巴戟天离体培养及植株再生的研究
作者：贺红 肖省娥 冼建春 徐鸿华
单位：广州中医药大学中药学院，广州 510405
关键词：巴戟天/生长和发育；@离体培养；@植株再生
广州中医药大学学报000420摘要：以巴戟天无菌苗的茎尖、带节茎、无节茎为材料进行离体培养。结果表明：外植体表面消毒采用70%乙醇预处理30s，再用0.1%的升汞浸泡10～15min，效果较好。茎尖和带节茎培养，于含有6-苄基氨基嘌呤(6-benzylaminopurine。BA)的Murashige and Tucker(MT)培养基上，均能直接出芽，带节茎出芽率最高，为97.5%。适宜的BA浓度为1mg.L-1，BA浓度升高，出芽率下降。根的诱导，以MT加0.2～0.5 mg.L-1的萘乙酸(naphthlene acetic acid,NAA)培养基较好，生根率可达80.0%以上。
, http://www.100md.com
中国分类号：S567 文献标识码：A
文章编号：1007-3213(2000)04-0353-02
In-Vitro Culture and Plant Regeneration of Morinda officinalis How
HE Hong, XIAO Sheng'e, XIAN Jianchun, XU Honghua
(Institute of Chinese Materia Medica, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China)
Abstract: The sterile stem tips, nodular and non-nodular stem of Morinda officinalis How were cultured in vitro. The results showed that the most suitable procedure for sterilization of explants was soaking into 0.1% HgCl2 solution for 10 to 15 minutes after pretreating with 70% ethanol for 30 seconds. MT culture medium with BA was effective to induce direct shooting of stem tips and nodular stem, the shooting rate of nodular stem being 97.5%. The optimal BA concentration was 1 mg.L-1 , the shooting rate would decrease when the concentration of BA increased. As for the induction of rooting, MT culture medium adding with 0.2 to 0.5 mg.L-1 NAA was optimal, the rooting rate being over 80.0%.
, 百拇医药
Key words: MORINDA OFFICINALIS/growth and development;@IN-VITRO CULTURE; @PLANT REGENERATION
巴戟天(Morinda officinalis How)为我国四大南药之一，具有补肾壮阳、强筋骨、祛风湿的功效，为重要的出口创汇药材[1]。但巴戟天易感染枯萎病，严重影响其产量和质量，迫切需要培养抗病、质优的新品种[2，3]。近年来，通过基因转移提高植物的抗病性，为植物抗病育种开辟了一条新途径，但要进行遗传转化，首先必须建立高效的植株再生系统。本研究以巴戟天无菌苗的茎尖、带节茎及无节茎为材料，进行了离体培养的研究，为遗传转化提供良好的组织培养再生体系。
1 材料与方法
1.1 实验材料 巴戟天外植体取自广州中医药大学药圃。
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1.2 材料处理与培养 采取巴戟天植株的顶芽或侧芽，先用70%乙醇预处理30s，再用0.1%的升汞消毒10～15min，然后用无菌水冲洗4～5次，接种于Murashige and Tucker(MT)培养基上生长。待苗茎长有3～4个节段时，分别剪取1cm长的茎尖、带节茎及无节茎，进行诱导培养，培养基为MT附加不同浓度的6-苄基氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，BA)、萘乙酸(naphthalene acetic acid,NAA),每天光照16h，培养温度为(26±1)℃。
2 结果与分析
2.1 不同外植体出芽能力的差异 巴戟天不同外植体茎尖、带节茎及无节茎在附加BA 1mg*L-1的MT培养基上进行培养，试验结果如表1。外植体接种1周左右，开始变绿膨大，2周后陆续分化形成不定芽。茎尖、带节茎具有分化芽的能力，带节茎出芽率最高，达97.5%，茎尖次之，为76.2%，而无节茎无芽发生，形成芽所需时间，带节茎一般培养15d左右即能出芽，而茎尖需要25d，这在一定程度上也反映了分化芽能力的大小。因此，巴戟天在进行无性系快速繁殖、人工诱变及遗传转化时，无菌苗的带节茎是较好的材料，不仅出芽率高，而且出芽快。
, 百拇医药
表1 不同外植体出芽能力比较 外植体
N外植体
/块
p出芽率
/%
t出芽天数
/d
茎尖
42
76.2
25
带节茎
, 百拇医药
40
97.5
15
无节茎
45
0
—
2.2 BA浓度对出芽的影响 试验表明，BA对巴戟天外植体出芽效果较好。现以带节茎为材料，以MT为基本培养基加入不同浓度的BA进行试验。表2可见，BA为1mg*L-1时，带节茎出芽率最高，达97.8%，BA浓度继续升高，出芽率随之下降。试验中也观察到，BA浓度升高至4mg*L-1时，产生的芽短缩，茎难以伸长，说明高浓度的BA对芽的生长有抑制作用。在未加BA的MT培养基上，亦能够部分形成芽，出芽率为58.0%。单个外植体诱导芽的数量与BA浓度有关，不加BA时，主要形成单芽，而附加BA能增加单个外植体成芽的数量(表2)。表2 不同BA浓度对带节茎形成芽的影响 ρBA/(mg.L-1)
, http://www.100md.com
N外植体
/块
p出芽率
/%
N单个外植体诱导芽
/个
0
43
58.0
1～2
0.5
40
, 百拇医药 90.0
2～3
1.0
45
97.8
3～4
2.0
38
89.5
3～5
4.0
42
85.7
, http://www.100md.com 5个以上
2.3 根的诱导 巴戟天组织培养诱导形成的芽，生长至2cm长时，切下转入含有生长素的生根培养基，转瓶后一般1个月左右开始形成根，获得完整植株。试验表明，以MT基本培养基附加0.2～0.5 mg.L-1NAA效果较好，生根率可达80.0%以上；NAA浓度继续增加，则易于在根茎交接处形成愈伤组织，影响试管苗的移栽；在不含NAA的MT培养基上，亦能诱导生根，但生根率较低。
2.4 幼苗移栽 试管苗移栽能否成活，是用组培法进行快繁的重要一环。只有生根试管苗经过移栽后，根能长出新根和根尖，并能从土壤中或其他栽培介质中吸取水分及养分，才能成活。方法是选取已生根的健壮的巴戟天试管苗，揭开瓶塞，让幼苗在自然光下或培养室光照下锻炼2d，然后取出转入已消毒的细沙中沙培炼苗，添加1/2MT培养液作养分，待生长稳定，长出新叶后移栽于露天种植，幼苗移栽获得成活。一般成活率在90%左右。
, 百拇医药
3 讨论
建立高效稳定的组织培养再生体系是利用遗传转化技术获得转基因植株的重要前提之一。巴戟天的组织培养，已有的报道是通过外植体诱导愈伤组织，再经愈伤组织的器官发生再生植株[4]，但诱导成芽的比率不是很高，且再生时间长。本试验用巴戟天的茎尖及带节茎培养，诱导直接出芽，获得了较高的不定芽分化频率，且出芽速度快，为遗传转化工作的开展及转化效率的提高创造了条件。
巴戟天带节茎培养诱导直接出芽，在MT基本培养基上，不加任何激素，也有较高的出芽率；无根苗在MT培养基上也能部分生根，这说明外植体及其再生芽，含有较高的内源激素，本身具有较强再生能力，这对于巴戟天组织培养是一个有利条件。
在巴戟天组织培养的过程中，植物激素起着重要作用，一定的外源激素水平，可能调节内源激素的配比，从而有利于再生器官的诱导和分化，这种离体培养较之于活体提供了一个更为一致和可控的系统，这对于培育新品种，获得新种质，具有重要意义。
, 百拇医药
基金项目：广东省自然科学基金博士启动基金资助(编号：984117)及国家自然科学基金(编号：30070924)
作者简介：贺红(1967-)，女，理学博士，副研究员
参考文献：
[1] 徐鸿华，林励，邓沛峰，等.巴戟天高产优质途径的研究[J].广州中医学院学报，1992，9(3)：155
[2] 时雪荣.巴戟天枯萎病的病原菌鉴定[J].植物病理学报，1988，18(3)：137
[3] 林励，徐鸿华，姚幼玲，等.巴戟天枯萎病对寄主显微构造及成分的影响[J].中国中药杂志，1993，18(7)：401
[4] 徐鸿华，邓沛峰，林励，等.巴戟天良种选育快繁技术研究[J].中药材，1993，16(4)：16
收稿日期：2000-03-28, 百拇医药
单位：广州中医药大学中药学院，广州 510405
关键词：巴戟天/生长和发育；@离体培养；@植株再生
广州中医药大学学报000420摘要：以巴戟天无菌苗的茎尖、带节茎、无节茎为材料进行离体培养。结果表明：外植体表面消毒采用70%乙醇预处理30s，再用0.1%的升汞浸泡10～15min，效果较好。茎尖和带节茎培养，于含有6-苄基氨基嘌呤(6-benzylaminopurine。BA)的Murashige and Tucker(MT)培养基上，均能直接出芽，带节茎出芽率最高，为97.5%。适宜的BA浓度为1mg.L-1，BA浓度升高，出芽率下降。根的诱导，以MT加0.2～0.5 mg.L-1的萘乙酸(naphthlene acetic acid,NAA)培养基较好，生根率可达80.0%以上。
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中国分类号：S567 文献标识码：A
文章编号：1007-3213(2000)04-0353-02
In-Vitro Culture and Plant Regeneration of Morinda officinalis How
HE Hong, XIAO Sheng'e, XIAN Jianchun, XU Honghua
(Institute of Chinese Materia Medica, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China)
Abstract: The sterile stem tips, nodular and non-nodular stem of Morinda officinalis How were cultured in vitro. The results showed that the most suitable procedure for sterilization of explants was soaking into 0.1% HgCl2 solution for 10 to 15 minutes after pretreating with 70% ethanol for 30 seconds. MT culture medium with BA was effective to induce direct shooting of stem tips and nodular stem, the shooting rate of nodular stem being 97.5%. The optimal BA concentration was 1 mg.L-1 , the shooting rate would decrease when the concentration of BA increased. As for the induction of rooting, MT culture medium adding with 0.2 to 0.5 mg.L-1 NAA was optimal, the rooting rate being over 80.0%.
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Key words: MORINDA OFFICINALIS/growth and development;@IN-VITRO CULTURE; @PLANT REGENERATION
巴戟天(Morinda officinalis How)为我国四大南药之一，具有补肾壮阳、强筋骨、祛风湿的功效，为重要的出口创汇药材[1]。但巴戟天易感染枯萎病，严重影响其产量和质量，迫切需要培养抗病、质优的新品种[2，3]。近年来，通过基因转移提高植物的抗病性，为植物抗病育种开辟了一条新途径，但要进行遗传转化，首先必须建立高效的植株再生系统。本研究以巴戟天无菌苗的茎尖、带节茎及无节茎为材料，进行了离体培养的研究，为遗传转化提供良好的组织培养再生体系。
1 材料与方法
1.1 实验材料 巴戟天外植体取自广州中医药大学药圃。
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1.2 材料处理与培养 采取巴戟天植株的顶芽或侧芽，先用70%乙醇预处理30s，再用0.1%的升汞消毒10～15min，然后用无菌水冲洗4～5次，接种于Murashige and Tucker(MT)培养基上生长。待苗茎长有3～4个节段时，分别剪取1cm长的茎尖、带节茎及无节茎，进行诱导培养，培养基为MT附加不同浓度的6-苄基氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，BA)、萘乙酸(naphthalene acetic acid,NAA),每天光照16h，培养温度为(26±1)℃。
2 结果与分析
2.1 不同外植体出芽能力的差异 巴戟天不同外植体茎尖、带节茎及无节茎在附加BA 1mg*L-1的MT培养基上进行培养，试验结果如表1。外植体接种1周左右，开始变绿膨大，2周后陆续分化形成不定芽。茎尖、带节茎具有分化芽的能力，带节茎出芽率最高，达97.5%，茎尖次之，为76.2%，而无节茎无芽发生，形成芽所需时间，带节茎一般培养15d左右即能出芽，而茎尖需要25d，这在一定程度上也反映了分化芽能力的大小。因此，巴戟天在进行无性系快速繁殖、人工诱变及遗传转化时，无菌苗的带节茎是较好的材料，不仅出芽率高，而且出芽快。
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表1 不同外植体出芽能力比较 外植体
N外植体
/块
p出芽率
/%
t出芽天数
/d
茎尖
42
76.2
25
带节茎
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40
97.5
15
无节茎
45
0
—
2.2 BA浓度对出芽的影响 试验表明，BA对巴戟天外植体出芽效果较好。现以带节茎为材料，以MT为基本培养基加入不同浓度的BA进行试验。表2可见，BA为1mg*L-1时，带节茎出芽率最高，达97.8%，BA浓度继续升高，出芽率随之下降。试验中也观察到，BA浓度升高至4mg*L-1时，产生的芽短缩，茎难以伸长，说明高浓度的BA对芽的生长有抑制作用。在未加BA的MT培养基上，亦能够部分形成芽，出芽率为58.0%。单个外植体诱导芽的数量与BA浓度有关，不加BA时，主要形成单芽，而附加BA能增加单个外植体成芽的数量(表2)。表2 不同BA浓度对带节茎形成芽的影响 ρBA/(mg.L-1)
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N外植体
/块
p出芽率
/%
N单个外植体诱导芽
/个
0
43
58.0
1～2
0.5
40
, 百拇医药 90.0
2～3
1.0
45
97.8
3～4
2.0
38
89.5
3～5
4.0
42
85.7
, http://www.100md.com 5个以上
2.3 根的诱导 巴戟天组织培养诱导形成的芽，生长至2cm长时，切下转入含有生长素的生根培养基，转瓶后一般1个月左右开始形成根，获得完整植株。试验表明，以MT基本培养基附加0.2～0.5 mg.L-1NAA效果较好，生根率可达80.0%以上；NAA浓度继续增加，则易于在根茎交接处形成愈伤组织，影响试管苗的移栽；在不含NAA的MT培养基上，亦能诱导生根，但生根率较低。
2.4 幼苗移栽 试管苗移栽能否成活，是用组培法进行快繁的重要一环。只有生根试管苗经过移栽后，根能长出新根和根尖，并能从土壤中或其他栽培介质中吸取水分及养分，才能成活。方法是选取已生根的健壮的巴戟天试管苗，揭开瓶塞，让幼苗在自然光下或培养室光照下锻炼2d，然后取出转入已消毒的细沙中沙培炼苗，添加1/2MT培养液作养分，待生长稳定，长出新叶后移栽于露天种植，幼苗移栽获得成活。一般成活率在90%左右。
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3 讨论
建立高效稳定的组织培养再生体系是利用遗传转化技术获得转基因植株的重要前提之一。巴戟天的组织培养，已有的报道是通过外植体诱导愈伤组织，再经愈伤组织的器官发生再生植株[4]，但诱导成芽的比率不是很高，且再生时间长。本试验用巴戟天的茎尖及带节茎培养，诱导直接出芽，获得了较高的不定芽分化频率，且出芽速度快，为遗传转化工作的开展及转化效率的提高创造了条件。
巴戟天带节茎培养诱导直接出芽，在MT基本培养基上，不加任何激素，也有较高的出芽率；无根苗在MT培养基上也能部分生根，这说明外植体及其再生芽，含有较高的内源激素，本身具有较强再生能力，这对于巴戟天组织培养是一个有利条件。
在巴戟天组织培养的过程中，植物激素起着重要作用，一定的外源激素水平，可能调节内源激素的配比，从而有利于再生器官的诱导和分化，这种离体培养较之于活体提供了一个更为一致和可控的系统，这对于培育新品种，获得新种质，具有重要意义。
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基金项目：广东省自然科学基金博士启动基金资助(编号：984117)及国家自然科学基金(编号：30070924)
作者简介：贺红(1967-)，女，理学博士，副研究员
参考文献：
[1] 徐鸿华，林励，邓沛峰，等.巴戟天高产优质途径的研究[J].广州中医学院学报，1992，9(3)：155
[2] 时雪荣.巴戟天枯萎病的病原菌鉴定[J].植物病理学报，1988，18(3)：137
[3] 林励，徐鸿华，姚幼玲，等.巴戟天枯萎病对寄主显微构造及成分的影响[J].中国中药杂志，1993，18(7)：401
[4] 徐鸿华，邓沛峰，林励，等.巴戟天良种选育快繁技术研究[J].中药材，1993，16(4)：16
收稿日期：2000-03-28, 百拇医药