脑胶质瘤中pRB及其相关基因的异常表达
作者：傅震 王存祖
单位：(210029 南京医科大学第一附属医院脑外科)
关键词：脑胶质瘤；视网膜母细胞瘤蛋白调控路径；细胞周期调节基因
江苏医药000513 【摘要】 目的 研究视网膜母细胞瘤蛋白(pRB)及其相关基因在脑胶质瘤中的异常表达情况。方法 用免疫组化的方法对23例脑胶质瘤(包括14例星形细胞瘤和9例胶质母细胞瘤)以及6例正常脑组织中pRB以及cyclinD1、p16基因的表达进行检测。结果 23例肿瘤中有8例pRB缺失(34.8%)，17例cyclinD1过度表达(73.9%)，13例p16缺失(56.5%)，三种因子的异常均与肿瘤分型有关(P<0.01)。由它们组成的调控路径作为整体在肿瘤组织中异常率为82.6%(19/23)，与正常脑组织(1/6，16.7%)相比有显著性差异(P＝0.006)，而星形细胞瘤(10/14，71.4%)和胶质母细胞瘤(9/9，100%)之间并无统计学差别(P＝0.124)，说明此路径异常与肿瘤发生有关而与分型无关。pRB在此调控路径中处于中心位置，与肿瘤的恶化有关。结论 pRB及其相关基因的异常与脑胶质瘤发生关系密切，可以作为探讨肿瘤病因，诊断和治疗的重要靶位。
, 百拇医药
Abnormal expression of pRB and its associated genes in gliomas
FU Zhen，WANG Cunzu.
(Department of Neurosurgery， The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing，210029)
【Abstract】 Objective This experiment was to study the abnormal expression of pRB and its associated genes in gliomas.Methods The expressions of pRB and cyclin D1，p16 genes were screened in 23 gliomas (including 14 astrocytomas and 9 glioblastomas) and 6 normal brain tissues by immunohistochemical method.Results In 23 gliomas，8 cases had pRB deletion(34.8%)，17 cases had cyclin D1 overexpression(73.9%)，and 13 cases had p16 deletion(56.5%)；Abnormalities of these proteins were closely related to tumor types (P<0.01).The alteration of regulatory pathway which consisted of these factors was seen in 82.6% (19/23) cases and had marked difference from normal brain tissues (1/6，16.7%)(P＝0.006).However，there was no statistical significance between astrocytomas (10/14，71.4%) and glioblastomas (9/9，100%)，which indicated that the pathway abnormalities were only associated with tumorigenesis but not with tumor types.PRB gene was in the center of this pathway and related with tumor aggravation.Conclusion The abnormalities of pRB and its associated genes are closely related with tumorigenesis and they are probably important targets in studying the etiology，diagnosis and gene therapy of tumors.
, 百拇医药
【Key words】 Gliomas pRB regulatory pathway Regulatory genes of cell cycle
pRB(视网膜母细胞瘤蛋白)基因是公认的抑癌基因，其蛋白为重要的细胞周期调节因子，主要作用在G1→S期调控点[1]。另外此调控点中还包括p16、cyclinD1等因子，研究已经证明它们与脑胶质瘤关系密切，其中cyclinD1常为过度表达，p16和pRB常表现为缺失[2～5]。
以上因子的作用相互关联，以pRB为中心构成所谓“cyclinD1/p16-pRB路径”或“pRB路径”。在对其他系统肿瘤研究中发现这一路径存在着广泛的异常，认为是导致细胞周期调控失败，增殖加速，而使肿瘤恶化的原因。
本研究将探讨这几种因子及其组成的调控路径在脑胶质瘤中的异常情况，并对其意义进行分析。
, 百拇医药
材料和方法
一、标本
23例肿瘤标本均为南京医科大学第一附属医院脑外科术中切除的新鲜肿瘤组织。其中男16例，女7例，平均年龄37.4岁(2.5～77岁)。病理检查按WHO分类标准分型，包括星形细胞瘤14例(纤维型6例，原浆型4例，间变型4例)，胶质母细胞瘤9例，其中多形性胶质母细胞瘤(GBM)4例。6例正常对照均为脑外科手术中因减压或暴露而切除的脑组织，大脑半球组织3例，小脑组织3例。
二、免疫组化
采用ABC法。组织经10%甲醛固定24小时，石蜡包埋，做切片4张。分别滴加3种蛋白单克隆抗体(均为鼠抗人浓缩型抗体，cyclinD1单抗购于Zymed公司，p16和pRB单抗购于Santa Cruz公司，经1/50 PBS液稀释)；阴性对照片此步骤滴加PBS液。然后分别滴加二抗和ABC(山羊抗鼠ABC试剂盒，DAKO公司，1/100 PBS稀释)。最后经0.6mg/ml DAB和0.3% H2O2染色及显色，苏木素衬染后观片。
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p16和cyclinD1在滴加一抗前需经微波法抗原修复。
阳性对照为本次试验中比较明显的阳性切片。
诊断标准：细胞核和/或细胞浆中出现棕黄色染色为阳性。高倍镜下每一切片角及中央取5个视野，各计数100个瘤细胞中阳性细胞所占的比例，分为：(-)：细胞浆和/或细胞核中无棕黄色染色；(+)：10%～30%；(
)：30%～60%；(
)：>60%。
三、统计学处理
应用χ2检验和秩和检验对结果进行统计学分析。
结果
, 百拇医药
一、pRB、cyclinD1、p16免疫组化
pRB、cyclinD1、p16实验结果见表1。阳性染色在胞核和/或胞浆(如图1～4)。在胶质瘤中cyclinD1表达率为73.9%(17/23)，p16和pRB缺失率分别为56.5%(13/23)和34.8%(8/23)，经秩和检验表明三种因子异常表达均与肿瘤分型有关，即在恶性程度较高的肿瘤中发生频率也较高(P<0.01)。
表1 cyclin D1，p16，pRB在胶质瘤及正常脑组织中表达情况 病理分型
Cyclin D1
p16
pRB
-
+
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-
+
-
+
星形细胞瘤(n＝14)
5
4
4
1
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5
6
2
1
1
4
6
3
纤维型(6)
4
2
0
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1
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3
2
0
0
2
2
2
原浆型(4)
0
1
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1
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0
间变型(4)
1
1
2
0
2
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1
胶质母细胞瘤(n＝9)
1
2
0
6
8
0
1
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7
2
0
0
GBM(4)
1
1
0
2
4
0
0
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4
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0
0
0
正常脑组织(n＝6)
5
0
1
0
0
3
1
2
0
5
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1
0
注：GBM多形性胶质母细胞瘤 组间比较P<0.01
图1 纤维型星形细胞瘤pRB免疫组化(10×3.3):肿瘤染色阳性,在细胞核和细胞浆中
图2 正常脑组织pRB免疫组化(20×3.3):胶质细胞染色阳性,在细胞核中
图3 原浆型星形细胞瘤cyclin D1免疫组化(20×3.3):肿瘤细胞染色阳性,主要在细胞浆中
, 百拇医药
图4 间变型星形细胞瘤pRB免疫组化(20×3.3):在细胞核较正常,突起明显的肿瘤细胞中,大多数染色阳性;面形态异常,核有分裂的肿瘤细胞染色阴性,提示与肿瘤恶化有关
二、pRB路径的异常
23例肿瘤组织中19例(82.6%)有一种以上因子异常，而正常脑组织为16.7%(1/6)，两者之间存在显著性差异(P＝0.006，确切概率法)。星形细胞瘤(10/14，71.4%)和胶质母细胞瘤(9/9，100%)之间并无统计学差别(P＝0.124，确切概率法)(见表2)。
表2 Cyclin D1/p16-pRB路径在胶质瘤及正常脑组织中异常情况 病理分型
Cyclin D1/p16-pRB路径异常 例(%)
肿瘤组(n＝23)
, 百拇医药
19(82.6%)**
星形细胞瘤(14)
10(71.4%)
纤维型(6)
2(33.3%)
原浆型(4)
4(100%)
间变型(4)
4(100%)
胶质母细胞瘤(9)
9(100%)
GBM(4)
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4(100%)
正常脑组织(n＝6)
1(16.7%)
注：GBM多形性胶质母细胞瘤
**与正常脑组织组比较P＝0.006
讨论
一、pRB及相关蛋白在细胞周期中的作用机制
分子生物学的研究发现越来越多的基因与肿瘤发生有关，肿瘤是多种基因综合作用的结果已成为共识[6]。现阶段对细胞周期调控基因的探讨发现人的细胞周期不同时相存在关键的调控点(Check Point)，其中以G1→S期调控点最为重要。pRB及其相关蛋白如p16、cyclin D1(细胞周期素)、CDK(细胞周期依赖性激酶)等都是这一调控点中重要的调控因子。当细胞受到生长因子等物质刺激后，细胞周期素D首先表达，其中最主要的是cyclin D1；cyclin D1与细胞周期依赖性激酶4和6(CDK4，6)形成复合体，可以促进pRB磷酸化；磷酸化的pRB可释放原来与之结合的转入因子E2F进入核内结合一系列基因启动区(c-myc，b-myb，cdc2等)，促进这些基因的转录，细胞将通过G1→S调控点，进入自主分裂程序。p16作为CDK4，6特异的抑制剂，可以抑制其活性，而使pRB不能磷酸化，转录因子E2F不能释放，细胞停滞在G1期[1，7]。
, 百拇医药
二、pRB及其相关因子与胶质瘤的关系
pRB及cyclin D1，p16等与胶质瘤发生关系密切。本次研究发现在星形细胞瘤和胶质母细胞瘤中p16和pRB分别有56.5%(13/23)和34.8%(8/23)发生缺失，cyclin D1有73.9%(17/23)过度表达，且三者的表达与肿瘤分型有显著性相关。一般认为在所有肿瘤癌基因中H-ras表达异常发生率最高，约为10%～36.4%，而抑癌基因中p53最高，约为50%[8～11]。与此相比较cyclin D1，p16和pRB在胶质瘤中异常率都较高，为频发事件，与肿瘤关系密切，这提示我们在肿瘤生物学研究时应把这些因子作为“焦点”。
表3 胶质瘤中cyclin D1，p16，pRB异常表达的相关性
Cyclin D1阳性
p16阴性
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pRB阴性
Cyclin D1阳性
17
10(58.8%)
8(47.1%)
p16阴性
11(84.6%)
13
7(53.8%)
pRB阴性
6(75.0%)
7(87.5%)
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8
注：两两比较无显著性相关
三、pRB路径与胶质瘤的关系
实验结果显示在星形细胞瘤和胶质母细胞瘤中有82.6%(19/23)的患者出现有一种以上的异常，其中前者为71.4%(10/14)，后者为100%(9/9)，两者之间并无统计学上的差别。而在正常脑组织中此路径异常为16.7%(1/6)，与肿瘤组织有显著性差异。提示pRB路径的异常与胶质瘤发生有关，而与病理分型无关。这一发现对于一些偏良性或低度恶性的胶质瘤如纤维型或原浆型星形细胞瘤的诊断有所帮助。
四、pRB及其相关因子在调控路径中的作用
从这些因子的作用机制可以看出，cyclin D1和p16通过CDK作用于共同的限速底物pRB，因此pRB在此路径中应处于中心位置。我们发现pRB的缺失主要发生在间变型星形细胞瘤(1/4)和胶质母细胞瘤(7/9)，在恶性度更高的GBM发生率最高(4/4)；但是在恶性度较低或偏良性的原浆型和纤维型星形细胞瘤中均没有发生。这说明pRB缺失与胶质瘤细胞的恶变关系很大。在1例胶质母细胞瘤中虽然p16为阳性，但是因pRB为阴性，肿瘤仍为高度恶性。这其中的原因可能是pRB处于cyclin D1和p16的调节之下，位于“下游”，它的缺失将导致整个调控点彻底失控；而处于其“上游”的p16和cyclin D1此时作用已不大。所以在此调控路径中，pRB应该是我们研究的重点所在，在基因诊断和治疗中应当成为首要考虑的靶点基因。
, 百拇医药
我们还发现在这一路径中各成分异常相互之间并无显著相关，即其中一种因子异常不会影响到其它两种因子的表达。这可能是因为三者基因不在染色体同一部位，受不同的调节基因控制。这一结果提示我们用其中任何一种因子的检测结果来探讨与肿瘤发生的关系是不全面的，其中某一种因子正常并不代表整个调控路径正常；相反只要其中某一成分异常，pRB调控路径作为一个整体将失去作用，使细胞周期调控失败，肿瘤将有可能发生或恶变。
参考文献
1，Charles J.Cancer cell cycle.Science，1996，274：1672-1677.
2，Chakrabarty A，Bridges LR，Gray S.Cyclin D1 in astrocytic tumors：an immunohistochemical study.Neuropathol Appl Neurobiol，1996，22：311-316.
, http://www.100md.com
3，Rao LS.Correlative immunohistochemistry and molecular genetic study of the inactivation of the p16 INK4A genes in astrocytomas.Diagn Mol Pathol，1997，6：115-122.
4，Tsuzuki T，Tsunoda S，Sakaki T， et al.Alterations of retinoblastoma，p53，p16 (CDKN2)，and p15 genes in human astrocytomas.Cancer，1996，78：287-293.
5，Burns KL，Ueki K，Jhung SL， et al.Molecular genetic correlates of p16，cdk4，and pRB immunohistochemistry in glioblastomas.J Neuropathol Exp Neurol，1998，57：122-130.
, 百拇医药
6，Sehral A.Molecular changes during the genesis of human gliomas.Semin Surg Oncol，1998，14：3-12.
7，Robert AW.The retinoblastoma protein and cell cycle control.Cell，1995，81：323-330.
8，GZ Mirella，Christina MB，Allen SY，et al.Methylation of the 5’CPG island of the p16/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing.Cancer Res，1995，55：4531-4535.
9，Schmidt EE，Ichimura K，Messerle KR，et al.Infrequent methylation of CDKN2A(MTS1/p16) and rare mutation of both CDK2A and CDKN2B(MTS2/p15)in primary astrocytic tumors.Br J Cancer，1997；75：2-8.
10，傅震，周明卫，林厚怡.脑胶质瘤中c-myc基因扩增，H-ras及p53基因突变.中国临床神经科学，1998，6：63-67.
11，Kamb A，Nelleke AG，Jane WF，et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many types.Science，1994，264：436-439.
(收稿：1999-07-21 修回：1999-10-13), 百拇医药
单位：(210029 南京医科大学第一附属医院脑外科)
关键词：脑胶质瘤；视网膜母细胞瘤蛋白调控路径；细胞周期调节基因
江苏医药000513 【摘要】 目的 研究视网膜母细胞瘤蛋白(pRB)及其相关基因在脑胶质瘤中的异常表达情况。方法 用免疫组化的方法对23例脑胶质瘤(包括14例星形细胞瘤和9例胶质母细胞瘤)以及6例正常脑组织中pRB以及cyclinD1、p16基因的表达进行检测。结果 23例肿瘤中有8例pRB缺失(34.8%)，17例cyclinD1过度表达(73.9%)，13例p16缺失(56.5%)，三种因子的异常均与肿瘤分型有关(P<0.01)。由它们组成的调控路径作为整体在肿瘤组织中异常率为82.6%(19/23)，与正常脑组织(1/6，16.7%)相比有显著性差异(P＝0.006)，而星形细胞瘤(10/14，71.4%)和胶质母细胞瘤(9/9，100%)之间并无统计学差别(P＝0.124)，说明此路径异常与肿瘤发生有关而与分型无关。pRB在此调控路径中处于中心位置，与肿瘤的恶化有关。结论 pRB及其相关基因的异常与脑胶质瘤发生关系密切，可以作为探讨肿瘤病因，诊断和治疗的重要靶位。
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Abnormal expression of pRB and its associated genes in gliomas
FU Zhen，WANG Cunzu.
(Department of Neurosurgery， The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing，210029)
【Abstract】 Objective This experiment was to study the abnormal expression of pRB and its associated genes in gliomas.Methods The expressions of pRB and cyclin D1，p16 genes were screened in 23 gliomas (including 14 astrocytomas and 9 glioblastomas) and 6 normal brain tissues by immunohistochemical method.Results In 23 gliomas，8 cases had pRB deletion(34.8%)，17 cases had cyclin D1 overexpression(73.9%)，and 13 cases had p16 deletion(56.5%)；Abnormalities of these proteins were closely related to tumor types (P<0.01).The alteration of regulatory pathway which consisted of these factors was seen in 82.6% (19/23) cases and had marked difference from normal brain tissues (1/6，16.7%)(P＝0.006).However，there was no statistical significance between astrocytomas (10/14，71.4%) and glioblastomas (9/9，100%)，which indicated that the pathway abnormalities were only associated with tumorigenesis but not with tumor types.PRB gene was in the center of this pathway and related with tumor aggravation.Conclusion The abnormalities of pRB and its associated genes are closely related with tumorigenesis and they are probably important targets in studying the etiology，diagnosis and gene therapy of tumors.
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【Key words】 Gliomas pRB regulatory pathway Regulatory genes of cell cycle
pRB(视网膜母细胞瘤蛋白)基因是公认的抑癌基因，其蛋白为重要的细胞周期调节因子，主要作用在G1→S期调控点[1]。另外此调控点中还包括p16、cyclinD1等因子，研究已经证明它们与脑胶质瘤关系密切，其中cyclinD1常为过度表达，p16和pRB常表现为缺失[2～5]。
以上因子的作用相互关联，以pRB为中心构成所谓“cyclinD1/p16-pRB路径”或“pRB路径”。在对其他系统肿瘤研究中发现这一路径存在着广泛的异常，认为是导致细胞周期调控失败，增殖加速，而使肿瘤恶化的原因。
本研究将探讨这几种因子及其组成的调控路径在脑胶质瘤中的异常情况，并对其意义进行分析。
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材料和方法
一、标本
23例肿瘤标本均为南京医科大学第一附属医院脑外科术中切除的新鲜肿瘤组织。其中男16例，女7例，平均年龄37.4岁(2.5～77岁)。病理检查按WHO分类标准分型，包括星形细胞瘤14例(纤维型6例，原浆型4例，间变型4例)，胶质母细胞瘤9例，其中多形性胶质母细胞瘤(GBM)4例。6例正常对照均为脑外科手术中因减压或暴露而切除的脑组织，大脑半球组织3例，小脑组织3例。
二、免疫组化
采用ABC法。组织经10%甲醛固定24小时，石蜡包埋，做切片4张。分别滴加3种蛋白单克隆抗体(均为鼠抗人浓缩型抗体，cyclinD1单抗购于Zymed公司，p16和pRB单抗购于Santa Cruz公司，经1/50 PBS液稀释)；阴性对照片此步骤滴加PBS液。然后分别滴加二抗和ABC(山羊抗鼠ABC试剂盒，DAKO公司，1/100 PBS稀释)。最后经0.6mg/ml DAB和0.3% H2O2染色及显色，苏木素衬染后观片。
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p16和cyclinD1在滴加一抗前需经微波法抗原修复。
阳性对照为本次试验中比较明显的阳性切片。
诊断标准：细胞核和/或细胞浆中出现棕黄色染色为阳性。高倍镜下每一切片角及中央取5个视野，各计数100个瘤细胞中阳性细胞所占的比例，分为：(-)：细胞浆和/或细胞核中无棕黄色染色；(+)：10%～30%；(
)：30%～60%；()：>60%。三、统计学处理
应用χ2检验和秩和检验对结果进行统计学分析。
结果
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一、pRB、cyclinD1、p16免疫组化
pRB、cyclinD1、p16实验结果见表1。阳性染色在胞核和/或胞浆(如图1～4)。在胶质瘤中cyclinD1表达率为73.9%(17/23)，p16和pRB缺失率分别为56.5%(13/23)和34.8%(8/23)，经秩和检验表明三种因子异常表达均与肿瘤分型有关，即在恶性程度较高的肿瘤中发生频率也较高(P<0.01)。
表1 cyclin D1，p16，pRB在胶质瘤及正常脑组织中表达情况 病理分型
Cyclin D1
p16
pRB
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星形细胞瘤(n＝14)
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纤维型(6)
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原浆型(4)
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胶质母细胞瘤(n＝9)
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GBM(4)
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正常脑组织(n＝6)
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注：GBM多形性胶质母细胞瘤 组间比较P<0.01
图1 纤维型星形细胞瘤pRB免疫组化(10×3.3):肿瘤染色阳性,在细胞核和细胞浆中
图2 正常脑组织pRB免疫组化(20×3.3):胶质细胞染色阳性,在细胞核中
图3 原浆型星形细胞瘤cyclin D1免疫组化(20×3.3):肿瘤细胞染色阳性,主要在细胞浆中
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图4 间变型星形细胞瘤pRB免疫组化(20×3.3):在细胞核较正常,突起明显的肿瘤细胞中,大多数染色阳性;面形态异常,核有分裂的肿瘤细胞染色阴性,提示与肿瘤恶化有关
二、pRB路径的异常
23例肿瘤组织中19例(82.6%)有一种以上因子异常，而正常脑组织为16.7%(1/6)，两者之间存在显著性差异(P＝0.006，确切概率法)。星形细胞瘤(10/14，71.4%)和胶质母细胞瘤(9/9，100%)之间并无统计学差别(P＝0.124，确切概率法)(见表2)。
表2 Cyclin D1/p16-pRB路径在胶质瘤及正常脑组织中异常情况 病理分型
Cyclin D1/p16-pRB路径异常 例(%)
肿瘤组(n＝23)
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19(82.6%)**
星形细胞瘤(14)
10(71.4%)
纤维型(6)
2(33.3%)
原浆型(4)
4(100%)
间变型(4)
4(100%)
胶质母细胞瘤(9)
9(100%)
GBM(4)
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4(100%)
正常脑组织(n＝6)
1(16.7%)
注：GBM多形性胶质母细胞瘤
**与正常脑组织组比较P＝0.006
讨论
一、pRB及相关蛋白在细胞周期中的作用机制
分子生物学的研究发现越来越多的基因与肿瘤发生有关，肿瘤是多种基因综合作用的结果已成为共识[6]。现阶段对细胞周期调控基因的探讨发现人的细胞周期不同时相存在关键的调控点(Check Point)，其中以G1→S期调控点最为重要。pRB及其相关蛋白如p16、cyclin D1(细胞周期素)、CDK(细胞周期依赖性激酶)等都是这一调控点中重要的调控因子。当细胞受到生长因子等物质刺激后，细胞周期素D首先表达，其中最主要的是cyclin D1；cyclin D1与细胞周期依赖性激酶4和6(CDK4，6)形成复合体，可以促进pRB磷酸化；磷酸化的pRB可释放原来与之结合的转入因子E2F进入核内结合一系列基因启动区(c-myc，b-myb，cdc2等)，促进这些基因的转录，细胞将通过G1→S调控点，进入自主分裂程序。p16作为CDK4，6特异的抑制剂，可以抑制其活性，而使pRB不能磷酸化，转录因子E2F不能释放，细胞停滞在G1期[1，7]。
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二、pRB及其相关因子与胶质瘤的关系
pRB及cyclin D1，p16等与胶质瘤发生关系密切。本次研究发现在星形细胞瘤和胶质母细胞瘤中p16和pRB分别有56.5%(13/23)和34.8%(8/23)发生缺失，cyclin D1有73.9%(17/23)过度表达，且三者的表达与肿瘤分型有显著性相关。一般认为在所有肿瘤癌基因中H-ras表达异常发生率最高，约为10%～36.4%，而抑癌基因中p53最高，约为50%[8～11]。与此相比较cyclin D1，p16和pRB在胶质瘤中异常率都较高，为频发事件，与肿瘤关系密切，这提示我们在肿瘤生物学研究时应把这些因子作为“焦点”。
表3 胶质瘤中cyclin D1，p16，pRB异常表达的相关性
Cyclin D1阳性
p16阴性
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pRB阴性
Cyclin D1阳性
17
10(58.8%)
8(47.1%)
p16阴性
11(84.6%)
13
7(53.8%)
pRB阴性
6(75.0%)
7(87.5%)
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注：两两比较无显著性相关
三、pRB路径与胶质瘤的关系
实验结果显示在星形细胞瘤和胶质母细胞瘤中有82.6%(19/23)的患者出现有一种以上的异常，其中前者为71.4%(10/14)，后者为100%(9/9)，两者之间并无统计学上的差别。而在正常脑组织中此路径异常为16.7%(1/6)，与肿瘤组织有显著性差异。提示pRB路径的异常与胶质瘤发生有关，而与病理分型无关。这一发现对于一些偏良性或低度恶性的胶质瘤如纤维型或原浆型星形细胞瘤的诊断有所帮助。
四、pRB及其相关因子在调控路径中的作用
从这些因子的作用机制可以看出，cyclin D1和p16通过CDK作用于共同的限速底物pRB，因此pRB在此路径中应处于中心位置。我们发现pRB的缺失主要发生在间变型星形细胞瘤(1/4)和胶质母细胞瘤(7/9)，在恶性度更高的GBM发生率最高(4/4)；但是在恶性度较低或偏良性的原浆型和纤维型星形细胞瘤中均没有发生。这说明pRB缺失与胶质瘤细胞的恶变关系很大。在1例胶质母细胞瘤中虽然p16为阳性，但是因pRB为阴性，肿瘤仍为高度恶性。这其中的原因可能是pRB处于cyclin D1和p16的调节之下，位于“下游”，它的缺失将导致整个调控点彻底失控；而处于其“上游”的p16和cyclin D1此时作用已不大。所以在此调控路径中，pRB应该是我们研究的重点所在，在基因诊断和治疗中应当成为首要考虑的靶点基因。
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我们还发现在这一路径中各成分异常相互之间并无显著相关，即其中一种因子异常不会影响到其它两种因子的表达。这可能是因为三者基因不在染色体同一部位，受不同的调节基因控制。这一结果提示我们用其中任何一种因子的检测结果来探讨与肿瘤发生的关系是不全面的，其中某一种因子正常并不代表整个调控路径正常；相反只要其中某一成分异常，pRB调控路径作为一个整体将失去作用，使细胞周期调控失败，肿瘤将有可能发生或恶变。
参考文献
1，Charles J.Cancer cell cycle.Science，1996，274：1672-1677.
2，Chakrabarty A，Bridges LR，Gray S.Cyclin D1 in astrocytic tumors：an immunohistochemical study.Neuropathol Appl Neurobiol，1996，22：311-316.
, http://www.100md.com
3，Rao LS.Correlative immunohistochemistry and molecular genetic study of the inactivation of the p16 INK4A genes in astrocytomas.Diagn Mol Pathol，1997，6：115-122.
4，Tsuzuki T，Tsunoda S，Sakaki T， et al.Alterations of retinoblastoma，p53，p16 (CDKN2)，and p15 genes in human astrocytomas.Cancer，1996，78：287-293.
5，Burns KL，Ueki K，Jhung SL， et al.Molecular genetic correlates of p16，cdk4，and pRB immunohistochemistry in glioblastomas.J Neuropathol Exp Neurol，1998，57：122-130.
, 百拇医药
6，Sehral A.Molecular changes during the genesis of human gliomas.Semin Surg Oncol，1998，14：3-12.
7，Robert AW.The retinoblastoma protein and cell cycle control.Cell，1995，81：323-330.
8，GZ Mirella，Christina MB，Allen SY，et al.Methylation of the 5’CPG island of the p16/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human tissues correlates with gene silencing.Cancer Res，1995，55：4531-4535.
9，Schmidt EE，Ichimura K，Messerle KR，et al.Infrequent methylation of CDKN2A(MTS1/p16) and rare mutation of both CDK2A and CDKN2B(MTS2/p15)in primary astrocytic tumors.Br J Cancer，1997；75：2-8.
10，傅震，周明卫，林厚怡.脑胶质瘤中c-myc基因扩增，H-ras及p53基因突变.中国临床神经科学，1998，6：63-67.
11，Kamb A，Nelleke AG，Jane WF，et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many types.Science，1994，264：436-439.
(收稿：1999-07-21 修回：1999-10-13), 百拇医药