cyclin D1／p16-pRB调控路径与脑胶质瘤
作者：王存祖 傅震
单位：(10029 南京医科大学第一附属医院神经外科)
关键词：
江苏医药000525 目前对细胞周期的研究表明，人的细胞周期中不同时相间存在关键的调控点，其中以G1→S调控点最为重要。在这些调控点中各调控因子的变化将会影响细胞周期的循环，若为超常加速运行，将导致癌瘤。
一、cyclin D1/p16-pRB路径的结构及作用机制
cyclin(细胞周期素)D1，p16，pRB(视网膜母细胞瘤蛋白)都是G1→S调控点中重要的调控因子。cyclin D1为细胞周期素D家族中的重要成员，其基因定位于染色体11q13，cDNA长约4.2kb，编码蛋白分子量为36KD。p16为细胞周期素依赖激酶(CDK)抑制物(CDK inhibitor，CKI)，其基因又称为多种肿瘤抑制基因1(MTS1)，定位于9p21，cDNA长约960bp，由3个外显子组成，其中第2外显子为编码区主要成分，约含307bp，编码一个16KD蛋白，即p16蛋白。pRB基因定位于人3q14，cDNA长约4.7kb，编码蛋白分子量为110KD。
, 百拇医药
cyclin D1、p16通过CDK使pRB磷酸化或去磷酸化对G1→S期进行有效调节。一般认为按下列顺序进行：生长因子等与细胞上相应受体结合，通过信息传递促进cyclin基因首先表达，产生cyclinD等，其中主要为cyclin D1；cyclin D1与相应CDK结合(主要为CDK4，6)形成复合体，促进CDK4，6对pRB磷酸化；磷酸化后的pRB可释放原来与之结合的转录因子E2F；游离的E2F进入核内结合一系列具有特殊序列的基因启动区(如c-myc，b-myb，cdc2，二氢叶酸还原酶，胸苷激酶以及E2F-1基因启动区)，促进这些基因的转录，细胞将通过G1→S调控点，进入自主分裂程序[1]。
与上述作用机制相反，p16作为CDK4，6特异的抑制剂，可与cyclin D1竞争及与CDK4，6结合，抑制其活性，pRB不能磷酸化，与转录因子E2F结合，而使细胞停滞在G1期。以上机制概括如下：p16—｜CDK4，6：cyclin D1—｜PRB—｜E2Fs[2]。
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从上述分析可以看出：p16为cyclin D1的竞争抑制剂，它们通过CDK4，6作用于共同的限速底物pRB。这三种因子的作用相互关联，构成所谓“cyclin D1/p16-pRB路径”(cyclin D1/p16-pRB pathway)或“pRB路径”。
二、cyclin D1/p16-pRB路径与肿瘤关系密切
pRB基因对肿瘤有抑制作用，长期以来被认为是抑癌基因，它的变异可造成某些细胞过度增殖形成肿瘤。除了在视网膜母细胞瘤外pRB基因在小细胞肺癌、多种肉瘤及膀胱癌中也发现有失活。pRB基因失活的原因大多为基因的缺失或突变。
cyclin D1蛋白在许多肿瘤中有异常过度表达，其原因可能是cyclin D1基因的扩增和染色体11q13上D1位点的基因倒位和易位[1]。过量的cyclin D1导致细胞失去对生长因子依赖而使增殖加速。在胰腺癌中D1基因扩增频率为25%，有68.4%发生cyclin D1过度表达，并且cyclin D1蛋白的聚集是预后较差的标志[3]；cyclin D1蛋白在一些癌前期组织中有所升高，并且与结构异常程度有关[4]。cyclin D1基因扩增和其蛋白的过度表达与肿瘤生长关系密切，提示这一基因可作为基因治疗中的靶基因。
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p16是一种抑癌基因，它的失活是许多肿瘤发生的重要原因。失活的机制包括缺失，5′端CPG岛(CPG island)甲基化以及突变等。p16是人类肿瘤中变异最为频繁的基因之一，成为继pRB和p53基因后又一重要的肿瘤抑制基因。
研究发现cyclin D1、P16、pRB三种基因在许多器官肿瘤或肿瘤细胞系中都存在异常，提示在肿瘤发生过程中这三种基因的异常表达可能是较为普遍的现象，因此越来越受到重视。人们试图从这些基因研究中来寻找肿瘤发生的一般规律，这将为肿瘤的病因探讨以及诊断和基因治疗带来美好的前景。
三、cyclin D1/p16-pRB路径与脑胶质瘤的关系
1.pRB：Burns等[5]用免疫组化和基因分析的方法对25例胶质母细胞瘤进行了分析，发现pRB基因异原性缺失(LOH)为36%(8/25)，在大部分保留2条pRB等位基因和一些基因缺失的标本中虽仍可检出pRB蛋白，但是前者和后者之间存在显著性差异，因此基因的缺失仍是失活的主要原因。Tsuzuki等[6]用PCR-SSCP的方法分析了星形细胞瘤中pRB基因的突变情况，结果为13%，分别发生了外显子22第754密码子(Val→Gly)，外显子17第519密码子(Thr→Pro)，另外有一例外显子26第903密码子缺失导致第905出现终止子，这些突变或缺失的部位与pRB基因功能区相近。
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Nakamura等[7]探讨了在恶性星形细胞瘤中pRB基因异常与细胞凋亡及患者预后的关系。他们对50例原发性恶性星形细胞瘤及其中后来复发的46例进行研究，结果发现复发肿瘤中pRB阴性与pRB阳性标本相比，细胞凋亡下降而增殖加强；患者生存时间在pRB阴性的病例中明显缩短，这说明恶性星形细胞瘤患者预后与pRB异常有关。
2.cyclin D1：cyclin D1在星形细胞的肿瘤中主要为过度表达。Chakrabarty等[8]用免疫组化的方法对48例星形细胞肿瘤进行了研究，并探讨了cyclin D1与肿瘤恶性程度之间的关系。结果发现cyclin D1过度表达随着恶性程度的增加而增加；在毛细胞型和弥漫性星形细胞瘤与间变性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤之间存在显著性差异；另外在弥漫性星形细胞瘤中cyclin D1与细胞增殖情况呈较好的一致性。在一些非星形细胞瘤中未发现有cyclin D1的过度表达，提示这一基因在这些肿瘤中的变异较小[9]。
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3.p16：p16基因变异频率随着胶质瘤病理分型不同而不同。在星形细胞的肿瘤中p16变异频率较高。Rao等[10]报道为29%，均为p16基因纯合缺失；Tsuzuki等[5]的结果为30.4%；Biernat等[11]报道原发胶质母细胞瘤p16缺失率为36%，Burns等[6]为38%；对多形性胶质母细胞瘤研究显示p16基因缺失率为51%[12]；然而在非星形细胞瘤中p16基因异常发生率较小[9]。胶质瘤中p16基因失活的主要原因为基因缺失，而基因突变及5′端CPG岛甲基化发生频率较小[13]。
p16基因变异频率有随胶质瘤恶性程度增高而增高的倾向。Barker等[14]发现在恶性胶质瘤中p16基因纯合缺失在WHO分级较高的病例比在较低的病例中明显普遍。另外在一些恶性程度较高的肿瘤，如胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤及神经母细胞瘤中p16变异频率也较高，分别为36%～48%、51%和35%[6，11，12，15]。
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四、cyclin D1、p16、pRB在胶质瘤发生发展中的关系
研究显示p16异常与pRB异常之间存在负相关。Burns等在胶质母细胞瘤研究中发现p16阳性标本至少伴有CDK4基因扩增或/和pRB基因缺失。Tsuzuki等发现在同一星形细胞瘤标本中出现pRB、p53、p16中一种以上基因缺失的情况较多见，但是p16与pRB基因呈负相关，即p16缺失则pRB正常表达，反之亦然。
这种现象可能是因pRB是G1→S调控点的中心成份，处于cyclin D1和p16下游，其功能缺失可以造成整个调控点失控，从而使上游cyclin D1和p16的异常对细胞的转化成为多余，即两个功能相关的基因产物之间，尤其是中心成份与调节成分异常在肿瘤发生发展过程中不存在相互协同的关系。
从以上分析可以看出cyclin D1与pRB异常之间可能也存在负相关，这有待进一步证实。另外cyclin D1异常与p16异常是否存在关系以及存在何种关系，在pRB调控路径中有没有某种成份异常处于主导地位，这些问题都值得进一步研究。
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参考文献
1，Charles J.Cancer cell cycle.，Science，1996，274：1672-1677.
2，Robert AW.The retinoblastoma protein and cell cycle control，Cell，1995，81：323-330.
3，Susanne G. Overexpression of cyclin D1 in human pancreatic carcinoma is associated with poor prognosis. Cancer Research，1997，57：1634-1637.
4，Tong Z. Concurrent overexpression of cyclin D1 and CDK4 in intestinal adenomas from multiple intestinal neoplasia(Min) mice and human familial adenomatous.Cancer Research，1997，57：169-175.
, http://www.100md.com
5，Burns KL，Ueki K，Jhung SL，et al.Molecular genetic correlates of p16，cdk4，and pRB immunohistochemistry in glioblastomas.J Neuropathol Exp Neurol， 1998，57：122-130.
6，Tsuzuki T，Tsunoda S，Sakaki T，et al.Alterations of retinoblastoma，p53，p16(CDKN2)，and p15 gene in human astrocytomas.Cancer，1996，78：287-293.
7，Nakamura M，Konishi N，Tsunoda S，et al.Retinoblastoma protein expression and MIB-1 correlate with survival of patients with malignant astrocytoma.Cancer，1997，80：242-249.
, http://www.100md.com
8，Chakrabarty A，Bridges LR，Gray S，et al.Cyclin D1 in astrocytic tumors：an immunohistochemistry study.Neuropathol Appl Neurobiol 1996，22：311-316.
9，Sato K，Schauble B，Kleihues P，et al.Infrequent alteratins of the p15，p16，CDK4 and cyclin D1 gene in non-astrocytic human brain tumors.Int J Cancer， 1996，66：305-308.
10，Rao LS.Correlative immunohistochemistry and molecular genetic study of the inactivation of the p16INK4A genes in astrocytomas.Diagn Mol Pathol， 1997，6：115-122.
, 百拇医药
11，Biernat W，Tohma Y，Yonekawa Y，et al.Alteration of cell cycle regulatory genes in primary (de novo) and secondary glioblastomas.Acta Neuropathol(Ber 1)，1997，94：303-309.
12，Hayashi Y，Ueki K，Waha A，et al.Association of EGFR gene amplification and CDKN2(p16/MTS1) gene deletion in glioblastoma multiforme.Brain Pathol， 1997，7：871-875.
13，Schmidt EE，Ichimura K，Messerle KR，et al.Infrequent methylation of CDKN2A(MTS1/p16) and rare mutation of both CDKN2A and CDKN2B(MTS2/p15) in primary astrocytic tumors.Br J Cancer，1997，75：2-8.
14，Barker FG，Chen P，Furman F，et al.p16 deletion and mutation analysis in human brain tumor.J Neurooncol，1997，31：17-23.
15，Ioiascon A，Giordani L，Moretti A，et al.Structural and functional analysis of cyclin dependent kinase inhibitory genes(CDKN2A，CDKN2B， and CDKN2C) in neuroblastoma.Pediatr Res，1998，43：139-144., 百拇医药
单位：(10029 南京医科大学第一附属医院神经外科)
关键词：
江苏医药000525 目前对细胞周期的研究表明，人的细胞周期中不同时相间存在关键的调控点，其中以G1→S调控点最为重要。在这些调控点中各调控因子的变化将会影响细胞周期的循环，若为超常加速运行，将导致癌瘤。
一、cyclin D1/p16-pRB路径的结构及作用机制
cyclin(细胞周期素)D1，p16，pRB(视网膜母细胞瘤蛋白)都是G1→S调控点中重要的调控因子。cyclin D1为细胞周期素D家族中的重要成员，其基因定位于染色体11q13，cDNA长约4.2kb，编码蛋白分子量为36KD。p16为细胞周期素依赖激酶(CDK)抑制物(CDK inhibitor，CKI)，其基因又称为多种肿瘤抑制基因1(MTS1)，定位于9p21，cDNA长约960bp，由3个外显子组成，其中第2外显子为编码区主要成分，约含307bp，编码一个16KD蛋白，即p16蛋白。pRB基因定位于人3q14，cDNA长约4.7kb，编码蛋白分子量为110KD。
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cyclin D1、p16通过CDK使pRB磷酸化或去磷酸化对G1→S期进行有效调节。一般认为按下列顺序进行：生长因子等与细胞上相应受体结合，通过信息传递促进cyclin基因首先表达，产生cyclinD等，其中主要为cyclin D1；cyclin D1与相应CDK结合(主要为CDK4，6)形成复合体，促进CDK4，6对pRB磷酸化；磷酸化后的pRB可释放原来与之结合的转录因子E2F；游离的E2F进入核内结合一系列具有特殊序列的基因启动区(如c-myc，b-myb，cdc2，二氢叶酸还原酶，胸苷激酶以及E2F-1基因启动区)，促进这些基因的转录，细胞将通过G1→S调控点，进入自主分裂程序[1]。
与上述作用机制相反，p16作为CDK4，6特异的抑制剂，可与cyclin D1竞争及与CDK4，6结合，抑制其活性，pRB不能磷酸化，与转录因子E2F结合，而使细胞停滞在G1期。以上机制概括如下：p16—｜CDK4，6：cyclin D1—｜PRB—｜E2Fs[2]。
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从上述分析可以看出：p16为cyclin D1的竞争抑制剂，它们通过CDK4，6作用于共同的限速底物pRB。这三种因子的作用相互关联，构成所谓“cyclin D1/p16-pRB路径”(cyclin D1/p16-pRB pathway)或“pRB路径”。
二、cyclin D1/p16-pRB路径与肿瘤关系密切
pRB基因对肿瘤有抑制作用，长期以来被认为是抑癌基因，它的变异可造成某些细胞过度增殖形成肿瘤。除了在视网膜母细胞瘤外pRB基因在小细胞肺癌、多种肉瘤及膀胱癌中也发现有失活。pRB基因失活的原因大多为基因的缺失或突变。
cyclin D1蛋白在许多肿瘤中有异常过度表达，其原因可能是cyclin D1基因的扩增和染色体11q13上D1位点的基因倒位和易位[1]。过量的cyclin D1导致细胞失去对生长因子依赖而使增殖加速。在胰腺癌中D1基因扩增频率为25%，有68.4%发生cyclin D1过度表达，并且cyclin D1蛋白的聚集是预后较差的标志[3]；cyclin D1蛋白在一些癌前期组织中有所升高，并且与结构异常程度有关[4]。cyclin D1基因扩增和其蛋白的过度表达与肿瘤生长关系密切，提示这一基因可作为基因治疗中的靶基因。
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p16是一种抑癌基因，它的失活是许多肿瘤发生的重要原因。失活的机制包括缺失，5′端CPG岛(CPG island)甲基化以及突变等。p16是人类肿瘤中变异最为频繁的基因之一，成为继pRB和p53基因后又一重要的肿瘤抑制基因。
研究发现cyclin D1、P16、pRB三种基因在许多器官肿瘤或肿瘤细胞系中都存在异常，提示在肿瘤发生过程中这三种基因的异常表达可能是较为普遍的现象，因此越来越受到重视。人们试图从这些基因研究中来寻找肿瘤发生的一般规律，这将为肿瘤的病因探讨以及诊断和基因治疗带来美好的前景。
三、cyclin D1/p16-pRB路径与脑胶质瘤的关系
1.pRB：Burns等[5]用免疫组化和基因分析的方法对25例胶质母细胞瘤进行了分析，发现pRB基因异原性缺失(LOH)为36%(8/25)，在大部分保留2条pRB等位基因和一些基因缺失的标本中虽仍可检出pRB蛋白，但是前者和后者之间存在显著性差异，因此基因的缺失仍是失活的主要原因。Tsuzuki等[6]用PCR-SSCP的方法分析了星形细胞瘤中pRB基因的突变情况，结果为13%，分别发生了外显子22第754密码子(Val→Gly)，外显子17第519密码子(Thr→Pro)，另外有一例外显子26第903密码子缺失导致第905出现终止子，这些突变或缺失的部位与pRB基因功能区相近。
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Nakamura等[7]探讨了在恶性星形细胞瘤中pRB基因异常与细胞凋亡及患者预后的关系。他们对50例原发性恶性星形细胞瘤及其中后来复发的46例进行研究，结果发现复发肿瘤中pRB阴性与pRB阳性标本相比，细胞凋亡下降而增殖加强；患者生存时间在pRB阴性的病例中明显缩短，这说明恶性星形细胞瘤患者预后与pRB异常有关。
2.cyclin D1：cyclin D1在星形细胞的肿瘤中主要为过度表达。Chakrabarty等[8]用免疫组化的方法对48例星形细胞肿瘤进行了研究，并探讨了cyclin D1与肿瘤恶性程度之间的关系。结果发现cyclin D1过度表达随着恶性程度的增加而增加；在毛细胞型和弥漫性星形细胞瘤与间变性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤之间存在显著性差异；另外在弥漫性星形细胞瘤中cyclin D1与细胞增殖情况呈较好的一致性。在一些非星形细胞瘤中未发现有cyclin D1的过度表达，提示这一基因在这些肿瘤中的变异较小[9]。
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3.p16：p16基因变异频率随着胶质瘤病理分型不同而不同。在星形细胞的肿瘤中p16变异频率较高。Rao等[10]报道为29%，均为p16基因纯合缺失；Tsuzuki等[5]的结果为30.4%；Biernat等[11]报道原发胶质母细胞瘤p16缺失率为36%，Burns等[6]为38%；对多形性胶质母细胞瘤研究显示p16基因缺失率为51%[12]；然而在非星形细胞瘤中p16基因异常发生率较小[9]。胶质瘤中p16基因失活的主要原因为基因缺失，而基因突变及5′端CPG岛甲基化发生频率较小[13]。
p16基因变异频率有随胶质瘤恶性程度增高而增高的倾向。Barker等[14]发现在恶性胶质瘤中p16基因纯合缺失在WHO分级较高的病例比在较低的病例中明显普遍。另外在一些恶性程度较高的肿瘤，如胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤及神经母细胞瘤中p16变异频率也较高，分别为36%～48%、51%和35%[6，11，12，15]。
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四、cyclin D1、p16、pRB在胶质瘤发生发展中的关系
研究显示p16异常与pRB异常之间存在负相关。Burns等在胶质母细胞瘤研究中发现p16阳性标本至少伴有CDK4基因扩增或/和pRB基因缺失。Tsuzuki等发现在同一星形细胞瘤标本中出现pRB、p53、p16中一种以上基因缺失的情况较多见，但是p16与pRB基因呈负相关，即p16缺失则pRB正常表达，反之亦然。
这种现象可能是因pRB是G1→S调控点的中心成份，处于cyclin D1和p16下游，其功能缺失可以造成整个调控点失控，从而使上游cyclin D1和p16的异常对细胞的转化成为多余，即两个功能相关的基因产物之间，尤其是中心成份与调节成分异常在肿瘤发生发展过程中不存在相互协同的关系。
从以上分析可以看出cyclin D1与pRB异常之间可能也存在负相关，这有待进一步证实。另外cyclin D1异常与p16异常是否存在关系以及存在何种关系，在pRB调控路径中有没有某种成份异常处于主导地位，这些问题都值得进一步研究。
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1，Charles J.Cancer cell cycle.，Science，1996，274：1672-1677.
2，Robert AW.The retinoblastoma protein and cell cycle control，Cell，1995，81：323-330.
3，Susanne G. Overexpression of cyclin D1 in human pancreatic carcinoma is associated with poor prognosis. Cancer Research，1997，57：1634-1637.
4，Tong Z. Concurrent overexpression of cyclin D1 and CDK4 in intestinal adenomas from multiple intestinal neoplasia(Min) mice and human familial adenomatous.Cancer Research，1997，57：169-175.
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5，Burns KL，Ueki K，Jhung SL，et al.Molecular genetic correlates of p16，cdk4，and pRB immunohistochemistry in glioblastomas.J Neuropathol Exp Neurol， 1998，57：122-130.
6，Tsuzuki T，Tsunoda S，Sakaki T，et al.Alterations of retinoblastoma，p53，p16(CDKN2)，and p15 gene in human astrocytomas.Cancer，1996，78：287-293.
7，Nakamura M，Konishi N，Tsunoda S，et al.Retinoblastoma protein expression and MIB-1 correlate with survival of patients with malignant astrocytoma.Cancer，1997，80：242-249.
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9，Sato K，Schauble B，Kleihues P，et al.Infrequent alteratins of the p15，p16，CDK4 and cyclin D1 gene in non-astrocytic human brain tumors.Int J Cancer， 1996，66：305-308.
10，Rao LS.Correlative immunohistochemistry and molecular genetic study of the inactivation of the p16INK4A genes in astrocytomas.Diagn Mol Pathol， 1997，6：115-122.
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11，Biernat W，Tohma Y，Yonekawa Y，et al.Alteration of cell cycle regulatory genes in primary (de novo) and secondary glioblastomas.Acta Neuropathol(Ber 1)，1997，94：303-309.
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14，Barker FG，Chen P，Furman F，et al.p16 deletion and mutation analysis in human brain tumor.J Neurooncol，1997，31：17-23.
15，Ioiascon A，Giordani L，Moretti A，et al.Structural and functional analysis of cyclin dependent kinase inhibitory genes(CDKN2A，CDKN2B， and CDKN2C) in neuroblastoma.Pediatr Res，1998，43：139-144., 百拇医药