中焦湿阻证大鼠红细胞膜Na＋-K＋ATP酶活性研究
作者：黄秀深 赵燕 张力华 贾波
单位：成都中医药大学，四川 成都 610075
关键词：中焦湿阻证；红细胞膜；Na+-K+ATP酶
成都中医药大学学报000409 摘 要： 目的：观察中焦湿阻证大鼠红细胞膜Na+-K+ATP酶活性的变化。方法：采用红细胞溶血液细胞膜钠钾活性试剂盒，测定中焦湿阻证模型组、中药治疗组、自然恢复组及正常对照组大鼠红细胞膜Na+-K+ATP酶活性。结果：中焦湿阻证大鼠红细胞膜Na+-K+ATP酶活性降低，与正常大鼠相比有极显著性差异(P<0.001)。经芳香化湿中药治疗后，钠钾泵活性逐渐恢复(P<0.001)。结论：中焦湿阻证大鼠红细胞膜Na+-K+ATP酶活性显著降低。
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中图分类号： R241.8；R318.021 文献标识码：A 文章编号：1004-0668(2000)04-0023-0002
中焦湿阻证是临床常见病证。湿邪的产生与水液运化失调有关。Na+-K+ATP酶是生物体内广泛存在的一种重要的膜酶，其主要功能是将细胞内钠离子运送到细胞外，细胞外钾离子转送到细胞内，维持细胞膜的内外渗透压平衡，进而维持细胞内外的水平衡。为探讨中焦湿阻证的病理改变，我们观察了中焦湿阻证治疗前后的钠钾泵活性。现将实验结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
SD系大白鼠60只，雌雄各半，体重220～250g，月龄3～4月，由成都中医药大学动物实验中心提供。随机分为正常对照组、中焦湿阻证模型组、中药治疗组、自然恢复组4组。前两组每组各10只大鼠，后两组每组各20只大鼠。动物标准颗粒饲料由成都中医药大学动物实验中心提供。
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1.2 实验材料
红细胞膜Na+-K+ATP酶测试盒由南京建成生物工程研究所提供。 F-33半自动生化分析仪(澳大利亚TRACE公司)，移液器(Giasen公司生产)，一次性玻璃试管(肝素钠管及普通管，由成都瑞奇公司生产)。一加减正气散(源自《温病条辨*中焦篇》)，生药由成都同仁堂药店提供。
1.3 一加减正气散水煎剂的制备
药物组成：藿香梗、厚朴、杏仁、茯苓皮、绵茵陈各16 g；神曲、麦芽各12 g；广皮、大腹皮各8 g。
将药物加水100 mL浸泡30 min，再加入水150mL，煎熬15min，得药液120mL，制成1g/mL生药浓度的中药煎剂，放40℃冰箱备用。
1.4 动物湿阻模型的制备
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中焦湿阻证模型制备依照文献[1]的方法，实验室温度25～29℃，随机取50只大鼠为造模动物，每日定时放入水深20cm，水温25～27℃的水槽中游泳15 min。游泳完毕，立即予20 mL/kg约4℃自来水灌胃，然后将动物置于笼底积有4mm水的养笼中饲养，自由进食饮水。上述过程每日1次，连续5天。造模大鼠在造模第二天开始，进食量、饮水量及活动量减少，体重有下降趋势，三四天左右，大鼠活动明显减少，倦卧疲乏，皮毛松散有脱毛现象，部分大鼠出现便溏现象。
正常对照组大鼠于正常环境中喂养，温度19～25℃，相对湿度42%～65%，自由进食饮水。
1.5 造模后处理
动物造型成功后，随机取10只大鼠(中焦湿阻证模型组)及正常对照组大鼠于次日处死，测定红细胞膜Na+-K+ATP酶活性。剩下40只大鼠于正常环境中饲养。中药治疗组动物按1g/100g生药剂量每天灌胃1次。自然恢复组每日以常温等量的自来水灌胃。给药2天后，中药治疗组及自然恢复组随机各取10只大鼠处死，测定钠钾泵活性，剩下两组动物按同样方法继续灌胃2天后处死，测定红细胞膜Na+-K+ATP酶活性。
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1.6 红细胞溶血液的制备
1.6.1 洗涤红细胞
采用大鼠股动脉放血法取新鲜全血1 mL，肝素抗凝。测定红细胞个数。加4倍生理盐水，轻轻混匀，1000-1500 r/min离心5～10 min，弃上清留沉淀的红细胞，按此方法反复离心3次留沉淀的红细胞。
1.6.2 制备溶血液
在上述沉淀的红细胞中加入双蒸水至2mL,在旋涡混匀器上混匀2min，在4℃冰箱中放置15min。取出后再混匀2min，常温下放置15min，促其充分溶血。
1.6.3 测定Na+-K+ATP酶活性
(1)测定方法：取样200 μL按说明书进行ATP酶测试，将F-33半自动生化分析仪调于660 nm处测得A、B、C、D四管吸光度OD值。
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(2) 钠钾泵活性定义：以每小时每107个红细胞的ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个ATP酶活力单位，即微克分子磷/107RBC/h(μmolpi/107个RBC/h)ATPase活力＝(测定管OD值∕标准管OD值)×标准管磷含量×反应液中样品稀释倍数×6×0.2 mL溶血液中RBC个数/107(酶促反应时间为10min，酶活力定义为1 h，故乘以6)。
(3)钠钾泵活性的计算：(B管-A管)/标准管OD×标准管磷含量(0.1 μmol)×反应液中样品稀释倍数×6×0.2 mL溶血液中RBC个数/107。
1.7 统计方法
全部数据以均数±标准差(
±s)表示，组间均数的比较采用t检验。
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2 实验结果
各组红细胞膜钠钾泵活性以及各组间的相互比较结果见表1 。
3 讨论
湿是临床上最常见的病因之一，既可外感，也可内生。湿病在我国南方地区为常见病，多发病。湿邪的产生与水液运化失调有关，而三焦为水道，因而水液代谢与三焦关系密切，其中尤以中焦脾胃最为重要。中焦脾胃不健，水谷不运，乃致水湿停滞。现代医学认为钠钾泵维持着细胞内外离子的正常分布
表1 正常对照组、中焦湿阻证造型组、中药治疗组及自然恢复组红细胞膜Na+-K+ATP酶活力比较(钠钾泵活性单位μmol Pi/107RBC/h，±s)
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组别
n
钠钾泵活力
正常对照组
10
14.57±0.691
湿阻造型组
10
7.92±1.27
中药治疗组
20
给药2天：
8.95±0.834
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给药4天：
13.97±0.583△△
自然恢复组
20
给自来水2天：
8.23±0.74
给自来水4天：
8.52±0.69
与正常对照组比较，P<0.01；与自然恢复组比较，△△P<0.01
和渗透压平衡，进而维持细胞内外的水平衡。本实验研究发现中焦湿阻证大鼠的红细胞膜Na+-K+ATP酶活性与正常大鼠相比明显下降(P<0.001)。因而提示钠钾泵活性的下降是中焦湿阻证的基本病理改变之一。
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中医学认为湿为阴邪，其性粘滞，最易阻滞气机而致中焦升降失司。《温病条辨*中焦篇》曰：“三焦湿郁，升降失司，脘连腹胀，大便不爽，一加减正气散主之。……此以升降中焦为定法……以藿香化浊，厚朴、广皮、茯苓、大腹泻湿满，加杏仁利肺与大肠之气，神曲、麦芽升降脾胃之气，茵陈宣湿郁而动生发之气。”本研究发现中焦湿阻证大鼠经一加减正气散治疗后，钠钾泵的活性逐渐恢复正常，其值显著高于自然恢复组(P<0.001)，说明具有芳香化湿功效的一加减正气散能恢复中焦湿阻证大鼠RBC膜钠钾泵活性，进一步证明中焦湿阻证的病理改变与RBC膜钠钾泵活性降低有关。 参考文献
1，邱赛红.芳香化湿药开胃作用机理的实验研究Ⅱ-对湿困动物模型的影响.中药药理与临床，1997，13(2)：1
2，清.吴塘.温病条辨.北京：人民卫生出版社，1967.35
收稿日期：2000-09-11, http://www.100md.com
单位：成都中医药大学，四川 成都 610075
关键词：中焦湿阻证；红细胞膜；Na+-K+ATP酶
成都中医药大学学报000409 摘 要： 目的：观察中焦湿阻证大鼠红细胞膜Na+-K+ATP酶活性的变化。方法：采用红细胞溶血液细胞膜钠钾活性试剂盒，测定中焦湿阻证模型组、中药治疗组、自然恢复组及正常对照组大鼠红细胞膜Na+-K+ATP酶活性。结果：中焦湿阻证大鼠红细胞膜Na+-K+ATP酶活性降低，与正常大鼠相比有极显著性差异(P<0.001)。经芳香化湿中药治疗后，钠钾泵活性逐渐恢复(P<0.001)。结论：中焦湿阻证大鼠红细胞膜Na+-K+ATP酶活性显著降低。
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中图分类号： R241.8；R318.021 文献标识码：A 文章编号：1004-0668(2000)04-0023-0002
中焦湿阻证是临床常见病证。湿邪的产生与水液运化失调有关。Na+-K+ATP酶是生物体内广泛存在的一种重要的膜酶，其主要功能是将细胞内钠离子运送到细胞外，细胞外钾离子转送到细胞内，维持细胞膜的内外渗透压平衡，进而维持细胞内外的水平衡。为探讨中焦湿阻证的病理改变，我们观察了中焦湿阻证治疗前后的钠钾泵活性。现将实验结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
SD系大白鼠60只，雌雄各半，体重220～250g，月龄3～4月，由成都中医药大学动物实验中心提供。随机分为正常对照组、中焦湿阻证模型组、中药治疗组、自然恢复组4组。前两组每组各10只大鼠，后两组每组各20只大鼠。动物标准颗粒饲料由成都中医药大学动物实验中心提供。
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1.2 实验材料
红细胞膜Na+-K+ATP酶测试盒由南京建成生物工程研究所提供。 F-33半自动生化分析仪(澳大利亚TRACE公司)，移液器(Giasen公司生产)，一次性玻璃试管(肝素钠管及普通管，由成都瑞奇公司生产)。一加减正气散(源自《温病条辨*中焦篇》)，生药由成都同仁堂药店提供。
1.3 一加减正气散水煎剂的制备
药物组成：藿香梗、厚朴、杏仁、茯苓皮、绵茵陈各16 g；神曲、麦芽各12 g；广皮、大腹皮各8 g。
将药物加水100 mL浸泡30 min，再加入水150mL，煎熬15min，得药液120mL，制成1g/mL生药浓度的中药煎剂，放40℃冰箱备用。
1.4 动物湿阻模型的制备
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中焦湿阻证模型制备依照文献[1]的方法，实验室温度25～29℃，随机取50只大鼠为造模动物，每日定时放入水深20cm，水温25～27℃的水槽中游泳15 min。游泳完毕，立即予20 mL/kg约4℃自来水灌胃，然后将动物置于笼底积有4mm水的养笼中饲养，自由进食饮水。上述过程每日1次，连续5天。造模大鼠在造模第二天开始，进食量、饮水量及活动量减少，体重有下降趋势，三四天左右，大鼠活动明显减少，倦卧疲乏，皮毛松散有脱毛现象，部分大鼠出现便溏现象。
正常对照组大鼠于正常环境中喂养，温度19～25℃，相对湿度42%～65%，自由进食饮水。
1.5 造模后处理
动物造型成功后，随机取10只大鼠(中焦湿阻证模型组)及正常对照组大鼠于次日处死，测定红细胞膜Na+-K+ATP酶活性。剩下40只大鼠于正常环境中饲养。中药治疗组动物按1g/100g生药剂量每天灌胃1次。自然恢复组每日以常温等量的自来水灌胃。给药2天后，中药治疗组及自然恢复组随机各取10只大鼠处死，测定钠钾泵活性，剩下两组动物按同样方法继续灌胃2天后处死，测定红细胞膜Na+-K+ATP酶活性。
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1.6 红细胞溶血液的制备
1.6.1 洗涤红细胞
采用大鼠股动脉放血法取新鲜全血1 mL，肝素抗凝。测定红细胞个数。加4倍生理盐水，轻轻混匀，1000-1500 r/min离心5～10 min，弃上清留沉淀的红细胞，按此方法反复离心3次留沉淀的红细胞。
1.6.2 制备溶血液
在上述沉淀的红细胞中加入双蒸水至2mL,在旋涡混匀器上混匀2min，在4℃冰箱中放置15min。取出后再混匀2min，常温下放置15min，促其充分溶血。
1.6.3 测定Na+-K+ATP酶活性
(1)测定方法：取样200 μL按说明书进行ATP酶测试，将F-33半自动生化分析仪调于660 nm处测得A、B、C、D四管吸光度OD值。
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(2) 钠钾泵活性定义：以每小时每107个红细胞的ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个ATP酶活力单位，即微克分子磷/107RBC/h(μmolpi/107个RBC/h)ATPase活力＝(测定管OD值∕标准管OD值)×标准管磷含量×反应液中样品稀释倍数×6×0.2 mL溶血液中RBC个数/107(酶促反应时间为10min，酶活力定义为1 h，故乘以6)。
(3)钠钾泵活性的计算：(B管-A管)/标准管OD×标准管磷含量(0.1 μmol)×反应液中样品稀释倍数×6×0.2 mL溶血液中RBC个数/107。
1.7 统计方法
全部数据以均数±标准差(
±s)表示，组间均数的比较采用t检验。, http://www.100md.com
2 实验结果
各组红细胞膜钠钾泵活性以及各组间的相互比较结果见表1 。
3 讨论
湿是临床上最常见的病因之一，既可外感，也可内生。湿病在我国南方地区为常见病，多发病。湿邪的产生与水液运化失调有关，而三焦为水道，因而水液代谢与三焦关系密切，其中尤以中焦脾胃最为重要。中焦脾胃不健，水谷不运，乃致水湿停滞。现代医学认为钠钾泵维持着细胞内外离子的正常分布
表1 正常对照组、中焦湿阻证造型组、中药治疗组及自然恢复组红细胞膜Na+-K+ATP酶活力比较(钠钾泵活性单位μmol Pi/107RBC/h，
±s), http://www.100md.com
组别
n
钠钾泵活力
正常对照组
10
14.57±0.691
湿阻造型组
10
7.92±1.27
中药治疗组
20
给药2天：
8.95±0.834
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给药4天：
13.97±0.583△△
自然恢复组
20
给自来水2天：
8.23±0.74
给自来水4天：
8.52±0.69
与正常对照组比较，P<0.01；与自然恢复组比较，△△P<0.01
和渗透压平衡，进而维持细胞内外的水平衡。本实验研究发现中焦湿阻证大鼠的红细胞膜Na+-K+ATP酶活性与正常大鼠相比明显下降(P<0.001)。因而提示钠钾泵活性的下降是中焦湿阻证的基本病理改变之一。
, 百拇医药
中医学认为湿为阴邪，其性粘滞，最易阻滞气机而致中焦升降失司。《温病条辨*中焦篇》曰：“三焦湿郁，升降失司，脘连腹胀，大便不爽，一加减正气散主之。……此以升降中焦为定法……以藿香化浊，厚朴、广皮、茯苓、大腹泻湿满，加杏仁利肺与大肠之气，神曲、麦芽升降脾胃之气，茵陈宣湿郁而动生发之气。”本研究发现中焦湿阻证大鼠经一加减正气散治疗后，钠钾泵的活性逐渐恢复正常，其值显著高于自然恢复组(P<0.001)，说明具有芳香化湿功效的一加减正气散能恢复中焦湿阻证大鼠RBC膜钠钾泵活性，进一步证明中焦湿阻证的病理改变与RBC膜钠钾泵活性降低有关。 参考文献
1，邱赛红.芳香化湿药开胃作用机理的实验研究Ⅱ-对湿困动物模型的影响.中药药理与临床，1997，13(2)：1
2，清.吴塘.温病条辨.北京：人民卫生出版社，1967.35
收稿日期：2000-09-11, http://www.100md.com