河北地区汉族人血管紧张素转换酶基因与糖尿病肾病的相关性研究
作者：李英 张艳玲 丁小颖 于洁 吴文清 王战建 支忠继 顾连方
单位：河北医科大学第三医院肾内科，050051
关键词：
中国急救医学000417 糖尿病肾病(DN)是糖尿病的慢性并发症，是糖尿病患者的主要死亡原因之一，其发病机理未完全阐明，许多研究发现，DN的发病有家族聚集性，可能与遗传因素有关[1]。血管紧张素转换酶(angiotensin I convering enzyme,ACE)是肾素—血管紧张素(R-A)系统的关键酶，而机体ACE水平受ACE基因调控，因此国内外学者对ACE基因与DN的关系做了大量研究，但由于种族及生存环境的差异，结果不尽一致。为此，本文通过对河北地区汉族人ACE基因与DN发病关系的研究，阐明本地区DN发病与ACE基因的相关性，从遗传角度探讨DN的发病机制。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 研究对象
77例依赖胰岛素型糖尿病(IDDM)和72例非依赖胰岛素型糖尿病(NIDDM)选自我院内科门诊和住院患者，均为河北地区汉族人，符合1985年WHO关于IDDM及NIDDM的诊断标准，排除由心、肝及原发肾脏疾病引起蛋白尿者。IDDM组中尿白蛋白排泄率(UAE)>20 ug/min者38例，为DN组，年龄35.9±6.5岁，病程13.9±6.7年，其中男20例，女18例；UAE<29 ug/min者39例，为非DN组，年龄36.1±6.2岁，病程13.6±6.5年，其中男19例，女20例。NIDDM组中，UAE>20 ug/min者40例，为DN组，其中男21例，女19例，年龄62.8±5.6岁，病程12.2±2.4年；UAE<20 ug/min者32例，为非DN组，其中男18例，女14例，年龄62.9±6.1岁，病程12.8±3.1年。
1.2 方法
1.2.1 ACE基因分析
, 百拇医药
常规酚/氯仿法抽提患者基因组DNA，采用Rigat等[2]设计的PCR反应引物，正引物：5′-CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3′：负引物：5′-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGAT-3′(由协和医科大学基础所提供)，D等位基因PCR产物为190 Bp，Ⅰ等位基因PCR产物为490 Bp，反应体积为25 ul，Taq酶和dNTP为promaga产品。于TC-96 AE型PCR扩增仪上进行扩增反应，首先94℃变性2分钟，然后30个循环，每个循环94℃变性1分钟，58℃退火2分钟，72 ℃延伸1.5分钟，最后终末延伸72℃ 5分钟，反应产物行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，以PBR-322MSP I DNA为片段长度标志(华美生物工程公司提供)，EB染色，透射式紫外观察台观察结果。如图。
1.2.2 统计处理
计量资料以
±s表示，组间频率比较用χ2检验，采用POMS软件于计算机上完成。
, http://www.100md.com
2 结果
经计算，NIDDM组及IDDM组ACE基因型及等位基因频率符合Hardy-Weinberg平衡，具群体代表性。
ACE基因型与IDDM和NIDDM伴DN的关系如表1及表2所示。结果表明，ACE基因与DN发病有关。
3 讨论
Hubert等[3]于1991年首先阐明了ACE基因的结构，次年Rigat等[2]报道了ACE基因的PCR扩增方法。人类ACE基因由26个外显子(EX)和25个内含子(IN)组成，位于17号染色体短臂2区3带。ACE基因的16内含子中插入或缺失一个长度为287 Bp的碱基片段，因此ACE基因存在三种基因型，即DD(Deletion)DI、II(Insertion)，两种等位基因D、I，人们将这种存在两种以上基因型的现象称基因多态现象。Tiret等于同年对ACE基因与ACE水平的关系做了研究，发现ACE水平的44%受ACE基因调控，DD型ACE水平最高，DI次之，II最低[4]。ACE是R-A系统的关键酶，R-A系统可通过不同机理参与糖尿病血管并发症的发生，因此，ACE基因与糖尿病血管并发症的关系受到国内外学者的广泛关注。
, http://www.100md.com
图 ACE基因PCR电泳结果
泳道1.7为DI型 2.4为DD型
3.6.8为II型 5为片段长度标志
表1 糖尿病伴DN与不伴DN者ACE基因型比较
基因型
IDDM
NIDDM
不伴DN
伴DN
不伴DN
伴DN
(n=39)
, 百拇医药
(n=38)
(n=32)
(n=40)
DD
6
5
4
10
DI
10
22
10
22
, http://www.100md.com II
23
11
18
8
IDDM组χ2=8.81 P=0.012 P<0.05
NIDDM组 χ2=10.15 P=0.006 P<0.01表2 糖尿病伴与不伴DN者ACE等位基因比较 等位基因
IDDM
NIDDM
不伴DN
伴DN
, http://www.100md.com
不伴DN
伴DN
(n=39)
(n=38)
(n=32)
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D
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I
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46
38
IDDM组χ2=6.05 P=0.014 P<0.05
NIDDM组 χ2=8.69 P=0.003 P<0.01
Marre等[5]报道了一组IDDM患者中62例伴DN，62例无DN，发现DN组ACE水平高，II型在DN组出现频率低，为DN的保护性因素，另有发现，D等位基因是NIDDM发生蛋白尿的危险因素[6]。Sung报道了148例NIDDM患者，70例伴DN，78例无DN，结果表明ACE基因多态性与DN发病无关[7]。本研究观察到，无论IDDM还是NIDDM，DN发病与ACE多态性均有关联。IDDM组，II型及I等位基因在DN组频率显著低于非DN组，D等位基因在DN组频率显著高于非DN组；NIDDM患者中，DD型及D等位基因在DN组频率显著高于非DN组，II型及I等位基因频率显著低于非DN组，具有统计学意义，说明D等位基因及DD型是DN的危险因素，I等位基因及II型是DN的保护性因素，与Doi-Y报道相似[8]。关于ACE基因参与DN发病的机制尚未完全阐明，可能是通过调控机体ACE水平间接影响R-A系统，导致肾小球血流动力学改变而致DN。
, 百拇医药
本研究发现在河北地区汉族人中ACE基因与DN有明显相关性，为DN的防治提供了区域性科研资料及理论依据。通过对糖尿病患者ACE基因型的检测，可以早期发现DN高危易感人群，给予干预性治疗，防止DN发生或延缓DN进程，降低DN致残率，提高糖尿病患者的生存质量具有极大社会价值。
[基金来源]河北省科委资助项目(No.98276193 D)
[参考文献]
[1]Seaquist ER,Goetz FC,Rich S,et al.Familial clustering of diabetic kidney disease,evidence for genetic susceptibility to diabetic nephropathy.The New England Journal of medicine,1989,320(4):1161-4.
, http://www.100md.com
[2]Rigat B,Hubert C,Corvol P,et al.PCR detection of the insertion/deletion polymorphism of the human angiotensin convertion enzyme gene (DCPI) (dipeptidy1carboxypeptidase 1).Nucleic Acid Res,1992,20:1433.
[3]Hubert C,Honot A,Corvol P,et al.Structure of the angiotensin I converting enzyme gene.J Biol Chem,1991,266:15377.
[4]Tiret L,Rigat B,Visvikis S,et al.Evidence.from combined segregation and linkage analysis.That a variant of the angiotensin I-converting enzyme (ACE) gene controls plasma ACE levels.Am J Hum Genet,1992,51:197-205.
, http://www.100md.com
[5]Marre M,Bernadet P,Gallois Y,et al.Relationships between angiotensin I converting enzyme gene polymorphism,plasma levels,and diabetic retinal and renal complications.Diabetes,1994,43(3):384-388.
[6]Ohno T,Kawazu S,Tomono S,et al.Association analyses of the polymorphisms of angiotensin converting enzyme and angiotensinogenes with diabetic nephropathy in Japanese non-insulin-dependent diabeties.Metbolism,1996,45(2):218-222.
[7]Sung-kyu Ha,Jung-kun Seo.lnsertion/deletion polymorphism in ACE gene as a predictor progression of diabetic nephropathy.Kidney Int,1997,60:S-28-S-32.
[8]Doi-Y,Yoshizumi-H,Yoshinari-M,et al.Association between a polymorphism in the angiotensin converting enzyme gene and microvascular complications in Japanese patients with NIDDM.Diabetologia,1996,39(1):97-102.
[收稿：1999-06-09], http://www.100md.com
单位：河北医科大学第三医院肾内科，050051
关键词：
中国急救医学000417 糖尿病肾病(DN)是糖尿病的慢性并发症，是糖尿病患者的主要死亡原因之一，其发病机理未完全阐明，许多研究发现，DN的发病有家族聚集性，可能与遗传因素有关[1]。血管紧张素转换酶(angiotensin I convering enzyme,ACE)是肾素—血管紧张素(R-A)系统的关键酶，而机体ACE水平受ACE基因调控，因此国内外学者对ACE基因与DN的关系做了大量研究，但由于种族及生存环境的差异，结果不尽一致。为此，本文通过对河北地区汉族人ACE基因与DN发病关系的研究，阐明本地区DN发病与ACE基因的相关性，从遗传角度探讨DN的发病机制。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 研究对象
77例依赖胰岛素型糖尿病(IDDM)和72例非依赖胰岛素型糖尿病(NIDDM)选自我院内科门诊和住院患者，均为河北地区汉族人，符合1985年WHO关于IDDM及NIDDM的诊断标准，排除由心、肝及原发肾脏疾病引起蛋白尿者。IDDM组中尿白蛋白排泄率(UAE)>20 ug/min者38例，为DN组，年龄35.9±6.5岁，病程13.9±6.7年，其中男20例，女18例；UAE<29 ug/min者39例，为非DN组，年龄36.1±6.2岁，病程13.6±6.5年，其中男19例，女20例。NIDDM组中，UAE>20 ug/min者40例，为DN组，其中男21例，女19例，年龄62.8±5.6岁，病程12.2±2.4年；UAE<20 ug/min者32例，为非DN组，其中男18例，女14例，年龄62.9±6.1岁，病程12.8±3.1年。
1.2 方法
1.2.1 ACE基因分析
, 百拇医药
常规酚/氯仿法抽提患者基因组DNA，采用Rigat等[2]设计的PCR反应引物，正引物：5′-CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3′：负引物：5′-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGAT-3′(由协和医科大学基础所提供)，D等位基因PCR产物为190 Bp，Ⅰ等位基因PCR产物为490 Bp，反应体积为25 ul，Taq酶和dNTP为promaga产品。于TC-96 AE型PCR扩增仪上进行扩增反应，首先94℃变性2分钟，然后30个循环，每个循环94℃变性1分钟，58℃退火2分钟，72 ℃延伸1.5分钟，最后终末延伸72℃ 5分钟，反应产物行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，以PBR-322MSP I DNA为片段长度标志(华美生物工程公司提供)，EB染色，透射式紫外观察台观察结果。如图。
1.2.2 统计处理
计量资料以
±s表示，组间频率比较用χ2检验，采用POMS软件于计算机上完成。, http://www.100md.com
2 结果
经计算，NIDDM组及IDDM组ACE基因型及等位基因频率符合Hardy-Weinberg平衡，具群体代表性。
ACE基因型与IDDM和NIDDM伴DN的关系如表1及表2所示。结果表明，ACE基因与DN发病有关。
3 讨论
Hubert等[3]于1991年首先阐明了ACE基因的结构，次年Rigat等[2]报道了ACE基因的PCR扩增方法。人类ACE基因由26个外显子(EX)和25个内含子(IN)组成，位于17号染色体短臂2区3带。ACE基因的16内含子中插入或缺失一个长度为287 Bp的碱基片段，因此ACE基因存在三种基因型，即DD(Deletion)DI、II(Insertion)，两种等位基因D、I，人们将这种存在两种以上基因型的现象称基因多态现象。Tiret等于同年对ACE基因与ACE水平的关系做了研究，发现ACE水平的44%受ACE基因调控，DD型ACE水平最高，DI次之，II最低[4]。ACE是R-A系统的关键酶，R-A系统可通过不同机理参与糖尿病血管并发症的发生，因此，ACE基因与糖尿病血管并发症的关系受到国内外学者的广泛关注。
, http://www.100md.com
图 ACE基因PCR电泳结果
泳道1.7为DI型 2.4为DD型
3.6.8为II型 5为片段长度标志
表1 糖尿病伴DN与不伴DN者ACE基因型比较
基因型
IDDM
NIDDM
不伴DN
伴DN
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(n=39)
, 百拇医药
(n=38)
(n=32)
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IDDM组χ2=8.81 P=0.012 P<0.05
NIDDM组 χ2=10.15 P=0.006 P<0.01表2 糖尿病伴与不伴DN者ACE等位基因比较 等位基因
IDDM
NIDDM
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不伴DN
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(n=39)
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IDDM组χ2=6.05 P=0.014 P<0.05
NIDDM组 χ2=8.69 P=0.003 P<0.01
Marre等[5]报道了一组IDDM患者中62例伴DN，62例无DN，发现DN组ACE水平高，II型在DN组出现频率低，为DN的保护性因素，另有发现，D等位基因是NIDDM发生蛋白尿的危险因素[6]。Sung报道了148例NIDDM患者，70例伴DN，78例无DN，结果表明ACE基因多态性与DN发病无关[7]。本研究观察到，无论IDDM还是NIDDM，DN发病与ACE多态性均有关联。IDDM组，II型及I等位基因在DN组频率显著低于非DN组，D等位基因在DN组频率显著高于非DN组；NIDDM患者中，DD型及D等位基因在DN组频率显著高于非DN组，II型及I等位基因频率显著低于非DN组，具有统计学意义，说明D等位基因及DD型是DN的危险因素，I等位基因及II型是DN的保护性因素，与Doi-Y报道相似[8]。关于ACE基因参与DN发病的机制尚未完全阐明，可能是通过调控机体ACE水平间接影响R-A系统，导致肾小球血流动力学改变而致DN。
, 百拇医药
本研究发现在河北地区汉族人中ACE基因与DN有明显相关性，为DN的防治提供了区域性科研资料及理论依据。通过对糖尿病患者ACE基因型的检测，可以早期发现DN高危易感人群，给予干预性治疗，防止DN发生或延缓DN进程，降低DN致残率，提高糖尿病患者的生存质量具有极大社会价值。
[基金来源]河北省科委资助项目(No.98276193 D)
[参考文献]
[1]Seaquist ER,Goetz FC,Rich S,et al.Familial clustering of diabetic kidney disease,evidence for genetic susceptibility to diabetic nephropathy.The New England Journal of medicine,1989,320(4):1161-4.
, http://www.100md.com
[2]Rigat B,Hubert C,Corvol P,et al.PCR detection of the insertion/deletion polymorphism of the human angiotensin convertion enzyme gene (DCPI) (dipeptidy1carboxypeptidase 1).Nucleic Acid Res,1992,20:1433.
[3]Hubert C,Honot A,Corvol P,et al.Structure of the angiotensin I converting enzyme gene.J Biol Chem,1991,266:15377.
[4]Tiret L,Rigat B,Visvikis S,et al.Evidence.from combined segregation and linkage analysis.That a variant of the angiotensin I-converting enzyme (ACE) gene controls plasma ACE levels.Am J Hum Genet,1992,51:197-205.
, http://www.100md.com
[5]Marre M,Bernadet P,Gallois Y,et al.Relationships between angiotensin I converting enzyme gene polymorphism,plasma levels,and diabetic retinal and renal complications.Diabetes,1994,43(3):384-388.
[6]Ohno T,Kawazu S,Tomono S,et al.Association analyses of the polymorphisms of angiotensin converting enzyme and angiotensinogenes with diabetic nephropathy in Japanese non-insulin-dependent diabeties.Metbolism,1996,45(2):218-222.
[7]Sung-kyu Ha,Jung-kun Seo.lnsertion/deletion polymorphism in ACE gene as a predictor progression of diabetic nephropathy.Kidney Int,1997,60:S-28-S-32.
[8]Doi-Y,Yoshizumi-H,Yoshinari-M,et al.Association between a polymorphism in the angiotensin converting enzyme gene and microvascular complications in Japanese patients with NIDDM.Diabetologia,1996,39(1):97-102.
[收稿：1999-06-09], http://www.100md.com