改良DTNB比色法测定血清GSH-PX活力
作者：邓修惠 黄学梅 李伟道 林一民
单位：重庆市肿瘤研究所 400030
关键词：
重庆医学000551
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是体内重要的抗氧化物酶之一，具有清除自由基和脂质过氧化物，保护细胞膜及生物大分子结构的生物学功能。硒是GSH-Px必需成份。因此，测定该酶活力对了解机体抗氧化状态及血硒水平等方面有着非常重要的意义。
我们参照了近年文献报道的测定血清GSH-Px活力的各种方法，建立了适合临床开展的DTNB比色法，并做成了检测试剂盒[1、2、3、4]，现报告如下。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 试剂
1.1.1 叠氮钠磷酸盐缓冲液(pH7.0) 内含2.5mmol/LNaN3，0.2mmol/L EDTA,0.2mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。
1.1.2 1.0mmol/LGSH溶液 称取GSH3.07mg，用上述缓冲液溶解至10ml(使用前配制)。
1.1.3 1.25mmol/LH2O2溶液 取30%H2O213～15μL，加双蒸水稀释至100ml(使用前配制)。
1.1.4 50g/L三氯乙酸 用双蒸水配制。
, 百拇医药 1.1.5 碱液：0.4mol/L Na2HPO4溶液，(pH10.0)。
1.1.6 DTNB显色液 40mgDTNB和1g枸椽酸三钠溶于100ml叠氮钠磷酸盐缓冲液内。
1.2 仪器 721型分光光度计(日本岛津)。
1.3 方法 取试管分别标明测定、对照和空白管。测定管中加血清400μ1，1.0mmol/LGSH溶液400μ1；对照管中加1.0mmol/LGSH和磷酸盐缓冲液各400μ1；空白管加水和pH7.0磷酸盐缓冲液各0.4ml。各管置37℃水浴预温5分钟，然后加入已预温至37℃水浴的1.25mmol/LH2O2溶液0.2ml，混匀，继续保温5分钟后，立即加入50g/L三氯乙酸4ml，混匀放10分钟后，3000r/分钟离心10分钟。各管取上清液2ml，加碱液2.5ml和DTNB显色液0.5ml，反应1分钟，用1cm光径石英皿，在分光光度计上于422nm波长，读取吸光度值。
, 百拇医药
单位定义：以每升血清，37℃每分钟催化1μmol GSH氧化的酶量为一个酶活性单位。计算公式：
2 结 果
2.1 测定了91名(男63例、女28例)健康成人血清GSH-PX活力，其值为115.3±21.2u/L x±s，经d检验符合正态分布(d＝0.2812，n＝91，P>0.2)。男、女血清GSH-PX活力各为114.76±21.55和115.1±20.04，男女之间GSH-PX活力无显著性差异(t＝5.7、P<0.001)。
2.2 GSH浓度与吸光度值的关系 GSH浓度在20～240μmol/L内与吸光度值呈直线关系，y＝0.13+0.0053x，r＝0.999。
, 百拇医药
2.3 复复性实验 取两份混合血清，各重复测10次，批内变异系数各为7.1%和7.2%。另取一份血清分4次测定，批间变异系数为7.5%。
2.4 中止酶反应后标本液的稳定性 取10份血清标本，加入中止液后一部分上清液立即进行酶活力测定，另一部位上清液置4℃冰箱放置24小时后再测其酶活力，两者酶活力之间差异无显著性(0.50.2)。
2.5 标本存放时间对GSH-PX活力影响 将冻存于-20℃血清标本36份，分别于4、20、30天取出，测其GSH-PX活力。第4天值为121.5±21.5u/L。第20天值为109.47±31.8u/L，分别与当天测定值115.1±20.0u/L比较均无显著性差异(t值分别为1.29、0.95，P>0.2)。冻存第30天标本，其活力为100.7±24.1，与当天测定值比较有显著性意义(t值为3.03，P<0.005)。
, 百拇医药
3 讨 论
近年研究表明，肿瘤、肝病、心血管等疾病的发生发展与体内自由基的产生和清除失衡密切相关。由于检测血中氧自由基技术上比较困难，通过检测血中抗氧化物酶来反映机体自由基的状态，则比较容易。GSH-PX是体内重要的抗氧化物酶之一，测其活力可了解机体抗氧化能力，同时硒是GSH-PX的必需成分，血硒水平下降，导致该酶活力降低，补硒治疗后，酶活力增强，机体清除自由基能力增强，从而减少各种疾病的发生发展，因此测定GSH-PX活力有极其重要的意义[5]。
测定GSH-PX活力多采用全血标本，为了排除血红蛋白的影响，还需同时测其标本中的血红蛋白量，实验繁琐。我室建立的改良血清DTNB比色法，直接用公式计算，既不需血红蛋白校正，又不必做标准曲线查找，国内尚未见有关报道。该法操作简单，实验稳定，不需昂贵试剂及仪器，易于推广应用。
, 百拇医药
由于血液中红细胞GSH含量高，故标本应避免溶血，并要及时分离血清。冰冻存于-20℃的血清标本在20天内测定，其酶活力不受影响。
酶反应在5分钟内完成，因此一次测定标本数量不宜太多。
显色液DTNB反应体系的最适pH为8.0，因此碱液pH务必调至10.0，否则影响显色效果。
由于该法是通过测定GSH消耗量来反映酶活力，因此在称取反应底物GSH时应严格要求准确。GSH在非酶状况下也能进行氧化反应，GSH必须在实验前配制。
参考文献
1，夏奕明，朱莲珍.血和组织中谷胱甘肽过氧化物酶活力的测定方法.卫生研究，1987，16(4)：29
2，张嘉麟，方允中.血液中谷胱甘肽过氧化物酶活力微量测定.中华医学检验杂志，1985，8(4)：199
3，唐爱国，杨锡兰，王继贵，等.血清(浆)谷胱甘肽过氧化物酶荧光测定法.临床检验杂志，1991，9(2)：75
4，黄履成，唐琼华.谷胱甘肽过氧化物酶的检测及意义.临床检验杂志，1993，11(1)：45
5，张企兰，张晓红，罗虹，等.癌症病人全血硒和含硒酶活性水平探讨.实用肿瘤杂志，1995，10(1)：21, 百拇医药
单位：重庆市肿瘤研究所 400030
关键词：
重庆医学000551
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是体内重要的抗氧化物酶之一，具有清除自由基和脂质过氧化物，保护细胞膜及生物大分子结构的生物学功能。硒是GSH-Px必需成份。因此，测定该酶活力对了解机体抗氧化状态及血硒水平等方面有着非常重要的意义。
我们参照了近年文献报道的测定血清GSH-Px活力的各种方法，建立了适合临床开展的DTNB比色法，并做成了检测试剂盒[1、2、3、4]，现报告如下。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 试剂
1.1.1 叠氮钠磷酸盐缓冲液(pH7.0) 内含2.5mmol/LNaN3，0.2mmol/L EDTA,0.2mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。
1.1.2 1.0mmol/LGSH溶液 称取GSH3.07mg，用上述缓冲液溶解至10ml(使用前配制)。
1.1.3 1.25mmol/LH2O2溶液 取30%H2O213～15μL，加双蒸水稀释至100ml(使用前配制)。
1.1.4 50g/L三氯乙酸 用双蒸水配制。
, 百拇医药 1.1.5 碱液：0.4mol/L Na2HPO4溶液，(pH10.0)。
1.1.6 DTNB显色液 40mgDTNB和1g枸椽酸三钠溶于100ml叠氮钠磷酸盐缓冲液内。
1.2 仪器 721型分光光度计(日本岛津)。
1.3 方法 取试管分别标明测定、对照和空白管。测定管中加血清400μ1，1.0mmol/LGSH溶液400μ1；对照管中加1.0mmol/LGSH和磷酸盐缓冲液各400μ1；空白管加水和pH7.0磷酸盐缓冲液各0.4ml。各管置37℃水浴预温5分钟，然后加入已预温至37℃水浴的1.25mmol/LH2O2溶液0.2ml，混匀，继续保温5分钟后，立即加入50g/L三氯乙酸4ml，混匀放10分钟后，3000r/分钟离心10分钟。各管取上清液2ml，加碱液2.5ml和DTNB显色液0.5ml，反应1分钟，用1cm光径石英皿，在分光光度计上于422nm波长，读取吸光度值。
, 百拇医药
单位定义：以每升血清，37℃每分钟催化1μmol GSH氧化的酶量为一个酶活性单位。计算公式：
2 结 果
2.1 测定了91名(男63例、女28例)健康成人血清GSH-PX活力，其值为115.3±21.2u/L x±s，经d检验符合正态分布(d＝0.2812，n＝91，P>0.2)。男、女血清GSH-PX活力各为114.76±21.55和115.1±20.04，男女之间GSH-PX活力无显著性差异(t＝5.7、P<0.001)。
2.2 GSH浓度与吸光度值的关系 GSH浓度在20～240μmol/L内与吸光度值呈直线关系，y＝0.13+0.0053x，r＝0.999。
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2.3 复复性实验 取两份混合血清，各重复测10次，批内变异系数各为7.1%和7.2%。另取一份血清分4次测定，批间变异系数为7.5%。
2.4 中止酶反应后标本液的稳定性 取10份血清标本，加入中止液后一部分上清液立即进行酶活力测定，另一部位上清液置4℃冰箱放置24小时后再测其酶活力，两者酶活力之间差异无显著性(0.5
2.5 标本存放时间对GSH-PX活力影响 将冻存于-20℃血清标本36份，分别于4、20、30天取出，测其GSH-PX活力。第4天值为121.5±21.5u/L。第20天值为109.47±31.8u/L，分别与当天测定值115.1±20.0u/L比较均无显著性差异(t值分别为1.29、0.95，P>0.2)。冻存第30天标本，其活力为100.7±24.1，与当天测定值比较有显著性意义(t值为3.03，P<0.005)。
, 百拇医药
3 讨 论
近年研究表明，肿瘤、肝病、心血管等疾病的发生发展与体内自由基的产生和清除失衡密切相关。由于检测血中氧自由基技术上比较困难，通过检测血中抗氧化物酶来反映机体自由基的状态，则比较容易。GSH-PX是体内重要的抗氧化物酶之一，测其活力可了解机体抗氧化能力，同时硒是GSH-PX的必需成分，血硒水平下降，导致该酶活力降低，补硒治疗后，酶活力增强，机体清除自由基能力增强，从而减少各种疾病的发生发展，因此测定GSH-PX活力有极其重要的意义[5]。
测定GSH-PX活力多采用全血标本，为了排除血红蛋白的影响，还需同时测其标本中的血红蛋白量，实验繁琐。我室建立的改良血清DTNB比色法，直接用公式计算，既不需血红蛋白校正，又不必做标准曲线查找，国内尚未见有关报道。该法操作简单，实验稳定，不需昂贵试剂及仪器，易于推广应用。
, 百拇医药
由于血液中红细胞GSH含量高，故标本应避免溶血，并要及时分离血清。冰冻存于-20℃的血清标本在20天内测定，其酶活力不受影响。
酶反应在5分钟内完成，因此一次测定标本数量不宜太多。
显色液DTNB反应体系的最适pH为8.0，因此碱液pH务必调至10.0，否则影响显色效果。
由于该法是通过测定GSH消耗量来反映酶活力，因此在称取反应底物GSH时应严格要求准确。GSH在非酶状况下也能进行氧化反应，GSH必须在实验前配制。
参考文献
1，夏奕明，朱莲珍.血和组织中谷胱甘肽过氧化物酶活力的测定方法.卫生研究，1987，16(4)：29
2，张嘉麟，方允中.血液中谷胱甘肽过氧化物酶活力微量测定.中华医学检验杂志，1985，8(4)：199
3，唐爱国，杨锡兰，王继贵，等.血清(浆)谷胱甘肽过氧化物酶荧光测定法.临床检验杂志，1991，9(2)：75
4，黄履成，唐琼华.谷胱甘肽过氧化物酶的检测及意义.临床检验杂志，1993，11(1)：45
5，张企兰，张晓红，罗虹，等.癌症病人全血硒和含硒酶活性水平探讨.实用肿瘤杂志，1995，10(1)：21, 百拇医药