WT-1通过下调c-myb表达抑制U937细胞增殖
作者：卢青 刘革修 欧大明 曾高峰
单位：卢青(衡阳医学院附属二医院血液内科 421001)；刘革修(衡阳医学院药理教研室)；欧大明(衡阳医学院附属一医院血液科)；曾高峰(衡阳医学院附属二医院血液内科 421001)
关键词：U937细胞；Wilms瘤基因；硫代反义脱氧寡核苷酸
中国现代医学杂志000504 目的：研究Wilms瘤基因在白血病发病中的作用机制。方法：采用反义、Northern blot和流式细胞技术分析了硫代反义WT-1基因脱氧寡核苷酸和硫代反义c-myb基因对U937细胞增殖和基因表达的影响。结果：5μmol/L WT1反义脱氧寡核苷酸处理的U937细胞WT1蛋白表达下降37%，c-myb mRNA水平上升不明显；10μmol/L时可抑制其WT1蛋白87%，c-myb mRNA水平上升明显，同时Myb蛋白水平上升46%(P<0.01)。5，10μmol/L c-myb基因反义脱氧寡核苷酸可抑制其Myb蛋白39%、83%(与对照组比较，均P<0.01)，对WT1表达无显著改变。结论：WT1可以通过下调c-myb表达抑制U937细胞增殖基因表达。
, 百拇医药
分类号 R733.7
WT1 INHIBITED PROLIFERATION OF HUMAN MONOCYTIC
U937 CELLS BY DOWNREGULATING C-MYB EXPRESSINO
Lu Qing, Liu Gexiu, Ou Daming, Zhen Gaofeng
The Second Affiliated Hospital of Hengyang Medical College, Hengyang 421001
[Abstract] Objective: To elucidate a role for the Wilms tumor gene (WT1) in leukemogenesis. Methods: We investigated the effect of phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides (AN-S-ODNs) specific to WT1 gene on the expression of c-myb gene in U937 cells. Northern blot and flow cytometry technologies were used to detect mRNA and protein levels, respectively. Results: 5umol/L AN-S-ODNs for WT1 mRNA significantly inhibited WT1 protein expression in U937 cells at 37% (p<0.01). 10 umol/L AN-S-ODNs inhibited WT1 protein expression in U937 cells at 87% (p<0.01). And increased c-myb expression both at mRNA and protein level (46%, p<0.01), but no effect on WT1 expression in U937. Conclusions: Wilms tumor gene regulates the expression of c-myb gene expression in U937 cells.
, 百拇医药
Key words:U937 cell; Wilms tumor gene; c-myb gene
Wilms瘤基因(Wilms tumor suppressor gene,WT-1)编码蛋白属于锌指结构转录因子[1]。功能研究表明，WT1属抑癌基因，即可激活、又可抑制转录，从而抑制细胞的生长，并诱导细胞的凋亡[2～4]。 不仅在正常人骨髓多能干细胞及在鼠胚血液形成期的卵黄囊和肝中表达丰富，而且有80%的急性粒细胞性白血病中也发现有WT1 mRNA表达[5]。为了进一步阐明WT1在白血病中的作用和其与c-myb基因在白血病中的关系，作者选择了单核白血细胞系U937细胞株来研究硫代反义WT1 mRNA脱氧寡核苷酸对其增殖和c-myb基因表达的影响，为白血病的发病机制及治疗提供依据。
1 材料和方法
1.1 主要材料
, 百拇医药
WT1基因ODN设计参见文献[6]，antisense-S-ODNs:5'GT*CGGAG*CCATTTGCT*G3'，位于翻译起始位点处，sense-S-ODNs:5'CA*GCAAATGGG*CTCCGA*C3;c-myb基因ODN设计参见文献[7]，antisense-S-ODNs:5' GT*GCCGGGG*TCTTCGGG*C 3'，位于翻译起始位点处，sense-S-ODNs:5' GC*CCGAAGAC*CCCGGCA*C 3'，*标记的为硫代修饰的碱基，由上海生物工程公司合成，HPLC纯化。RPMI-1640为GIBCOLab产品。FITC标记的鼠抗人IgG：JACKSON公司产品。鼠抗人Myb单克隆抗体(McAb)：Sants Cruz生物技术公司产品。
1.2 U937细胞的培养及处理
U937细胞株由上海第二医科大学唐立军博士提供。采用96孔培养板，在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中置于37℃含5%CO2和95%空气的培养箱中培养，细胞密度为106个/孔，每2天换1次。
, 百拇医药
1.3 Northern blot
ODN探针采用随机引物，地高辛进行标记法制备。U937细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养处理后，总RNA提取采用异硫氰酸胍一步法，经RNA凝胶电泳，进行Northern blot分析。核酸杂交见Boehringer公司试剂盒说明书。
1.4 流式细胞计数仪分析蛋白表达
将先用不含胎牛血清RPMI-1640培养基换液的U937细胞分为三组：反义ODN组、正义ODN组和对照组，每组5孔，对照组只加培养基，处理组另加ODN。处理培养4h后，加胎牛血清至10%终浓度，继续培养48h再进行测定。细胞用70%的乙醇固定。用WT1/Myb单抗作为第1抗体，FITC标记的羊抗鼠抗体作为第2抗体。阴性对照组第1抗体用小鼠IgG，实验组分为：硫代反义ODN组、硫代正义ODN级。
, http://www.100md.com 1.5 统计学处理
检验结果用(
±s)表示，两组比较用t检验。统计显著性以P<0.05判断。2 结果
2.1 U937细胞WT-1表达检测
结果显示WT-1基因ODN探针杂交阳性(见图1)；流式细胞仪分析显示其可产生较强特异荧光，以上二者说明该U937细胞有WT1蛋白表达。
A Northern分析显示WT-1 mRNA
B 流式细胞分析显示WT1蛋白
图1 U937细胞WT1基因表达分析
, 百拇医药
2.2 WT1基因硫代反义ODN对WT1蛋白和/或c-myb基因表达的影响
结果显示：5μmol/L WT1反义ODN处理的U937细胞WT1蛋白表达下降37%，10μmol/L AN-S-ODNs即可抑制其WT1蛋白87%；5μmol/L WT1反义ODN经处理后，c-myb mRNA水平上升不明显，10μmol/L AN-S-ODN处理后，Myb蛋白水平上升46%(P<0.01)，myb mRNA水平上升不明显。而<30μmol/L硫代正义ODNs抑制Myb蛋白表达(见表1和图2)。硫代反义/正义ODNs浓度大于30μmol/L时，表现有细胞毒性作用，在此未列。
表1 流式细胞分析WT1硫代ODN对U937细胞WT1、Myb蛋白表达的影响 (±s) 组别
WT1
, 百拇医药
Myb
对照组
3150±670
5740±850
5μmol/L
1980±320*
4470±980
反义ODN
10μmol/L
397±57*
8370±1150*
, 百拇医药
20μmol/L
278±73*
7397±1370*
正义ODN
20μmol/L
3540±730
5120±840
注：*与对照组比较P<0.01 蛋白水平以荧光强度表示，n=6
1为20μmol/L正义ODN，2、3、4和5分别为0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L反义ODN
, http://www.100md.com
图2 Northern分析WT1反义ODN
对U937细胞c-myb mRNA的影响
2.3 c-myb硫代反义ODN对Myb蛋白和/或WT1基因表达的影响
流式细胞分析显示5μmol/L和10μmol/L c-myb AN-S-ODNs可分别抑制其Myb蛋白表达39%和83%(与对照组比较P<0.01)，20μmol/L时Myb蛋白虽完全被抑制，但对WT1基因表达无影响：正义硫代c-myb ODNs对U937细胞Myb和WT1表达均无影响(与对照组比较P>0.05)，见表2和图3。
表2 流式细胞分析硫代反义c-myb ODN对U937细胞WT1、Myb蛋白表达的影响 (±s) 组别
, http://www.100md.com
WT1
Myb
对照组
3570±770
6340±1250
5μmol/L
3960±830
3870±1070*
反义ODN
10μmol/L
3280±760
1060±270*
, 百拇医药
20μmol/L
3370±810
530±160*
5μmol/L
3840±650
5780±1030
正义ODN
10μmol/L
2680±820
5230±1170
20μmol/L
3540±790
, 百拇医药
6530±1090
注：*与对照组比较P<0.01 蛋白水平以荧光强度表示，n=6
1、2、3和4分别为0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L
图3 Northern分析硫代反义c-myb ODN
对U937细胞WT1 mRNA表达影响
3 讨论
Myb属原癌基因，具有促进血细胞转化作用，从而导致各种白血病[9]。McCann[8]研究显示c-myb基因启动子含有一个Egr位点，该位点对其基因表达具有负性调节作用。而WT1能与该位点结合，从而抑制其启动子。为了研究WT1与C-myb基因的关系以及它们在白血病中的作用，作者应用反义核酸技术。虽然其被应用于临床尚有些问题有待解决，但在体外研究特异基因表达方面具有较肯定的作用。为了增加反义ODN的稳定性，作者采用了部分硫代修饰碱基。结果该实验清楚地显示了WT1基因硫代反义ODNs可以显著抑制U937细胞WT1 mRNA的翻译，并伴有Myb蛋白表达增高和细胞增殖，而c-myb硫代反义ODN可以显著抑制其蛋白表达和细胞增殖，但对WT1基因表达无明显影响。由以上可以推断出WT1有可能通过调查原癌基因c-myb表达而抑制细胞增殖，进一步证实WT1为肿瘤抑制基因[10]。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Rauscher FJ,Morris JF,Tournay OE,et al.Binding of the wilms tumor locus zinc finger protein to the EGR-1 consensus sequence.Science,1990:1259～1263
2 Haber DA,Park S,Maheswaran S,et al.WT1-mediated growth suppression of Wilms tumor cells expressing a WT1 splicing variant.Science,1993;262:2057
3 Werner H,Shn-Orr Z,Rauscher FJ,et al.Inhibition of cellular prolife ration by the Wilms tumor suppressor WT1 is associated with suppression of insulin-like growth factor I receptor gene epression.Mol Cell Biol,1995;15:3516
, 百拇医药
4 Englert C,Hou X,Maheswaran S,et al.WT1 suppresses synthesis of the epidermal growth factor receptor and induces apoptosis.EMBO J,1995;14:4662
5 Miwa H,Beran M,Saunders GF.Expression of the Wilms tumor gene (WT1) in human leukemias.Leukemia,1992;6:405
6 Yamagami T,Sugiyama H,Inoue K,et al.Growth inhition of human leukemic cells by WT1(Wilms tumorgene)antisense oligodexxyynucleotides;implications for the involvement of WT1 in leukmogenesis.Blood,1996:787～878
, http://www.100md.com
7 Anfossi G,Gewirtz AM,Calabretta B:An oligomer complementary to c-myb encoded mRNA inhibits proliferation of human myeloid leukemia cell lines.Proc Nat 1 Acad Sci USA,1989;86:3379
8 McCann S,Sullivan J,Guerre J,et al.Repression of the c-myb gene by WT1 protein in T and B cell lines.J Biol chem,1995;253:1550～1553
9 Mountz JD,Subler MA,et al.Regulation of c-myb oncogene expression in immature and mature murin tcells.Mol Immunol,1993;30:787～795
10 Tenen DG,Hromas R,Licht JD,et al.Transcription factors,normal myeloid development and leukemia.Blood,1997;90(2):489～519, http://www.100md.com
单位：卢青(衡阳医学院附属二医院血液内科 421001)；刘革修(衡阳医学院药理教研室)；欧大明(衡阳医学院附属一医院血液科)；曾高峰(衡阳医学院附属二医院血液内科 421001)
关键词：U937细胞；Wilms瘤基因；硫代反义脱氧寡核苷酸
中国现代医学杂志000504 目的：研究Wilms瘤基因在白血病发病中的作用机制。方法：采用反义、Northern blot和流式细胞技术分析了硫代反义WT-1基因脱氧寡核苷酸和硫代反义c-myb基因对U937细胞增殖和基因表达的影响。结果：5μmol/L WT1反义脱氧寡核苷酸处理的U937细胞WT1蛋白表达下降37%，c-myb mRNA水平上升不明显；10μmol/L时可抑制其WT1蛋白87%，c-myb mRNA水平上升明显，同时Myb蛋白水平上升46%(P<0.01)。5，10μmol/L c-myb基因反义脱氧寡核苷酸可抑制其Myb蛋白39%、83%(与对照组比较，均P<0.01)，对WT1表达无显著改变。结论：WT1可以通过下调c-myb表达抑制U937细胞增殖基因表达。
, 百拇医药
分类号 R733.7
WT1 INHIBITED PROLIFERATION OF HUMAN MONOCYTIC
U937 CELLS BY DOWNREGULATING C-MYB EXPRESSINO
Lu Qing, Liu Gexiu, Ou Daming, Zhen Gaofeng
The Second Affiliated Hospital of Hengyang Medical College, Hengyang 421001
[Abstract] Objective: To elucidate a role for the Wilms tumor gene (WT1) in leukemogenesis. Methods: We investigated the effect of phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides (AN-S-ODNs) specific to WT1 gene on the expression of c-myb gene in U937 cells. Northern blot and flow cytometry technologies were used to detect mRNA and protein levels, respectively. Results: 5umol/L AN-S-ODNs for WT1 mRNA significantly inhibited WT1 protein expression in U937 cells at 37% (p<0.01). 10 umol/L AN-S-ODNs inhibited WT1 protein expression in U937 cells at 87% (p<0.01). And increased c-myb expression both at mRNA and protein level (46%, p<0.01), but no effect on WT1 expression in U937. Conclusions: Wilms tumor gene regulates the expression of c-myb gene expression in U937 cells.
, 百拇医药
Key words:U937 cell; Wilms tumor gene; c-myb gene
Wilms瘤基因(Wilms tumor suppressor gene,WT-1)编码蛋白属于锌指结构转录因子[1]。功能研究表明，WT1属抑癌基因，即可激活、又可抑制转录，从而抑制细胞的生长，并诱导细胞的凋亡[2～4]。 不仅在正常人骨髓多能干细胞及在鼠胚血液形成期的卵黄囊和肝中表达丰富，而且有80%的急性粒细胞性白血病中也发现有WT1 mRNA表达[5]。为了进一步阐明WT1在白血病中的作用和其与c-myb基因在白血病中的关系，作者选择了单核白血细胞系U937细胞株来研究硫代反义WT1 mRNA脱氧寡核苷酸对其增殖和c-myb基因表达的影响，为白血病的发病机制及治疗提供依据。
1 材料和方法
1.1 主要材料
, 百拇医药
WT1基因ODN设计参见文献[6]，antisense-S-ODNs:5'GT*CGGAG*CCATTTGCT*G3'，位于翻译起始位点处，sense-S-ODNs:5'CA*GCAAATGGG*CTCCGA*C3;c-myb基因ODN设计参见文献[7]，antisense-S-ODNs:5' GT*GCCGGGG*TCTTCGGG*C 3'，位于翻译起始位点处，sense-S-ODNs:5' GC*CCGAAGAC*CCCGGCA*C 3'，*标记的为硫代修饰的碱基，由上海生物工程公司合成，HPLC纯化。RPMI-1640为GIBCOLab产品。FITC标记的鼠抗人IgG：JACKSON公司产品。鼠抗人Myb单克隆抗体(McAb)：Sants Cruz生物技术公司产品。
1.2 U937细胞的培养及处理
U937细胞株由上海第二医科大学唐立军博士提供。采用96孔培养板，在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中置于37℃含5%CO2和95%空气的培养箱中培养，细胞密度为106个/孔，每2天换1次。
, 百拇医药
1.3 Northern blot
ODN探针采用随机引物，地高辛进行标记法制备。U937细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养处理后，总RNA提取采用异硫氰酸胍一步法，经RNA凝胶电泳，进行Northern blot分析。核酸杂交见Boehringer公司试剂盒说明书。
1.4 流式细胞计数仪分析蛋白表达
将先用不含胎牛血清RPMI-1640培养基换液的U937细胞分为三组：反义ODN组、正义ODN组和对照组，每组5孔，对照组只加培养基，处理组另加ODN。处理培养4h后，加胎牛血清至10%终浓度，继续培养48h再进行测定。细胞用70%的乙醇固定。用WT1/Myb单抗作为第1抗体，FITC标记的羊抗鼠抗体作为第2抗体。阴性对照组第1抗体用小鼠IgG，实验组分为：硫代反义ODN组、硫代正义ODN级。
, http://www.100md.com 1.5 统计学处理
检验结果用(
±s)表示，两组比较用t检验。统计显著性以P<0.05判断。2 结果2.1 U937细胞WT-1表达检测
结果显示WT-1基因ODN探针杂交阳性(见图1)；流式细胞仪分析显示其可产生较强特异荧光，以上二者说明该U937细胞有WT1蛋白表达。
A Northern分析显示WT-1 mRNA
B 流式细胞分析显示WT1蛋白
图1 U937细胞WT1基因表达分析
, 百拇医药
2.2 WT1基因硫代反义ODN对WT1蛋白和/或c-myb基因表达的影响
结果显示：5μmol/L WT1反义ODN处理的U937细胞WT1蛋白表达下降37%，10μmol/L AN-S-ODNs即可抑制其WT1蛋白87%；5μmol/L WT1反义ODN经处理后，c-myb mRNA水平上升不明显，10μmol/L AN-S-ODN处理后，Myb蛋白水平上升46%(P<0.01)，myb mRNA水平上升不明显。而<30μmol/L硫代正义ODNs抑制Myb蛋白表达(见表1和图2)。硫代反义/正义ODNs浓度大于30μmol/L时，表现有细胞毒性作用，在此未列。
表1 流式细胞分析WT1硫代ODN对U937细胞WT1、Myb蛋白表达的影响 (
±s) 组别WT1
, 百拇医药
Myb
对照组
3150±670
5740±850
5μmol/L
1980±320*
4470±980
反义ODN
10μmol/L
397±57*
8370±1150*
, 百拇医药
20μmol/L
278±73*
7397±1370*
正义ODN
20μmol/L
3540±730
5120±840
注：*与对照组比较P<0.01 蛋白水平以荧光强度表示，n=6
1为20μmol/L正义ODN，2、3、4和5分别为0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L反义ODN
, http://www.100md.com
图2 Northern分析WT1反义ODN
对U937细胞c-myb mRNA的影响
2.3 c-myb硫代反义ODN对Myb蛋白和/或WT1基因表达的影响
流式细胞分析显示5μmol/L和10μmol/L c-myb AN-S-ODNs可分别抑制其Myb蛋白表达39%和83%(与对照组比较P<0.01)，20μmol/L时Myb蛋白虽完全被抑制，但对WT1基因表达无影响：正义硫代c-myb ODNs对U937细胞Myb和WT1表达均无影响(与对照组比较P>0.05)，见表2和图3。
表2 流式细胞分析硫代反义c-myb ODN对U937细胞WT1、Myb蛋白表达的影响 (
±s) 组别, http://www.100md.com
WT1
Myb
对照组
3570±770
6340±1250
5μmol/L
3960±830
3870±1070*
反义ODN
10μmol/L
3280±760
1060±270*
, 百拇医药
20μmol/L
3370±810
530±160*
5μmol/L
3840±650
5780±1030
正义ODN
10μmol/L
2680±820
5230±1170
20μmol/L
3540±790
, 百拇医药
6530±1090
注：*与对照组比较P<0.01 蛋白水平以荧光强度表示，n=6
1、2、3和4分别为0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L
图3 Northern分析硫代反义c-myb ODN
对U937细胞WT1 mRNA表达影响
3 讨论
Myb属原癌基因，具有促进血细胞转化作用，从而导致各种白血病[9]。McCann[8]研究显示c-myb基因启动子含有一个Egr位点，该位点对其基因表达具有负性调节作用。而WT1能与该位点结合，从而抑制其启动子。为了研究WT1与C-myb基因的关系以及它们在白血病中的作用，作者应用反义核酸技术。虽然其被应用于临床尚有些问题有待解决，但在体外研究特异基因表达方面具有较肯定的作用。为了增加反义ODN的稳定性，作者采用了部分硫代修饰碱基。结果该实验清楚地显示了WT1基因硫代反义ODNs可以显著抑制U937细胞WT1 mRNA的翻译，并伴有Myb蛋白表达增高和细胞增殖，而c-myb硫代反义ODN可以显著抑制其蛋白表达和细胞增殖，但对WT1基因表达无明显影响。由以上可以推断出WT1有可能通过调查原癌基因c-myb表达而抑制细胞增殖，进一步证实WT1为肿瘤抑制基因[10]。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Rauscher FJ,Morris JF,Tournay OE,et al.Binding of the wilms tumor locus zinc finger protein to the EGR-1 consensus sequence.Science,1990:1259～1263
2 Haber DA,Park S,Maheswaran S,et al.WT1-mediated growth suppression of Wilms tumor cells expressing a WT1 splicing variant.Science,1993;262:2057
3 Werner H,Shn-Orr Z,Rauscher FJ,et al.Inhibition of cellular prolife ration by the Wilms tumor suppressor WT1 is associated with suppression of insulin-like growth factor I receptor gene epression.Mol Cell Biol,1995;15:3516
, 百拇医药
4 Englert C,Hou X,Maheswaran S,et al.WT1 suppresses synthesis of the epidermal growth factor receptor and induces apoptosis.EMBO J,1995;14:4662
5 Miwa H,Beran M,Saunders GF.Expression of the Wilms tumor gene (WT1) in human leukemias.Leukemia,1992;6:405
6 Yamagami T,Sugiyama H,Inoue K,et al.Growth inhition of human leukemic cells by WT1(Wilms tumorgene)antisense oligodexxyynucleotides;implications for the involvement of WT1 in leukmogenesis.Blood,1996:787～878
, http://www.100md.com
7 Anfossi G,Gewirtz AM,Calabretta B:An oligomer complementary to c-myb encoded mRNA inhibits proliferation of human myeloid leukemia cell lines.Proc Nat 1 Acad Sci USA,1989;86:3379
8 McCann S,Sullivan J,Guerre J,et al.Repression of the c-myb gene by WT1 protein in T and B cell lines.J Biol chem,1995;253:1550～1553
9 Mountz JD,Subler MA,et al.Regulation of c-myb oncogene expression in immature and mature murin tcells.Mol Immunol,1993;30:787～795
10 Tenen DG,Hromas R,Licht JD,et al.Transcription factors,normal myeloid development and leukemia.Blood,1997;90(2):489～519, http://www.100md.com