青椒碱对实验性肝癌细胞骨架影响的电镜观察
作者：白锦雯 张颖 杨美娟 吴菁
单位：北京中医药大学组织胚胎学教研室 北京100029
关键词：细胞骨架；电镜技术；肝癌；细胞培养；青椒碱
北京中医药大学学报000412
摘要： 用二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌动物模型，以青椒碱治疗，分离肝细胞原代培养，应用整装细胞电镜技术结合选择性抽提观察细胞骨架。结果显示DEN诱发大鼠肝癌细胞的骨架丝状结构遭到破坏、断裂并聚集成团块，治疗组细胞骨架有明显的恢复。提示青椒碱可通过影响细胞骨架对大鼠实验性肝癌细胞起到治疗作用。
中图分类号：R285.5
Effects of Schinifoline on Cytoskeleton of Experimental Hepatoma in Rats
, http://www.100md.com
Observed by Whole Mount Cell Transmission Electron Microscopy
Bai Jinwen Zhang Ying Yang Meijuan et al.
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
ABSTRACT：Whole mount cell transmission electron microscopy combined with selective extraction method was adopted to study the effect of schinifoline on hepatocellular cytoskeleton of experimental hepatoma. It was shown that the filaments of the cytoskeletons of the transformed cells induced by DEN were obviously damaged, depolymerized and aggregated. After the treatment with schinifoline, the cytoskeletal system of the transformed cells recovered apparently. So schinifoline can be used to treat on the experimental liver cancer cells in rat by influencing cytoskeleton.
, http://www.100md.com
KEY WORDS: Cytoskeleton; Electron microscopy; Hepotoma; Cell culture; Schinifoline
细胞骨架系统是一类复杂的蛋白质纤维结构，这些结构与细胞的病理过程密切相关，有助于我们揭示肿瘤的秘密。大量的实验证明癌变细胞的骨架结构发生明显改变，但对诱癌后原代培养的肝细胞骨架研究尚未见报道。本实验采用大鼠原代培养肝细胞，应用整装细胞电镜技术，结合选择性抽提方法，观察二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌及青椒碱治疗后的肝细胞内中等纤维的变化，为进一步探讨青椒碱对肿瘤细胞的作用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物
Wistar大鼠36只，雌雄兼用，体重150～180 g，购于中国中医研究院实验动物中心。
, http://www.100md.com
1.2 药物
青椒碱，由北京中医药大学中药学院中药化学教研室提供。用1%羧甲基纤维素(CMC)配成2%混悬液。
1.3 实验分组与肝癌动物模型的复制
将大鼠随机分为对照、诱癌和治疗3个组。对照组不做任何处理。诱癌组与治疗组分别于实验第1天经腹腔1次性注射致癌启动剂DEN(Sigma公司制品)，200 mg/kg体重(配制成1%DEN生理盐水溶液)，10 d后第1次口服促癌剂50%CCL4、橄榄油溶液，2 mL/kg体重，隔3 d第2次口服CCL4。于实验第4周起自由饮服0.05%苯巴比妥水溶液30 d，治疗组同时每日灌服青椒碱200 mg/kg体重，共20 d。实验第16周进行肝细胞的分离和培养。
1.4 肝细胞的分离与培养
, http://www.100md.com
大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，暴露肝脏，门静脉插管，在无菌条件下以恒温灌流泵先后灌注冲洗液和0.05%Ι型胶原酶溶液各10 min，分离肝细胞。用含10%小牛血清的MEM稀释细胞，调整细胞浓度至1×108 L-1。取此细胞悬液接种于放有电镜金网的6孔培养板中，置37 ℃培养箱中培养(CO2浓度为5%)，4 h后换液继续培养，15 h后终止培养。
1.5 整装电镜标本制备显示细胞骨架
电镜金网表面复一层0.25%Formvar膜， 自然干燥后在其表面涂以0.1%多聚赖氨酸(Sigma)，紫外线照射灭菌30 min， 置于培养板内，再放入肝细胞悬液进行肝细胞培养。取出贴附肝细胞的金网，用清洗液(含PIPES 0.01 mol/L，Sucrose 0.3 mol/L， MgCl20.003 mol/L，KCl 0.1 mol/L)于4 ℃条件下清洗10～15 min后，入1%Triton X-100高盐抽提液(含250 mmol/L(NH4)2SO4)，4 ℃抽提15～20min，2.5%戊二醛固定30 min，清洗，脱水，自然干燥后在透射电镜100 kV下观察照相。
, 百拇医药
2 结果
对照组肝细胞核区呈电子致密团块，胞质区可见中等电子密度的纤维状骨架成分，丰富、清晰、完整，从核周向外铺展，呈树枝样放射状分布(见图1)，模型组肝细胞胞体骨架稀疏，核周放射状细丝明显减少、变短、变细、排列紊乱，出现较多不定形的小团块(见图2)。治疗组肝细胞丝状结构较模型组明显增多，斑点、团块减少(见图3)。
图1 对照组肝细胞 ×6 000
图2 模型组肝细胞 ×5 000
图3 治疗组肝细胞 ×6 000
, http://www.100md.com
3 讨论
细胞骨架具有维持细胞形态、细胞运动、分裂分化活动和细胞内信息传递等重要功能。肿瘤细胞的许多生物学特性与细胞骨架的改变直接相关[1]。观察细胞在不同生长状态下的细胞骨架改变已成为现代研究细胞生物学特性的一项重要指标。本实验采用含非离子去垢剂Triton X-100的高盐溶液处理原代培养肝细胞，电镜下显示的丝状结构为中等纤维。中等纤维外接质膜和胞外基质，内连核膜表面和核基质，中间又与微管、微丝及其他细胞器联系，因而它在细胞内形成了一个完整的网架系统，起着广泛的骨架功能；同时中等纤维蛋白本身就是一种信息分子，直接参与跨膜信号的传递[2]。实验结果显示模型组肝细胞中等纤维断裂、变细 、数量减少，看不到明显的丝状结构而呈弥散的斑块状，与文献报道其他转化细胞的骨架变化一致[3、4]。
近年有研究报道，几种癌基因的作用位点就是连接FN与细胞骨架的跨膜蛋白，认为细胞骨架是癌基因作用的靶点。有许多证据都表明癌基因表达产物与细胞骨架相互作用能引起细胞骨架系统的结构改变，从而彻底破坏了细胞骨架与细胞膜和细胞外基质蛋白间的相互作用或影响，使得一些信息不能在细胞与环境间进行正常传递，造成细胞信息传递中断或错误传递，从而影响到细胞正常生长。因此我们推测，细胞骨架系统的改变可能是造成细胞恶性变的原因之一。实验还观察到，细胞骨架的改变程度与转化细胞的其他表型特征具有明显相关性[5]，表明细胞骨架结构与细胞的代谢和功能之间有密切关系。
, http://www.100md.com
中药青椒碱是从芸香科花椒属植物中提取的中性成分，具有抗肿瘤作用[6]。现已证明其对实验性肝癌有较好的抑制作用[7]。本实验经青椒碱治疗后的诱癌大鼠肝细胞表现出解聚的中等纤维重新聚合成丝状结构，提示青椒碱对细胞骨架具有较强的恢复和保护作用。还观察到青椒碱可明显抑制癌变细胞的DNA合成，阻止细胞分裂[8]，因此中药青椒碱可能是通过影响基因表达—细胞骨架—细胞代谢功能的途径而抑制细胞增殖、促进癌细胞逆转，从而对实验性肝癌起到治疗作用。
国家自然科学基金资助课题(No.39370843)
白锦雯,女,36岁,医学硕士,讲师.
参 考 文 献
1，Ben_Ze'ev A. The cytoskeleton in cancer cells. Biochim Biophys Acta, 1985,780:197
, 百拇医药
2，汪仁.细胞生物学.北京：北京师范大学出版社，1990.255～257
3，林彭年，杨 力，何 申.NIH3T3细胞转化前后细胞骨架及细胞表面纤维粘连蛋白的免疫荧光观察.解剖学报，1990，21(3)：275～278
4，Decloitre F, Martin M. Modification of the cellular cytoskeleton and hepatic tumor promotion. Bull_Cancer_Paris, 1990, 77(5):479～483
5，白锦雯，张 颖，赵丽云，等.青椒碱对DEN诱发大鼠肝癌治疗作用的研究——原代培养肝细胞组化定量观察.北京中医药大学学报，1996，19(增刊)：29～31
6，刘锁兰，魏路雪.青椒碱化学成分的研究.药学学报，1991，26(1)：836
7，叶百宽，张 颖，何基渊，等.青椒碱对大鼠肝癌细胞逆转影响的实验研究.北京中医药大学学报，1996，19(增刊)：32～35
8，白锦雯，张 颖，吴 菁.青椒碱对DEN诱发大鼠肝癌抑制作用的流式细胞光度术分析.北京中医药大学学报，1999，22(6)：34～35
(收稿日期：2000-03-27), 百拇医药
单位：北京中医药大学组织胚胎学教研室 北京100029
关键词：细胞骨架；电镜技术；肝癌；细胞培养；青椒碱
北京中医药大学学报000412
摘要： 用二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌动物模型，以青椒碱治疗，分离肝细胞原代培养，应用整装细胞电镜技术结合选择性抽提观察细胞骨架。结果显示DEN诱发大鼠肝癌细胞的骨架丝状结构遭到破坏、断裂并聚集成团块，治疗组细胞骨架有明显的恢复。提示青椒碱可通过影响细胞骨架对大鼠实验性肝癌细胞起到治疗作用。
中图分类号：R285.5
Effects of Schinifoline on Cytoskeleton of Experimental Hepatoma in Rats
, http://www.100md.com
Observed by Whole Mount Cell Transmission Electron Microscopy
Bai Jinwen Zhang Ying Yang Meijuan et al.
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
ABSTRACT：Whole mount cell transmission electron microscopy combined with selective extraction method was adopted to study the effect of schinifoline on hepatocellular cytoskeleton of experimental hepatoma. It was shown that the filaments of the cytoskeletons of the transformed cells induced by DEN were obviously damaged, depolymerized and aggregated. After the treatment with schinifoline, the cytoskeletal system of the transformed cells recovered apparently. So schinifoline can be used to treat on the experimental liver cancer cells in rat by influencing cytoskeleton.
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KEY WORDS: Cytoskeleton; Electron microscopy; Hepotoma; Cell culture; Schinifoline
细胞骨架系统是一类复杂的蛋白质纤维结构，这些结构与细胞的病理过程密切相关，有助于我们揭示肿瘤的秘密。大量的实验证明癌变细胞的骨架结构发生明显改变，但对诱癌后原代培养的肝细胞骨架研究尚未见报道。本实验采用大鼠原代培养肝细胞，应用整装细胞电镜技术，结合选择性抽提方法，观察二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌及青椒碱治疗后的肝细胞内中等纤维的变化，为进一步探讨青椒碱对肿瘤细胞的作用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物
Wistar大鼠36只，雌雄兼用，体重150～180 g，购于中国中医研究院实验动物中心。
, http://www.100md.com
1.2 药物
青椒碱，由北京中医药大学中药学院中药化学教研室提供。用1%羧甲基纤维素(CMC)配成2%混悬液。
1.3 实验分组与肝癌动物模型的复制
将大鼠随机分为对照、诱癌和治疗3个组。对照组不做任何处理。诱癌组与治疗组分别于实验第1天经腹腔1次性注射致癌启动剂DEN(Sigma公司制品)，200 mg/kg体重(配制成1%DEN生理盐水溶液)，10 d后第1次口服促癌剂50%CCL4、橄榄油溶液，2 mL/kg体重，隔3 d第2次口服CCL4。于实验第4周起自由饮服0.05%苯巴比妥水溶液30 d，治疗组同时每日灌服青椒碱200 mg/kg体重，共20 d。实验第16周进行肝细胞的分离和培养。
1.4 肝细胞的分离与培养
, http://www.100md.com
大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，暴露肝脏，门静脉插管，在无菌条件下以恒温灌流泵先后灌注冲洗液和0.05%Ι型胶原酶溶液各10 min，分离肝细胞。用含10%小牛血清的MEM稀释细胞，调整细胞浓度至1×108 L-1。取此细胞悬液接种于放有电镜金网的6孔培养板中，置37 ℃培养箱中培养(CO2浓度为5%)，4 h后换液继续培养，15 h后终止培养。
1.5 整装电镜标本制备显示细胞骨架
电镜金网表面复一层0.25%Formvar膜， 自然干燥后在其表面涂以0.1%多聚赖氨酸(Sigma)，紫外线照射灭菌30 min， 置于培养板内，再放入肝细胞悬液进行肝细胞培养。取出贴附肝细胞的金网，用清洗液(含PIPES 0.01 mol/L，Sucrose 0.3 mol/L， MgCl20.003 mol/L，KCl 0.1 mol/L)于4 ℃条件下清洗10～15 min后，入1%Triton X-100高盐抽提液(含250 mmol/L(NH4)2SO4)，4 ℃抽提15～20min，2.5%戊二醛固定30 min，清洗，脱水，自然干燥后在透射电镜100 kV下观察照相。
, 百拇医药
2 结果
对照组肝细胞核区呈电子致密团块，胞质区可见中等电子密度的纤维状骨架成分，丰富、清晰、完整，从核周向外铺展，呈树枝样放射状分布(见图1)，模型组肝细胞胞体骨架稀疏，核周放射状细丝明显减少、变短、变细、排列紊乱，出现较多不定形的小团块(见图2)。治疗组肝细胞丝状结构较模型组明显增多，斑点、团块减少(见图3)。
图1 对照组肝细胞 ×6 000
图2 模型组肝细胞 ×5 000
图3 治疗组肝细胞 ×6 000
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3 讨论
细胞骨架具有维持细胞形态、细胞运动、分裂分化活动和细胞内信息传递等重要功能。肿瘤细胞的许多生物学特性与细胞骨架的改变直接相关[1]。观察细胞在不同生长状态下的细胞骨架改变已成为现代研究细胞生物学特性的一项重要指标。本实验采用含非离子去垢剂Triton X-100的高盐溶液处理原代培养肝细胞，电镜下显示的丝状结构为中等纤维。中等纤维外接质膜和胞外基质，内连核膜表面和核基质，中间又与微管、微丝及其他细胞器联系，因而它在细胞内形成了一个完整的网架系统，起着广泛的骨架功能；同时中等纤维蛋白本身就是一种信息分子，直接参与跨膜信号的传递[2]。实验结果显示模型组肝细胞中等纤维断裂、变细 、数量减少，看不到明显的丝状结构而呈弥散的斑块状，与文献报道其他转化细胞的骨架变化一致[3、4]。
近年有研究报道，几种癌基因的作用位点就是连接FN与细胞骨架的跨膜蛋白，认为细胞骨架是癌基因作用的靶点。有许多证据都表明癌基因表达产物与细胞骨架相互作用能引起细胞骨架系统的结构改变，从而彻底破坏了细胞骨架与细胞膜和细胞外基质蛋白间的相互作用或影响，使得一些信息不能在细胞与环境间进行正常传递，造成细胞信息传递中断或错误传递，从而影响到细胞正常生长。因此我们推测，细胞骨架系统的改变可能是造成细胞恶性变的原因之一。实验还观察到，细胞骨架的改变程度与转化细胞的其他表型特征具有明显相关性[5]，表明细胞骨架结构与细胞的代谢和功能之间有密切关系。
, http://www.100md.com
中药青椒碱是从芸香科花椒属植物中提取的中性成分，具有抗肿瘤作用[6]。现已证明其对实验性肝癌有较好的抑制作用[7]。本实验经青椒碱治疗后的诱癌大鼠肝细胞表现出解聚的中等纤维重新聚合成丝状结构，提示青椒碱对细胞骨架具有较强的恢复和保护作用。还观察到青椒碱可明显抑制癌变细胞的DNA合成，阻止细胞分裂[8]，因此中药青椒碱可能是通过影响基因表达—细胞骨架—细胞代谢功能的途径而抑制细胞增殖、促进癌细胞逆转，从而对实验性肝癌起到治疗作用。
国家自然科学基金资助课题(No.39370843)
白锦雯,女,36岁,医学硕士,讲师.
参 考 文 献
1，Ben_Ze'ev A. The cytoskeleton in cancer cells. Biochim Biophys Acta, 1985,780:197
, 百拇医药
2，汪仁.细胞生物学.北京：北京师范大学出版社，1990.255～257
3，林彭年，杨 力，何 申.NIH3T3细胞转化前后细胞骨架及细胞表面纤维粘连蛋白的免疫荧光观察.解剖学报，1990，21(3)：275～278
4，Decloitre F, Martin M. Modification of the cellular cytoskeleton and hepatic tumor promotion. Bull_Cancer_Paris, 1990, 77(5):479～483
5，白锦雯，张 颖，赵丽云，等.青椒碱对DEN诱发大鼠肝癌治疗作用的研究——原代培养肝细胞组化定量观察.北京中医药大学学报，1996，19(增刊)：29～31
6，刘锁兰，魏路雪.青椒碱化学成分的研究.药学学报，1991，26(1)：836
7，叶百宽，张 颖，何基渊，等.青椒碱对大鼠肝癌细胞逆转影响的实验研究.北京中医药大学学报，1996，19(增刊)：32～35
8，白锦雯，张 颖，吴 菁.青椒碱对DEN诱发大鼠肝癌抑制作用的流式细胞光度术分析.北京中医药大学学报，1999，22(6)：34～35
(收稿日期：2000-03-27), 百拇医药