受精及胚胎早期卵裂阶段的形态学与染色体之间的关系
作者：徐珉 刘嘉茵
单位：(210029 南京医科大学第一附属医院妇产科 江苏省生殖医学重点实验室)
关键词：
江苏医药000526 自第一例试管婴儿Brown诞生以来，体外受精与胚胎培养技术得到了飞速的发展，现在许多不孕症治疗中心采用序贯培养技术已经能将胚胎培养至囊胚阶段。无论是早期对4～8细胞的胚胎进行胚胎移植(Embryo transfer，ET)，还是最新的囊胚培养和辅助孵出(Assisted hatching，AH)后ET，人们主要是根据每个胚胎的形态学指标来判断其质量的优劣。这些形态学指标大致包括：原核的形成时间及形态、卵裂速度、卵裂球的形态数量、细胞碎片的多少、胞浆的性质及透明带的厚度等等。这种以形态学为标准的选择有很大的主观性，并且人们也无法了解其内部的染色体情况。
卵裂球活检及单细胞PCR、荧光原位杂交(Fluorescence in-situ hybridization，FISH)技术的联合运用，使得人们能够在胚胎种植前了解其内部基因和染色体的情况。单细胞PCR技术主要用于诊断单基因遗传病[1]，FISH主要用于判断是否存在染色体异常[2]。本文主要介绍目前运用FISH技术研究胚胎形态与染色体异常所得的一些认识。
, 百拇医药
一、FISH技术
荧光原位杂交是将荧光物质直接标记到核苷酸探针上，在适当条件下与制备好的靶DNA杂交，杂交后洗脱非特异性杂交探针；由于在探针杂交的位置形成荧光，通过荧光显微镜可以直接观察染色体数量的异常。荧光原位杂交具有敏感、快速的特点，如果用多种颜色标记的不同探针进行杂交，还具有同时显示多条染色体的优点：不仅能显示中期分裂相中染色体，还能显示间期核中染色体的情况。
二、不同发育阶段胚胎与染色体的关系
由于不孕症治疗的首要目的是使得病人怀孕，因此大部分形态学好的胚胎被移植入宫腔，而不能用于FISH的研究。除非有特殊要求、或有遗传病史、或女性年龄大于40岁等情况，其胚胎才进行种植前基因诊断(Preimplantation genetic diagnosis，PGD)，所以目前用于研究的胚胎来源受限。
1.受精与合子阶段
, 百拇医药
对于原核阶段的研究目前数量并不多。1994年，Almeida对体外受精失败的卵细胞研究表明其中47%有染色体异常，但进一步分析提示卵细胞染色体异常与其受精能力之间无明显联系[3]。随后，Almeida在1996年分析了250个原核至8细胞阶段的胚胎，其中46个原核阶段异常的胚胎中染色体异常的发生率是65.2%[4]。1998年，Sadowy等人对X、Y、13、18、21号五条染色体同时杂交证明原核形态不正常与原核形态正常的合子相比，其卵裂过程中嵌合体的发生率明显增高；单精受精合子如果其两原核的直径相差大于4微米与那些直径相差小于4微米的合子相比，卵裂率下降，出现多核卵裂球的比例上升[5]。另外，Pellestor发现三原核的合子中81.9%存在染色体异常[6]。目前对原核形态变异的发生机理仍不清楚，主要认为与卵胞浆不成熟有关。
2.2～8细胞阶段
早在1993年，Munne等人运用FISH技术，对X、Y、18、13、21染色体同时进行多色杂交时就发现，在35个胚胎共157个卵裂球中，单精受精但发育异常的胚胎中有70%存在染色体数量异常，主要有嵌合体、多倍体、单倍体，13/21单体、X单体、13/21三体、18三体等各种形式[7]。1994年Munne报道，用X、Y、18染色体探针对131个胚胎共571个卵裂球杂交表明，在发育停滞或形态异常胚胎中56.5%有染色体数量异常，大部分为多倍体或嵌合体，6.1%为X/Y/18单倍体[8]；同年Munne还报道了在163个发育停滞或形态异常的单精受精胚胎中47%出现嵌合体，明显高于形态正常胚胎嵌合体的出现率20%[9]。在一个嵌和型胚胎中，如果染色体异常的卵裂球在总卵裂球比例中<3/8，这种胚胎中有54%为二倍/四倍嵌和胚胎；如果大部分卵裂球(>3/8)都有染色体异常，44%为杂合性嵌和体(chaotic mosaics)。1995年Munne分析了正常生长、生长延迟、生长停滞三组胚胎中嵌和体的发生率，分别为30%、44%、47%，其中正常发育胚胎中主要是二倍/四倍嵌和体，而生长停滞胚胎中主要表现为杂合或多倍嵌和型(chaotic or polyploid mosaics)。另外，非整倍体胚胎出现比率也随女性年龄的增加明显上升[10，11]。1995年Pellester运用PRINS技术也证明了形态异常的胚胎中染色体异常的发生率明显高于形态正常的胚胎，其比率分别为86.6%和36.6%[6]。1996年Almeicda论证了在原核阶段、2～4细胞阶段、5～8细胞阶段染色体异常的发生率为65.2%、54.6%、27.4%，卵裂阶段形态正常的胚胎与形态异常的胚胎相比，染色体异常率为22.2%、65%[4]。Klignem等人比较有多核卵裂球的胚胎(受精2～3天)和无多核卵裂球的胚胎，发现两者染色体异常率分别为76.6%、50.9%(P<0.001)，如果排除非整倍体因素(由于非整倍体的出现大部分是配子形成过程中染色体分离异常而引起，少数是胚胎卵裂发育时染色体不分离所引起)，两者分别为74.5%和32.3%，差异更加明显[12]。对2～8细胞阶段胚胎的大量试验研究都表明，在形态和发育异常的胚胎中，染色体异常的发生率明显高于正常；因此通过形态学来评估可移植的胚胎是有价值的，Ⅲ、Ⅳ级胚胎不适合种植或冷冻保存。
, http://www.100md.com
在发育停滞或形态异常的胚胎中，多倍体、嵌合体及多核卵裂球是最常见的染色体异常情况。多倍体的产生人们主要认为是由于配子出现二倍体造成；单精受精胚胎的细胞分裂停滞(细胞浆的损伤，尤其是细胞骨架破坏、纺锤体功能障碍所造成)而DNA的合成正常也是引起多倍体的原因之一。Artley等人[13]已经证实卵裂停滞并不能阻止DNA的合成。如果在部分卵裂球中，有丝分裂重新恢复，则易出现多核卵裂球的情况。造成嵌和体胚胎出现的机制比较复杂，推测主要是由于有丝分裂过程中出现错误：如染色体不分离(nondisjunction)、分离后期迟滞(anaphase lag)、染色体随机分离(random division)、核内复制(endoreduplicatin)等。通过对胚胎每个卵裂球染色体的分析，Munne推测导致嵌和体出现的有丝分裂异常可以发生在第一次卵裂时，也可以在第二、三次卵裂过程中。单精受精的二倍体合子与双精受精的三倍体合子相比较，嵌和现象发生的机制和时间有显著区别。(1)单精受精的合子，两性配子的融合正常，嵌和体主要是由于随后有丝分裂异常而造成；如果染色体不分离发生在第一次有丝分裂、即第一次卵裂时，所有卵裂球的染色体型都不正常，表现为多倍/单倍嵌和胚胎；如果在第二或第三次有丝分裂时出现错误，则分别有50%或25%卵裂球的染色体异常，而其他卵裂球为正常二倍体。(2)双精受精的合子，由于存在两个父源性中心体，干扰了有丝分裂时染色体平均分配到两个子细胞的过程，而造成卵裂球染色体异常。卵裂阶段胚胎中观察到的嵌和类型远远多于自发性流产中发现的，可能是由于前者中大部分不能种植[14]。
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三、小结
染色体异常是早期自发性流产常见的原因之一；大量的研究也证明了随母亲年龄的增加，胎儿发生染色体异常的比率明显上升。体外胚胎培养及染色体分析技术的发展使得人们能够深入的了解胚胎早期发育阶段染色体的情况。目前的研究也揭示了胚胎的形态与其内部染色体存在着一定的相关性。由于目前还不能在不损伤胚胎前提下对其染色体进行全面的分析，因此有必要选择形态和卵裂正常的胚胎进行种植。
参考文献
1，程在玉.医学遗传学基础与临床.青岛：青岛出版社，1993，102-111.
2，李牧尧.荧光原位杂交技术.国外医学遗传学分册，1994，17：8-12.
3，Almeida PA，Bolton VN.The relationship between chromosomal abnormalities in the human oocyte and fertilization in vitro.Hum Reprod，1994，9：343-346.
, 百拇医药
4，Almeida PA，Bolton VN.The relationship between chromosomal abnormality in the human preimplantation embryo and development in vitro.Hum Reprod，1996，8：235-241.
5，Sadowy S，Tomkin G，Munne S，et al.Impaired development of zygotes with uneven pronuclear size.Zygote，1998，65：137-141.
6，Pellester F.The cytogenetic analysis of human zygotes and preimplantation embryos.Hum Reprod Update，1995，1：581-585.
, http://www.100md.com 7，Munné S，Lee A，Rosenwaks Z，et al.Diagnosis of major chromosome aneuploidies in human preimplantation embryos.Hum Reprod，1993，8：2185-2191.
8，Munné S，Grifo J，Cohen J，et al.Chromosome abnormalities in human arrested preimplantation embryos：a multiple-probe FISH study.Am J Hum Genet，1994，55：150-159.
9，Munné S，Weier HU，Grifo J，et al.Chromosome mosaicism in human embryos.Biol Reprod，1994，51：373-379.
, http://www.100md.com
10，Munné S，Alikani M，Grifo J，et al.Embryo morphology，developmental rates and maternal age are correlated with chromosome abnormalities.Fertil Steril，1995，64：382-391.
11，Dailey T，Dale B，Cohen J，et al.Association between non-disjunction and maternal age in meiosis-Ⅱ human oocytes detected by FISH analysis.Am J Hum Genet，1996，59：176-184.
12，Kligman I，Benadive C，Alikani M，et al.The presence of multiucleated blastomeres in human embryos is correlated with chromosomal abnormalities.Hum Reprod，1996，11：1492-1498.
13，Artley JK，Braude PR，Johnson MH，et al.Gene activity and cleaage arrested human pre-embryos.Hum-Reprod，1992，7：1014-1021.
14，Munné S，Cohen J.Chromosome abnormalities in human embryos.Hum Reprod Update，1998，4：842-855., http://www.100md.com
单位：(210029 南京医科大学第一附属医院妇产科 江苏省生殖医学重点实验室)
关键词：
江苏医药000526 自第一例试管婴儿Brown诞生以来，体外受精与胚胎培养技术得到了飞速的发展，现在许多不孕症治疗中心采用序贯培养技术已经能将胚胎培养至囊胚阶段。无论是早期对4～8细胞的胚胎进行胚胎移植(Embryo transfer，ET)，还是最新的囊胚培养和辅助孵出(Assisted hatching，AH)后ET，人们主要是根据每个胚胎的形态学指标来判断其质量的优劣。这些形态学指标大致包括：原核的形成时间及形态、卵裂速度、卵裂球的形态数量、细胞碎片的多少、胞浆的性质及透明带的厚度等等。这种以形态学为标准的选择有很大的主观性，并且人们也无法了解其内部的染色体情况。
卵裂球活检及单细胞PCR、荧光原位杂交(Fluorescence in-situ hybridization，FISH)技术的联合运用，使得人们能够在胚胎种植前了解其内部基因和染色体的情况。单细胞PCR技术主要用于诊断单基因遗传病[1]，FISH主要用于判断是否存在染色体异常[2]。本文主要介绍目前运用FISH技术研究胚胎形态与染色体异常所得的一些认识。
, 百拇医药
一、FISH技术
荧光原位杂交是将荧光物质直接标记到核苷酸探针上，在适当条件下与制备好的靶DNA杂交，杂交后洗脱非特异性杂交探针；由于在探针杂交的位置形成荧光，通过荧光显微镜可以直接观察染色体数量的异常。荧光原位杂交具有敏感、快速的特点，如果用多种颜色标记的不同探针进行杂交，还具有同时显示多条染色体的优点：不仅能显示中期分裂相中染色体，还能显示间期核中染色体的情况。
二、不同发育阶段胚胎与染色体的关系
由于不孕症治疗的首要目的是使得病人怀孕，因此大部分形态学好的胚胎被移植入宫腔，而不能用于FISH的研究。除非有特殊要求、或有遗传病史、或女性年龄大于40岁等情况，其胚胎才进行种植前基因诊断(Preimplantation genetic diagnosis，PGD)，所以目前用于研究的胚胎来源受限。
1.受精与合子阶段
, 百拇医药
对于原核阶段的研究目前数量并不多。1994年，Almeida对体外受精失败的卵细胞研究表明其中47%有染色体异常，但进一步分析提示卵细胞染色体异常与其受精能力之间无明显联系[3]。随后，Almeida在1996年分析了250个原核至8细胞阶段的胚胎，其中46个原核阶段异常的胚胎中染色体异常的发生率是65.2%[4]。1998年，Sadowy等人对X、Y、13、18、21号五条染色体同时杂交证明原核形态不正常与原核形态正常的合子相比，其卵裂过程中嵌合体的发生率明显增高；单精受精合子如果其两原核的直径相差大于4微米与那些直径相差小于4微米的合子相比，卵裂率下降，出现多核卵裂球的比例上升[5]。另外，Pellestor发现三原核的合子中81.9%存在染色体异常[6]。目前对原核形态变异的发生机理仍不清楚，主要认为与卵胞浆不成熟有关。
2.2～8细胞阶段
早在1993年，Munne等人运用FISH技术，对X、Y、18、13、21染色体同时进行多色杂交时就发现，在35个胚胎共157个卵裂球中，单精受精但发育异常的胚胎中有70%存在染色体数量异常，主要有嵌合体、多倍体、单倍体，13/21单体、X单体、13/21三体、18三体等各种形式[7]。1994年Munne报道，用X、Y、18染色体探针对131个胚胎共571个卵裂球杂交表明，在发育停滞或形态异常胚胎中56.5%有染色体数量异常，大部分为多倍体或嵌合体，6.1%为X/Y/18单倍体[8]；同年Munne还报道了在163个发育停滞或形态异常的单精受精胚胎中47%出现嵌合体，明显高于形态正常胚胎嵌合体的出现率20%[9]。在一个嵌和型胚胎中，如果染色体异常的卵裂球在总卵裂球比例中<3/8，这种胚胎中有54%为二倍/四倍嵌和胚胎；如果大部分卵裂球(>3/8)都有染色体异常，44%为杂合性嵌和体(chaotic mosaics)。1995年Munne分析了正常生长、生长延迟、生长停滞三组胚胎中嵌和体的发生率，分别为30%、44%、47%，其中正常发育胚胎中主要是二倍/四倍嵌和体，而生长停滞胚胎中主要表现为杂合或多倍嵌和型(chaotic or polyploid mosaics)。另外，非整倍体胚胎出现比率也随女性年龄的增加明显上升[10，11]。1995年Pellester运用PRINS技术也证明了形态异常的胚胎中染色体异常的发生率明显高于形态正常的胚胎，其比率分别为86.6%和36.6%[6]。1996年Almeicda论证了在原核阶段、2～4细胞阶段、5～8细胞阶段染色体异常的发生率为65.2%、54.6%、27.4%，卵裂阶段形态正常的胚胎与形态异常的胚胎相比，染色体异常率为22.2%、65%[4]。Klignem等人比较有多核卵裂球的胚胎(受精2～3天)和无多核卵裂球的胚胎，发现两者染色体异常率分别为76.6%、50.9%(P<0.001)，如果排除非整倍体因素(由于非整倍体的出现大部分是配子形成过程中染色体分离异常而引起，少数是胚胎卵裂发育时染色体不分离所引起)，两者分别为74.5%和32.3%，差异更加明显[12]。对2～8细胞阶段胚胎的大量试验研究都表明，在形态和发育异常的胚胎中，染色体异常的发生率明显高于正常；因此通过形态学来评估可移植的胚胎是有价值的，Ⅲ、Ⅳ级胚胎不适合种植或冷冻保存。
, http://www.100md.com
在发育停滞或形态异常的胚胎中，多倍体、嵌合体及多核卵裂球是最常见的染色体异常情况。多倍体的产生人们主要认为是由于配子出现二倍体造成；单精受精胚胎的细胞分裂停滞(细胞浆的损伤，尤其是细胞骨架破坏、纺锤体功能障碍所造成)而DNA的合成正常也是引起多倍体的原因之一。Artley等人[13]已经证实卵裂停滞并不能阻止DNA的合成。如果在部分卵裂球中，有丝分裂重新恢复，则易出现多核卵裂球的情况。造成嵌和体胚胎出现的机制比较复杂，推测主要是由于有丝分裂过程中出现错误：如染色体不分离(nondisjunction)、分离后期迟滞(anaphase lag)、染色体随机分离(random division)、核内复制(endoreduplicatin)等。通过对胚胎每个卵裂球染色体的分析，Munne推测导致嵌和体出现的有丝分裂异常可以发生在第一次卵裂时，也可以在第二、三次卵裂过程中。单精受精的二倍体合子与双精受精的三倍体合子相比较，嵌和现象发生的机制和时间有显著区别。(1)单精受精的合子，两性配子的融合正常，嵌和体主要是由于随后有丝分裂异常而造成；如果染色体不分离发生在第一次有丝分裂、即第一次卵裂时，所有卵裂球的染色体型都不正常，表现为多倍/单倍嵌和胚胎；如果在第二或第三次有丝分裂时出现错误，则分别有50%或25%卵裂球的染色体异常，而其他卵裂球为正常二倍体。(2)双精受精的合子，由于存在两个父源性中心体，干扰了有丝分裂时染色体平均分配到两个子细胞的过程，而造成卵裂球染色体异常。卵裂阶段胚胎中观察到的嵌和类型远远多于自发性流产中发现的，可能是由于前者中大部分不能种植[14]。
, http://www.100md.com
三、小结
染色体异常是早期自发性流产常见的原因之一；大量的研究也证明了随母亲年龄的增加，胎儿发生染色体异常的比率明显上升。体外胚胎培养及染色体分析技术的发展使得人们能够深入的了解胚胎早期发育阶段染色体的情况。目前的研究也揭示了胚胎的形态与其内部染色体存在着一定的相关性。由于目前还不能在不损伤胚胎前提下对其染色体进行全面的分析，因此有必要选择形态和卵裂正常的胚胎进行种植。
参考文献
1，程在玉.医学遗传学基础与临床.青岛：青岛出版社，1993，102-111.
2，李牧尧.荧光原位杂交技术.国外医学遗传学分册，1994，17：8-12.
3，Almeida PA，Bolton VN.The relationship between chromosomal abnormalities in the human oocyte and fertilization in vitro.Hum Reprod，1994，9：343-346.
, 百拇医药
4，Almeida PA，Bolton VN.The relationship between chromosomal abnormality in the human preimplantation embryo and development in vitro.Hum Reprod，1996，8：235-241.
5，Sadowy S，Tomkin G，Munne S，et al.Impaired development of zygotes with uneven pronuclear size.Zygote，1998，65：137-141.
6，Pellester F.The cytogenetic analysis of human zygotes and preimplantation embryos.Hum Reprod Update，1995，1：581-585.
, http://www.100md.com 7，Munné S，Lee A，Rosenwaks Z，et al.Diagnosis of major chromosome aneuploidies in human preimplantation embryos.Hum Reprod，1993，8：2185-2191.
8，Munné S，Grifo J，Cohen J，et al.Chromosome abnormalities in human arrested preimplantation embryos：a multiple-probe FISH study.Am J Hum Genet，1994，55：150-159.
9，Munné S，Weier HU，Grifo J，et al.Chromosome mosaicism in human embryos.Biol Reprod，1994，51：373-379.
, http://www.100md.com
10，Munné S，Alikani M，Grifo J，et al.Embryo morphology，developmental rates and maternal age are correlated with chromosome abnormalities.Fertil Steril，1995，64：382-391.
11，Dailey T，Dale B，Cohen J，et al.Association between non-disjunction and maternal age in meiosis-Ⅱ human oocytes detected by FISH analysis.Am J Hum Genet，1996，59：176-184.
12，Kligman I，Benadive C，Alikani M，et al.The presence of multiucleated blastomeres in human embryos is correlated with chromosomal abnormalities.Hum Reprod，1996，11：1492-1498.
13，Artley JK，Braude PR，Johnson MH，et al.Gene activity and cleaage arrested human pre-embryos.Hum-Reprod，1992，7：1014-1021.
14，Munné S，Cohen J.Chromosome abnormalities in human embryos.Hum Reprod Update，1998，4：842-855., http://www.100md.com