兴奋性氨基酸在缺氧耐受形成中的变化
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作者：刘宏雁 吴迪 吕国蔚 王维忠
单位：刘宏雁 吴迪 王维忠(白求恩医科大学第三临床学院中心研究室，长春 130031)；吕国蔚(首都医科大学神经生物学研究室，北京 100054)
关键词：
中国应用生理学杂志000430
在缺血缺氧性脑损伤中，兴奋性氨基酸(EAA)起重要作用。但EAA在缺氧耐受形成中的作用尚 未见报道。本实验通过观察EAA的NMDA(N-甲基-D-天门冬氨酸)受体激动剂L-GLU(L-谷 氨酸)、受体拮抗剂氯氨酮对缺氧耐受的影响及在缺氧耐受中EAA和抑制性氨基酸的变化，旨 在初步探讨缺氧耐受的机制。
1 材料与方法
(1)试剂 L-GLU(上海伯奥生物科技公司)；氯氨酮(美国Sigma公司)；AQC(6-氨基喹啉 -N-羟基-琥珀酰亚胺基甲酸酯)及18种氨基酸标准品(美国Waters公司)；D-正亮氨酸(中 国科学院生物技术厂产品)。
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(2)方法 ①缺氧耐受模型 按急性重复缺氧方法，将小鼠置于含有新鲜空气，经过标定 的150 ml广口瓶内。以橡皮塞密闭，记时，一旦出现喘呼吸，立即取出，并随即转移到另一 相似体积，含有新鲜空气的广口瓶内，密闭，记时。依此类推至四次，实验室温度(20±2) ℃。各次倒瓶中，从密闭开始到喘呼吸出现时间为“原始耐受时间”，再依下式算出相当于 100 ml有效空气量下的“标准耐受时间”。②L-谷氨酸、氯胺酮对缺氧耐受的影响 选体 重为18～22 g昆明小鼠，雌雄不限，随机分为谷氨酸、氯胺酮、生理盐水对照组，每组15只 小鼠。每组分别腹腔注射L-谷氨酸(60 mg/kg)、氯胺酮(100 mg/kg)、生理盐水，30 min后 进行急性重复缺氧实验，并计算标准耐受时间。③L-ASP(L-天门冬氨酸)、L-GLU、GLY( 甘氨酸)、γ-GABA(γ-氨基丁酸)测定 选体重为18～22 g昆明小鼠，雌雄不限。随机分 为：正常对照组、一次缺氧组、二次缺氧组、三次缺氧组、四次缺氧组，每组10只。脑组织 由液氮取出，称重后加0.1 mol/L HCL 2 ml(含内标浓度为250 pmol/μl)，在冰浴下超声 粉碎(10 s)，10%三氯醋酸，离心反复三次去蛋白，正已烷去脂。采用高压液相AccQ*Tag柱 前衍生法测定。以D-正亮氨酸为内标物。色谱条件：色谱柱：C18柱；柱温：37℃; 流动相A：140 mmol/L醋酸钠溶液(含17 mmol/L三乙胺，用50%磷酸调pH至4.95)；流动相B ：乙睛一水(3∶2)；洗脱梯度：见表1；流速1.0 ml/min；检测波长：Σx:250 nm Σm:395 nm。
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(3)统计学处理 实验数据用SPSS统计软件包处理，数据以均数±标准差(± s)表示，组间比较采用单因数方差分析检验。
T:Standard tolerance time;
to:Time of beginning airtight time;
Wa:Mouse weight t1:Time of beginning asthma respiration;
V0:Bottle volume;
2 结果
(1)NMDA受体激动剂L-GLU、受体拮抗剂氯胺酮对缺氧耐受性的影响 对照组小鼠在各次缺 氧 中的行为表现与先前所见相似。GLU组小鼠行为表现与对照组基本相似，轻度兴奋。氯胺酮 组小鼠呼吸较慢，自主运动极少，但未达到睡眠状态。GLU组、氯胺酮组1次缺氧的平均耐受 时间分别为9 min和17 min，分别短于和长于正常对照组小鼠第1次缺氧的平均耐受时间(13 min)；GLU组、氯胺酮组第2、3、4次重复缺氧的耐受时间分别约为其各自第1次缺氧耐受时 间的2.1、2.4、3.0；3.1、4.6、5.4倍，分别低于、高于盐水对照组(盐水对照组第2 、 3、4次缺氧的标准耐受时间为第1次的2.2、3.1、4.3倍)的递增幅度。
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Tab.1 Standard tolerance time of ketamine and L-GLU group(±s,min,n=15) Group
Runs exposed to hypoxia
1
2
3
4
Control
1.40±0.61
29.31±2.82＃
41.54±2.92#
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57.82±3.64##
L-GLU
8.63±0.85*
18.06±2.45*
20.64±3.76*
25.83±4.64*
Ketamine
16.80±0.49*
52.08±3.54*
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77.70±3.14
90.72±5.86*
*P<0.05,vs control;# P<0.05,vs ru n 1 within group
(2)全脑组织 L-ASP、L-GLU、GLY、γ-GABA含量在缺氧预适应中的变化 1次缺氧组与正 常对照组比L-ASP、L-GLU均有明显的升高趋势，但无统计意义。第2、3、4次缺氧组与1次 缺氧组及正常对照组比，L-ASP显著下降；第3、4次缺氧组与1次缺氧组及正常对照组比，L -GLU显著下降，2次缺氧组与1次缺氧组比L-GLU有下降趋势，但无统计意义。1次缺氧组与 正常对照组比，GLY有升高趋势，但统计上无意义。3次缺氧组和1次缺氧组比GLY显著升高。 3、4次缺氧组与正常对照组比L-GLU显著升高，4次缺氧组与3次缺氧组比有回降趋势。正常 对照组、1、2、3、4次缺氧组之间γ-GABA未见差别。
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Tab.2 Contents of amino acid in brain tissue of mice exposed
to hypoxia for run 1 to 4(nmol/g,±s,n=10)
Run
Control
1
2
3
4
L-ASP
2419.362±105.311
2631.165±230.505
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2046.537± 121.356*##
1525.409±101.556**##
1548.189±80.148**##
L-GLU
8084.479±391.748
8678.468±504.395
7781.054±469.474
6083.434±376.812**##
5685.746±387.915**##
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GLY
10751.180±707.919
12582.696±1083.965
11742.826±659.222
16095.671±964.107*##
13919.237±585.303**##
γ-GABA
2768.047±265.831
2956.322±228.842
2885.056±220.838
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2581.018±132.606
2817.040±180.305
* P<0.05,* * P<0.01,vs run 1 i n each group;# P<0.05,# # P<0.01, vs control
3 讨论
大量实验证实脑缺血缺氧损伤时，脑内产生大量的EAA，作用于其受体，导致细胞内钙超载 及一系列的变化，最终使神经细胞代谢衰竭而死亡。本实验中，1次缺氧组与正常对照组比L-ASP、L-GLU均有明显的升高趋势，但无统计意义，可能与动物例数少有关。
脑缺血损害时EAA毒与两个过程肯定有关，首先EAA导致去极化而产生的Na+、Cl-、水细 胞内流，细胞因之肿胀，这个过程是可逆的，兴奋性毒素去除后，即可恢复正常水平，其次 NMDA受体及非NMDA受体的激活，引起Ca2+通道开放，导致Ca2+大量内流，引起 一系列病理过程，造成神经细胞损害。
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目前认为哺乳动物脑内皮层、海马等脑区，广泛存在对士的宁不敏感的而对GLY有亲和力的 结合位点，GLY与其结合可通过变构性作用易化NMDA受体通道对EAA的效应，是NMDA受体通道 的变性调节剂。统计发现，[GLU]×[GLY]/[γ-GABA](兴奋毒指数EI浓度比，能正确 反映脑内不同区域对缺氧伤害的易感性。
L-GLU是脑中的主要EAA，其含量是L-ASP的3～4倍。L-GLU不易透过血脑屏障，但在缺氧 时，可能由于血脑屏障通透性增强，可进入中枢发挥作用。
氯胺酮是非竞争性的NMDA的受体拮抗剂，它有较高的脂溶性易通过血脑屏障。氯胺酮与NMDA 受体-通道复合物的PCP调节位点结合，一方面，通过结构调节，影响受体识别位点的特 性，干扰了L-GLU与NMDA受体的正常结合，从而阻断了NMDA反应：另一方面，阻断受体偶联 的离子通道，影响通道的开启，从而减少NMDA受体介导的Ca2+内流。大量实验证实氯 胺酮有一定的神经保护作用。
本研究结果提示，在重复缺氧过程中，抑制性aa γ-GABA可能与缺氧耐受形成关系较小， 脑组织可能通过某种机制的调节，减少了EAA的生成，促进GLY的回降，从而促进缺氧耐受的 形成。
中国自然科学基金资助项目，No.39670271
收稿日期：1999年9月27日
修回日期：2000-01-03, 百拇医药