大鼠脑缺血再灌流后HSP70的表达和bFGF对其影响
作者：方瑗 童萼塘 孙圣刚 王玉 王耀明
单位：430022同济医科大学附属协和医院神经科
关键词：热性休克蛋白70；碱性成纤维细胞生长因子；脑缺血再灌流
临床神经病学杂志000402 【摘要】 目的 研究脑缺血再灌流后热休克蛋白70(HSP70)表达的意义及外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对其影响。方法 应用免疫组化的方法观察大鼠局灶性脑缺血再灌流后脑组织HSP70的表达以及在侧脑室注射外源性bFGF对其影响。结果 缺血2小时再灌流0小时即可见HSP70表达，至24小时达高峰。bFGF组与生理盐水组相比于6～48小时各组可见HSP70表达增高(P<0.05)。结论 脑缺血诱导HSP70的表达，外源性bFGF能增加HSP70的表达。
The expression of HSP70 and the effect of bFGF on it
, 百拇医药
in rats following cerebral ische-mia-reperfusion
Fang Yuan，Tong Etang，Sun Shenggang
(Department of Neurology,Xie He Affiliated Hospital of Tongji Medecal University,Wuhan 430022)
【Abstract】 Objective To study the significance of HSP70 expression and its effect of exogenous bFGF on HSP70 expression in rats after cerebral ischemia-reperfusion.Methods Using immunohistochemistry mothod.We observed brain HSP70 expression and the effect of exogenous bFGF injected in lateral ventricle on it after focal cerebral ischemia-reperfusion in rats.Results HSP70 expression could be observed at 0h reperfusion after 2h ischemia,and it reached peak at 24h. And the expression of HSP70 was elevated at 6～48h reperfusion in bFGF group as compared with physiological saline group(P<0.05).Conclusion Cerebral ischemia could induce HSP70 expression. Exogenous bFGF could enhance the expression of HSP70.
, 百拇医药
【Key words】 HSP70 bFGF Cerebral ischemia-reperfusion
热性休克蛋白70(HSP70)是缺血损伤时敏感而可靠的标志,缺血、缺氧及癫痫均可诱导HSP70表达，HSP70表达增强对神经元有保护作用。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种具有多种生物学活性的多肽生长因子,其神经活性广泛,能保护神经元,促进神经生长。实验表明，bFGF在抗缺血性脑损伤中也发挥着重要作用，被认为将是最具有临床应用价值的一种神经营养因子。本研究通过观察脑缺血再灌流后HSP70的表达和bFGF对其影响，探讨脑缺血后HSP70表达的意义和bFGF是否通过诱导HSP70的表达而发挥神经保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠，体重250～300 g，由同济医科大学实验动物中心提供。动物分组：随机分为正常组，假手术组，缺血再灌流组。缺血再灌流组又分为bFGF和生理盐水组，并根据不同时间点分为缺血2小时再灌流0、1、6、12、24、48、72小时组,每组各6只大鼠。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 模型制作 10%水合氯醛麻醉，颈正中切口分离结扎左侧颈总动脉、颈外动脉及其分支，分离颈内动脉，将涂有硅酮直径0.2 mm尼龙线从颈总动脉分叉处插入颈内动脉约18±1.0 mm。再灌流时将栓线抽出约10 mm。
1.2.2 实验方法 bFGF组在缺血后30分钟，从右侧侧脑室注射含bFGF(Sigma公司)1.2 μg[1]生理盐水10 μl。生理盐水组则仅给予10 μl生理盐水。侧脑室注射方法：脑立体定向仪下取前囟后0.8 mm，中线旁1.8 mm，硬膜下3.7 mm为注射点[2]，10 μl微量注射器垂直注射。
1.2.3 HSP70免疫组化染色 缺血再灌流组于不同时间点，假手术组于术后24小时及正常组用10%水合氯醛麻醉后仰卧固定，快速开胸暴露心脏，经升主动脉插管，先用37℃生理盐水150 ml快速洗注，再灌注4℃ 4%多聚甲醛(Sigma公司)0.1 mol/L磷酸缓冲液500 ml,灌注时间为1小时，取脑修块后置上述灌注液及20%蔗糖各24小时。将组织块在冰冻切片机上行30 μm厚的连续冠状切片，0.2%Triton X-100、0.03%H2O2甲醇处理30分钟，1∶50牛血清白蛋白37℃1小时。鼠抗HSP70单克隆抗体(1∶200 Sant Crus 公司)4℃孵育72小时,兔抗鼠IgG 1∶50、兔抗ABC复合物1∶50(武汉博士德生物工程公司)37℃各1小时,以上每步均经PBS充分洗涤。DAB 呈色、酒精梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
, 百拇医药
1.2.4 统计方法 采用MPIAS-500真彩色细胞图像分析系统，对切片进行图像分析。同一组内不同时间的比较采用方差分析，两组之间同一时间点的比较采用t检验。
2 结 果
正常及假手术组未见HSP70表达。生理盐水组，缺血再灌流0～6小时组仅见轻度HSP70表达，主要在梗死灶周围，阳性反应细胞呈棕黄色，再灌流12小时表达明显增加，24小时达高峰(P<0.01)。bFGF组与生理盐水组比较，再灌流6小时，HSP70表达增强，12小时达高峰(P<0.01)，并持续到24小时，见表1。
表1 缺血再灌流各组大鼠脑缺血侧皮质
HSP70阳性细胞数(
±s) 分组
, http://www.100md.com 生理盐水组
bFGF组
R0 h
70.3±27.94
81.3±31.36
R1 h
81.2±35.26
87.6±33.25
R6 h
90.5±61.32
181.9±54.62**
R12 h
, 百拇医药
185.6±67.52**
387.3±80.12**☆ ☆
R24 h
338.1±74.61**
352.4±72.26
R48 h
212.5±56.37*
275.7±25.46*☆
R72 h
94.2±45.21**
, 百拇医药
113.1±39.92**
组内全部时间点之间的比较均P<0.01；组内各个时间点与前一时间点比较*P<0.05，**P<0.01，与生理盐水组比较☆P<0.05，☆☆P<0.01
3 讨 论
在正常情况下HSP70 mRNA在细胞中水平较低，HSP70的合成也很少。本实验中正常组及假手术组未见HSP70表达，而在缺血再灌流各组中均可见HSP70表达，提示脑缺血可诱导神经细胞HSP70表达。在生理盐水组，缺血再灌注早期仅见HSP70轻度增高，24小时达高峰后开始下降，与刘军等[3]的报道一致。Takemoto等[4]的研究则发现缺血5分钟再灌流24小时未见明显HSP70表达，在缺血15分钟再灌流至96小时才见HSP70表达达高峰。由此可见，HSP70的表达可能与缺血的严重程度及对缺血性损伤的耐受性有关。
, 百拇医药
本实验显示HSP70表达主要在梗死灶周围神经元，即缺血半暗带区，梗死灶中央未见明显HSP70表达。Kinouchi等[5]的研究表明HSP70 mRNA主要在缺血灶周围神经元产生，梗死灶中心的HSP70 mRNA的表达量则很少，推测HSP70可能与半影区神经元损伤的可逆性有关。严重缺血时，梗死灶中央区则有大量的HSP70 mRNA表达，没有HSP70蛋白的合成，被认为是神经元产生严重缺血的标志并与细胞损伤有关。有人曾用HSP70单克隆抗体定位来确定缺血后HSP70表达的作用，发现在短暂缺血后死亡的海马CA1区锥体细胞中HSP70蓄积甚少，存活的齿状回颗粒细胞中有明显的HSP70积累[6]，表明HSP70的蓄积具有神经保护作用，证明缺血后HSP70表达对神经元有保护作用，是细胞存活的原因之一。近年的研究发现凋亡细胞的HSP70表达水平较非凋亡细胞水平低，从而推测HSP70可能抑制细胞凋亡,对缺血神经细胞产生保护作用[7]。
本实验bFGF组与生理盐水组比可见HSP70的表达高峰时间前移且持续时间延长，提示缺血后外源性bFGF能诱导HSP70表达。有研究表明短暂缺血2分钟内可使缺血以后再缺血时HSP70 mRNA表达高峰时间前移，HSP70 mRNA及其蛋白细胞数增多，神经元未受损，推测HSP70合成增多，对缺血神经元有保护作用[8]。bFGF是一种具有多种生物学活性的神经营养因子，在离体实验中已证实外源性bFGF能增加神经元的存活，在体实验也证实外源性bFGF具有保护脑免受损伤并能阻止缺血后神经元死亡、减小梗死体积的作用[3]。细胞内钙离子超载是缺血性脑损伤的关键因素，bFGF则能通过影响钙离子结合蛋白而阻止细胞内钙离子超载，维持细胞内钙离子环境稳定而发挥抗缺血性损伤的作用[9]。同时bFGF具有抗NMDA、NO及兴奋性氨基酸的神经毒性作用[10]。脑缺血后，HSP70对细胞的保护作用与钙离子、自由基及兴奋性氨基酸有关。实验发现热休克反应能阻止钙离子内流，保护细胞免受钙离子依赖的兴奋性毒性作用，而热休克反应能诱导HSP70表达[11]。我们推测bFGF可能通过抑制钙离子内流，诱导HSP70的表达，也提示缺血后bFGF 一方面发挥自身的神经保护作用，另一方面也可能通过诱导HSP70的合成而发挥作用，但bFGF是否有直接促HSP70表达的作用还待进一步研究。相信通过进一步的实验研究, 将为临床应用bFGF治疗急性卒中提供新的方法。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Naodi K,David J,Michael A,et al.Pretremeat with intraventricular basic fibroblast growth factor decreases infarct size following focal cerebral ischemia in rats.Ann Neurol,1994,35:451
2，包新民,舒斯云.大鼠脑立体定位图谱.北京：人民卫生出版社，1991.31
3，刘军,匡培根,张凤英,等.巴曲酶的神经保护作用——缺血再灌注后不同时程热休克蛋白70及病理组织学变化的相关性研究.中风与神经疾病杂志,1996,13:137
4，Takemoto O, Tomimoto H, Yanagihara T.Induction of C-fos and C-jun gene products and heat shock protein after brief and prolonged cerebral ischemia in gerbils. Stroke,1995,26:1639
, 百拇医药
5，Kinouchi H, Sharp FR, Koistinaho J, et al. Induction of heat shock HSP70 mRNA and HSP70 KDa protein in neurons in the penumbra following focal cerebral ischemia in the rat. Brain Res,1993,619:334
6，Vass K, Welch NJ, Nowak TS Jr,et al. Localization of HSP 70-KDa stress protein induction in gerbil brain after ischemia. Acta Neuropathol Berl,1998,77:128
7，He L, Fox MH.Variation of heat shock protein 70 through the cell cycle in HL-60 cells and its relationship to apoptosis. Exp Cell Res,1997,232:64
, 百拇医药
8，Aoki M, Abc K, Kawagoe J,et al. Temporal profile of the induction of heat shock protein 70 and heat shock cognate protein 70 mRNA after transient ischemia in gerbil brain. Brain Res,1993,601:185
9，Mark P, Bincheng. Growth factors protect neurons against exictotoxic/ischemia damage by stabilizing calcium homeostasos,Stabilizirg calcium homeostasis. Stroke,1993,24:138
10，姜树军,匡培根.成纤维细胞生长因子与脑缺血.国外医学脑血管疾病分册，1996,4:203
11，肖献忠,杨寅柯,罗正曜.热处理对大鼠心脏缺血再灌流损伤和保护作用及其机制研究(Ⅱ).湖南医科大学学报，1993,18:119
(收稿1999-10-20 修回2000-03-06), 百拇医药
单位：430022同济医科大学附属协和医院神经科
关键词：热性休克蛋白70；碱性成纤维细胞生长因子；脑缺血再灌流
临床神经病学杂志000402 【摘要】 目的 研究脑缺血再灌流后热休克蛋白70(HSP70)表达的意义及外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对其影响。方法 应用免疫组化的方法观察大鼠局灶性脑缺血再灌流后脑组织HSP70的表达以及在侧脑室注射外源性bFGF对其影响。结果 缺血2小时再灌流0小时即可见HSP70表达，至24小时达高峰。bFGF组与生理盐水组相比于6～48小时各组可见HSP70表达增高(P<0.05)。结论 脑缺血诱导HSP70的表达，外源性bFGF能增加HSP70的表达。
The expression of HSP70 and the effect of bFGF on it
, 百拇医药
in rats following cerebral ische-mia-reperfusion
Fang Yuan，Tong Etang，Sun Shenggang
(Department of Neurology,Xie He Affiliated Hospital of Tongji Medecal University,Wuhan 430022)
【Abstract】 Objective To study the significance of HSP70 expression and its effect of exogenous bFGF on HSP70 expression in rats after cerebral ischemia-reperfusion.Methods Using immunohistochemistry mothod.We observed brain HSP70 expression and the effect of exogenous bFGF injected in lateral ventricle on it after focal cerebral ischemia-reperfusion in rats.Results HSP70 expression could be observed at 0h reperfusion after 2h ischemia,and it reached peak at 24h. And the expression of HSP70 was elevated at 6～48h reperfusion in bFGF group as compared with physiological saline group(P<0.05).Conclusion Cerebral ischemia could induce HSP70 expression. Exogenous bFGF could enhance the expression of HSP70.
, 百拇医药
【Key words】 HSP70 bFGF Cerebral ischemia-reperfusion
热性休克蛋白70(HSP70)是缺血损伤时敏感而可靠的标志,缺血、缺氧及癫痫均可诱导HSP70表达，HSP70表达增强对神经元有保护作用。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种具有多种生物学活性的多肽生长因子,其神经活性广泛,能保护神经元,促进神经生长。实验表明，bFGF在抗缺血性脑损伤中也发挥着重要作用，被认为将是最具有临床应用价值的一种神经营养因子。本研究通过观察脑缺血再灌流后HSP70的表达和bFGF对其影响，探讨脑缺血后HSP70表达的意义和bFGF是否通过诱导HSP70的表达而发挥神经保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠，体重250～300 g，由同济医科大学实验动物中心提供。动物分组：随机分为正常组，假手术组，缺血再灌流组。缺血再灌流组又分为bFGF和生理盐水组，并根据不同时间点分为缺血2小时再灌流0、1、6、12、24、48、72小时组,每组各6只大鼠。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 模型制作 10%水合氯醛麻醉，颈正中切口分离结扎左侧颈总动脉、颈外动脉及其分支，分离颈内动脉，将涂有硅酮直径0.2 mm尼龙线从颈总动脉分叉处插入颈内动脉约18±1.0 mm。再灌流时将栓线抽出约10 mm。
1.2.2 实验方法 bFGF组在缺血后30分钟，从右侧侧脑室注射含bFGF(Sigma公司)1.2 μg[1]生理盐水10 μl。生理盐水组则仅给予10 μl生理盐水。侧脑室注射方法：脑立体定向仪下取前囟后0.8 mm，中线旁1.8 mm，硬膜下3.7 mm为注射点[2]，10 μl微量注射器垂直注射。
1.2.3 HSP70免疫组化染色 缺血再灌流组于不同时间点，假手术组于术后24小时及正常组用10%水合氯醛麻醉后仰卧固定，快速开胸暴露心脏，经升主动脉插管，先用37℃生理盐水150 ml快速洗注，再灌注4℃ 4%多聚甲醛(Sigma公司)0.1 mol/L磷酸缓冲液500 ml,灌注时间为1小时，取脑修块后置上述灌注液及20%蔗糖各24小时。将组织块在冰冻切片机上行30 μm厚的连续冠状切片，0.2%Triton X-100、0.03%H2O2甲醇处理30分钟，1∶50牛血清白蛋白37℃1小时。鼠抗HSP70单克隆抗体(1∶200 Sant Crus 公司)4℃孵育72小时,兔抗鼠IgG 1∶50、兔抗ABC复合物1∶50(武汉博士德生物工程公司)37℃各1小时,以上每步均经PBS充分洗涤。DAB 呈色、酒精梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
, 百拇医药
1.2.4 统计方法 采用MPIAS-500真彩色细胞图像分析系统，对切片进行图像分析。同一组内不同时间的比较采用方差分析，两组之间同一时间点的比较采用t检验。
2 结 果
正常及假手术组未见HSP70表达。生理盐水组，缺血再灌流0～6小时组仅见轻度HSP70表达，主要在梗死灶周围，阳性反应细胞呈棕黄色，再灌流12小时表达明显增加，24小时达高峰(P<0.01)。bFGF组与生理盐水组比较，再灌流6小时，HSP70表达增强，12小时达高峰(P<0.01)，并持续到24小时，见表1。
表1 缺血再灌流各组大鼠脑缺血侧皮质
HSP70阳性细胞数(
±s) 分组, http://www.100md.com 生理盐水组
bFGF组
R0 h
70.3±27.94
81.3±31.36
R1 h
81.2±35.26
87.6±33.25
R6 h
90.5±61.32
181.9±54.62**
R12 h
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185.6±67.52**
387.3±80.12**☆ ☆
R24 h
338.1±74.61**
352.4±72.26
R48 h
212.5±56.37*
275.7±25.46*☆
R72 h
94.2±45.21**
, 百拇医药
113.1±39.92**
组内全部时间点之间的比较均P<0.01；组内各个时间点与前一时间点比较*P<0.05，**P<0.01，与生理盐水组比较☆P<0.05，☆☆P<0.01
3 讨 论
在正常情况下HSP70 mRNA在细胞中水平较低，HSP70的合成也很少。本实验中正常组及假手术组未见HSP70表达，而在缺血再灌流各组中均可见HSP70表达，提示脑缺血可诱导神经细胞HSP70表达。在生理盐水组，缺血再灌注早期仅见HSP70轻度增高，24小时达高峰后开始下降，与刘军等[3]的报道一致。Takemoto等[4]的研究则发现缺血5分钟再灌流24小时未见明显HSP70表达，在缺血15分钟再灌流至96小时才见HSP70表达达高峰。由此可见，HSP70的表达可能与缺血的严重程度及对缺血性损伤的耐受性有关。
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本实验显示HSP70表达主要在梗死灶周围神经元，即缺血半暗带区，梗死灶中央未见明显HSP70表达。Kinouchi等[5]的研究表明HSP70 mRNA主要在缺血灶周围神经元产生，梗死灶中心的HSP70 mRNA的表达量则很少，推测HSP70可能与半影区神经元损伤的可逆性有关。严重缺血时，梗死灶中央区则有大量的HSP70 mRNA表达，没有HSP70蛋白的合成，被认为是神经元产生严重缺血的标志并与细胞损伤有关。有人曾用HSP70单克隆抗体定位来确定缺血后HSP70表达的作用，发现在短暂缺血后死亡的海马CA1区锥体细胞中HSP70蓄积甚少，存活的齿状回颗粒细胞中有明显的HSP70积累[6]，表明HSP70的蓄积具有神经保护作用，证明缺血后HSP70表达对神经元有保护作用，是细胞存活的原因之一。近年的研究发现凋亡细胞的HSP70表达水平较非凋亡细胞水平低，从而推测HSP70可能抑制细胞凋亡,对缺血神经细胞产生保护作用[7]。
本实验bFGF组与生理盐水组比可见HSP70的表达高峰时间前移且持续时间延长，提示缺血后外源性bFGF能诱导HSP70表达。有研究表明短暂缺血2分钟内可使缺血以后再缺血时HSP70 mRNA表达高峰时间前移，HSP70 mRNA及其蛋白细胞数增多，神经元未受损，推测HSP70合成增多，对缺血神经元有保护作用[8]。bFGF是一种具有多种生物学活性的神经营养因子，在离体实验中已证实外源性bFGF能增加神经元的存活，在体实验也证实外源性bFGF具有保护脑免受损伤并能阻止缺血后神经元死亡、减小梗死体积的作用[3]。细胞内钙离子超载是缺血性脑损伤的关键因素，bFGF则能通过影响钙离子结合蛋白而阻止细胞内钙离子超载，维持细胞内钙离子环境稳定而发挥抗缺血性损伤的作用[9]。同时bFGF具有抗NMDA、NO及兴奋性氨基酸的神经毒性作用[10]。脑缺血后，HSP70对细胞的保护作用与钙离子、自由基及兴奋性氨基酸有关。实验发现热休克反应能阻止钙离子内流，保护细胞免受钙离子依赖的兴奋性毒性作用，而热休克反应能诱导HSP70表达[11]。我们推测bFGF可能通过抑制钙离子内流，诱导HSP70的表达，也提示缺血后bFGF 一方面发挥自身的神经保护作用，另一方面也可能通过诱导HSP70的合成而发挥作用，但bFGF是否有直接促HSP70表达的作用还待进一步研究。相信通过进一步的实验研究, 将为临床应用bFGF治疗急性卒中提供新的方法。
, http://www.100md.com
参考文献
1，Naodi K,David J,Michael A,et al.Pretremeat with intraventricular basic fibroblast growth factor decreases infarct size following focal cerebral ischemia in rats.Ann Neurol,1994,35:451
2，包新民,舒斯云.大鼠脑立体定位图谱.北京：人民卫生出版社，1991.31
3，刘军,匡培根,张凤英,等.巴曲酶的神经保护作用——缺血再灌注后不同时程热休克蛋白70及病理组织学变化的相关性研究.中风与神经疾病杂志,1996,13:137
4，Takemoto O, Tomimoto H, Yanagihara T.Induction of C-fos and C-jun gene products and heat shock protein after brief and prolonged cerebral ischemia in gerbils. Stroke,1995,26:1639
, 百拇医药
5，Kinouchi H, Sharp FR, Koistinaho J, et al. Induction of heat shock HSP70 mRNA and HSP70 KDa protein in neurons in the penumbra following focal cerebral ischemia in the rat. Brain Res,1993,619:334
6，Vass K, Welch NJ, Nowak TS Jr,et al. Localization of HSP 70-KDa stress protein induction in gerbil brain after ischemia. Acta Neuropathol Berl,1998,77:128
7，He L, Fox MH.Variation of heat shock protein 70 through the cell cycle in HL-60 cells and its relationship to apoptosis. Exp Cell Res,1997,232:64
, 百拇医药
8，Aoki M, Abc K, Kawagoe J,et al. Temporal profile of the induction of heat shock protein 70 and heat shock cognate protein 70 mRNA after transient ischemia in gerbil brain. Brain Res,1993,601:185
9，Mark P, Bincheng. Growth factors protect neurons against exictotoxic/ischemia damage by stabilizing calcium homeostasos,Stabilizirg calcium homeostasis. Stroke,1993,24:138
10，姜树军,匡培根.成纤维细胞生长因子与脑缺血.国外医学脑血管疾病分册，1996,4:203
11，肖献忠,杨寅柯,罗正曜.热处理对大鼠心脏缺血再灌流损伤和保护作用及其机制研究(Ⅱ).湖南医科大学学报，1993,18:119
(收稿1999-10-20 修回2000-03-06), 百拇医药