72.017±6.249
空白组
8
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107.649±8.207
三组之间比较均为P<0.01
3 讨论
巨噬细胞属于单核吞噬细胞系统，广泛分布于身体的各种组织和器官内。Stueher等人首先发现巨噬细胞被LPS和肿瘤坏死因子γ(IFN-γ)等激活时，在NOS的作用下，利用L-精氨酸生成一氧化氮[1]。与内皮细胞内的NOS不同，巨噬细胞内的NOS属于iNOS，iNOS基因在静息状态下不表达，它的激活需要LPS、IFN-γ、白细胞介素1(IL-1)等因子的诱导，且激活不依赖钙离子或钙调蛋白，iNOS一旦表达，可产生大量的一氧化氮，并维持较长时间[2]。在炎性疾病如败血性休克时，在LPS及细胞因子的诱导下，巨噬细胞内的iNOS可产生过量的一氧化氮，作用时间较长，使血管过度扩张，血压持续于低水平，促使休克的发展[3]。有研究认为，败血性休克时产生的一氧化氮主要来自于巨噬细胞[4]。因此抑制在病理状态下巨噬细胞产生一氧化氮有一定的治疗意义。
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精氨酸类似物是一类认识较早、研究较广泛的一氧化氮合酶抑制剂，现已知的精氨酸类似物都存在抑制iNOS活性不强、选择性不强等问题[5]。北京医科大学药学院中德联合实验室研究并发出新型的精氨酸类似物，以期在活性、选择性等方面有所突破。我们的此项研究表明，左旋硝基精氨酸能部分抑制内毒素诱导的巨噬细胞产生一氧化氮，而新型的一氧化氮合酶抑制剂对巨噬细胞产生一氧化氮则有更强烈的抑制作用。这种活性高的化合物对败血性休克等疾病的治疗可能有益。事实上我们在败血性休克动物模型上研究已经显示出此种化合物优于左旋硝基精氨酸的升血压作用。
[基金来源] 国家新药基金资助课题
[参考文献]
[1]Stuehr DJ,Marletta MA .Mammalian nitrate biosynthesis:mouse macrophages produce nitrite and nitrate in response to Escherichia coli lipopolysaccharide .Proc Natl Acad Sci USA,1985,85(22):7738-44.
, 百拇医药
[2]Marletta MA ,Yoon PS,lyengar R,et al .Macrophage oxidation of L-arginine to nitrite and nitrate :nitric oxide is an intermediate .Biochemistry ,1988,27(24):8706-10.
[3]Gomez J,Salgado A,Mourelle M,et al .L-arginine :nitric oxide pathway in endotoxemia and human septic shock .Crit Care Med ,1995 Feb ,23(2):253-8.
[4]Cook H, Bune J, Jansen S, et al. Cellular localization of inducible nitric oxide synthase in experimental endotoxic shock in the rat. Clinical Science, 1994, 87: 179-186.
[5]Liaudet L,Rosselet A,Schallar M,et al .Nonselective versus selective in inhibition of inducible nitric oxide synthase in experimental endotoxic shock .J infect dis ,1998 Jan ,177(1):127-32.
[收稿：1998-12-16，修回：1999-08-10], 百拇医药