一氧化碳对大鼠肺动脉平滑肌细胞［Ca2+］、cAMP、cGMP的作用

http://www.100md.com 《第三军医大学学报》 2000年第5期

     作者：王关嵩 钱桂生 杨晓静

    单位：王关嵩(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；钱桂生(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；杨晓静(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)

    关键词：一氧化碳；平滑肌细胞；钙；cAMP；cGMP；肺动脉

    第三军医大学学报000504 提 要： 目的 观察低浓度一氧化碳(CO)对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的作用。方法 应用细胞培养，Lowry法测量蛋白质含量，Fura-2荧光指示剂测PASMC的胞内钙浓度([Ca²⁺])，放射免疫cAMP、cGMP药盒测cAMP、cGMP浓度。结果 ①缺氧组PASMC内质网扩张，胞浆内出现髓鞘样结构，线粒体肿胀、空泡化。低浓度CO组PASMC的损害减轻、仅线粒体稍肿大，部分内质网有扩张。②缺氧组PASMC[Ca²⁺]明显升高(P<0.01)，低浓度CO组PASMC[Ca²⁺]接近常氧组。③缺氧组PASMC的cAMP均有升高趋势，cAMP先降后升，cGMP缓慢升高。低浓度CO组PASMC的cGMP虽比常氧组有所升高，但无明显差异(P>0.05)。缺氧及复合CO作用下cAMP均呈上升趋势，和常氧组比差异显著(P<0.01)。结论 缺氧可能通过第二信使系统促进PASMC的增生，而低浓度CO可以抑制缺氧的作用，至少部分可能是通过[Ca²⁺]-cGMP系统实现的。

    中图法分类号： R322.121;R914.3 文献标识码： A

    文章编号：1000-5404(2000)05-0417-03

    Effects of carbon monoxide on [Ca²⁺], cAMP, cGMP in pulmonary arterial smooth muscle cells of rats in vitro

    WANG Guan-song, QIAN Gui-sheng, YANG Xiao-jing

    (Institute of Respiratory Disease, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037,China)

    Abstract： Objective To study the effects of carbon monoxide (CO) on pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMCs) of rats in vitro. Methods The PASMCs of rats were cultured in hypoxia, combined hypoxia and CO and in normal O₂ condition. Protein content was measured with Lowry′s method, intracellular [Ca²⁺] with Fura-2 fluorescent marker and the level of cAMP and cGMP with radioimmunoassay. Results In the PASMCs of the hypoxia group, there were dilatation of endoplasmic reticulum, swelling of mitochondria, myelin figures in the cells and vacuolization. When PASMCs were exposed to hypoxia and low concentration of CO, the damages were ameliorated showing only mild swelling of mitochondria and partial dilatation of endoplasmic reticulum.Intracellular [Ca²⁺] was significantly elevated in the PASMCs of the hypoxia group but was nearly normal in cells exposed to hypoxia and low cencentration of CO. The changes of cAMP and cGMP were different in the hypoxia group, cAMP showed a decrease in the beginning and increased later but cGMP kept on increasing gradually. After exposure to hypoxia and CO, cGMP showed a little increase but its level was not significantly different from the normal (P>0.05); cAMP was markedly increased as compared with the normal (P>0.05). Conclusion Hypoxia can promote the proliferation of PASMCs through the second messenger system and CO in low concentration antagonizes the action of hypoxia partly through the mediation of [Ca²⁺]-cGMP system.

    Key words： carbon monoxide;smooth muscle cell;calcium; cAMP;cGMP;pulmonary arterial

    目前慢性阻塞性肺病仍然是临床常见严重疾病，其病理进程是肺动脉等血管壁结构改变，动脉中膜肌层增厚，平滑肌细胞由收缩型改变为合成型，肥大增殖。既往已有用一氧化氮(Nitric oxide,NO)来治疗肺动脉高压和一些疾病，显示出较好的应用前景^[1，2]。现在人们又注意到一氧化碳(Carbon monoxide,CO)作为新的血管舒张因子，具有与NO相似的性质，但没有对肺组织的直接和间接毒副作用。本实验观察低浓度CO对缺氧条件下大鼠肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC)的作用。

    1 材料与方法

    1.1 主要材料和试剂

    M199(Gibco,USA)，Trypsin(Difico),EGTA(Sigma)，Fura-2和Fura-2/AM(中国科学院药物研究所)，cAMP、cGMP(上海中医学院)，1%O₂+5%CO₂+N₂气体及1%O₂+3%CO+N₂混合气体(重庆仪表九厂)，CO自动监测报警仪(中国煤炭科学院重庆分院)。

    1.2 PASMC培养及鉴定

    Wistar大鼠6只(本校实验动物中心供应，有合格证号)，颈动脉放血处死后，剥取肺主动，采用贴块法^[3]培养PASMC并用α-actin的免疫组化和电镜鉴定。

    1.3 分组低浓度CO处理

    应用本研究所建立的低浓度CO吸入小室、缺氧小室对各组细胞进行相应处理，常氧组放二氧化碳孵箱内作为对照。分为常氧组(N)、缺氧组(H)及低浓度CO复合缺氧组(CO+H)。

    1.4 生长特性和蛋白质含量测定

    选择传第4代生长良好的PASMC，胰蛋白酶消化后分散成1×10⁴个/cm²，接种于6孔板，随机分N、H、CO+H 3组培养，每组6板。每日定时各取2孔细胞观察生长情况，然后消化分散计数，用改良Lowry法测定蛋白质含量。

    1.5 胞内[Ca²⁺]测定

    取长满层的细胞，Hanks液冲洗3次，再用EDTA液温育6min最后用细胞培养液M199制成细胞悬液10⁶个/ml，将Fura-2/AM(5 mmol/L)加入。37°C温育45 min。离心，弃上清，将细胞悬浮于D′Hank液(内含1 mmol/L EDTA)中测定。激发波长340 nm和380 nm，光栅5 nm，发射波长500 nm，光栅10 nm。自身荧光作对照，分别加入1% Triton和20 mmol/EDTA测量大和最小荧光强度。

    1.6 cAMP、cGMP含量测定

    三组均先通入21%O₂ 15 min，然后H和CO+H组再通入N₂，于1、6、15 min 3个时相点取样。取样时先弃去培养液，再马上加入1 ml冰冷的0.24 mol/L高氯酸，刮取收集细胞，冰浴下超声破碎，离心取上清以3 mol/L KOH中和至pH值6.3左右，离心除去高氯酸钾沉淀，-20°C贮存备测。cGMP、cAMP测定按上海中医学院药盒说明进行。

    1.7 统计学处理

    采用多因素或单因素方差分析，结果用±s表示，并做方差保护显著性检验。

    2 结果

    2.1 低浓度CO对PASMC生长的影响

    常氧条件下PASMC细胞呈长梭型，部分区域可重叠生长达多层，部分区域较稀疏，有典型“峰-谷”样长势；电镜下可见细胞胞浆内含丰富的肌丝和致密斑，而细胞器较少。缺氧条件下PASMC细胞体积肥大，分布比较均匀；电镜下可见胞核较大，胞浆内含丰富的粗面内质网、线粒体等细胞器，而且线粒体固缩、空泡化、内质网扩张，胞浆内出现髓鞘样结构，核内可见膜性结构。低浓度CO处理PASMC，则细胞仍出现较明显的“峰-谷”长势，胞浆内有少量细胞器，未见细胞器有明显改变，但胞浆里也出现髓鞘样结构。缺氧条件下PASMC生长较快，于5天达最大数量，常氧和低浓度CO条件下PASMC均于第7～8天达高峰。但是缺氧条件下蛋白质的含量却比其它两种条件下要少一些，见图1、2。

    图1 低浓度CO对平滑肌细胞生长的影响

    Fig 1 The effect of low concentration CO on

    the growth of PASMC

    图2 低浓度CO对平滑肌细胞蛋白质含量的影响

    Fig 2 The effect of low concentration CO on the

    protein content of PASMC

    2.2 低浓度CO对PASMC内[Ca²⁺]的效应

    缺氧1min时PASMC的[Ca²⁺]开始升高(P<0.01)，随着缺氧时间的延长，[Ca²⁺]持续升高至475 mmol/L。低浓度吸入CO 1 min时[Ca²⁺]未见变化。5 min时升高，其后虽有升高，但相差均不显著，见表1。

    表1 CO对平滑肌细胞[Ca²⁺]的影响(C_B/mmol^.L^-1,±s)

    Tab 1 The effect of CO on [Ca²⁺]in PASMC

    (C_B/mmol^.L^-1,±s)

    Base

    1 min

    5 min

    10 min

    15 min

    H

    101±13.5

    267±21.2^*

    342±20.3^*

    408±15.4^*

    475±18.6^*

    CO+H

    101±13.5

    102±15.7

    119±27.8

    125±32.1

    128±17.3

    *:P<0.01 vs base value

    2.3 低浓度CO对PASMC的cAMP、cGMP含量的影响

    缺氧1 min PASMC的cAMP含量即明显升高(P<0.05)，5 min时更高(P<0.01)，10 min时有降低，但仍高于基础水平(P<0.05)；缺氧1 min PASMC的cGMP变化不明显，5 min时升高(P<0.05)，10 min时更高(P<0.01)。低浓度CO处理PASMC cAMP变化不明显。cGMP明显降低，见表2、3。

    表2 CO对平滑肌细胞的cAMP含量的影响(mB/pmol^.mg^-1)

    Tab 2 The effect of CO on cAMP concentration

    in PASMC(mB/pmol^.mg^-1)

    Base

    1 min

    5 min

    10 min

    H

    1.11±0.32

    1.67±0.15^*

    1.98±0.26^**

    1.55±0.25

    CO+H

    1.33±0.28

    1.78±0.37^*

    2.17±0.44^*

    1.85±0.37^*

    *:P<0.05，**：P<0.01 vs base value

    表3 CO对平滑肌细胞cGMP含量的影响(mB/pmol^.mg^-1)

    Tab 3 The effect of CO on cGMP Concentration

    in PASMC(mB/pmol^.mg^-1)

    Base

    1 min

    5 min

    10 min

    H

    0.87±0.13

    0.88±0.09

    1.02±0.23^*

    1.23±0.19^**

    CO+H

    0.89±0.21

    0.84±0.15

    0.89±0.19

    0.94±0.25

    *:P<0.05，**：P<0.01 vs base value

    3 讨论

    目前，有研究指出对大动物的平滑肌细胞，缺氧可直接发挥作用^[4]，本实验证实对小动物大鼠(中度缺氧敏感性的动物)缺氧可以直接发挥作用。缺氧可能通过激活PASMC、释放血小板源生长因子和内皮素等^[5]来直接促进PASMC的增殖。此外，本实验还证明在缺氧条件下PASMC里的[Ca²⁺]、cAMP、cGMP均呈上升趋势，说明急性缺氧还通过第二信使系统发挥作用。

    CO在生物体内的作用方式和NO相似，主要是通过激活可溶性鸟苷酸环化酶(Soluble guanglyl cyclase,SGC)，调节cGMP的合成，而cGMP在许多组织特别是平滑肌中起着重要的调节作用。我们的研究发现，低浓度CO在缺氧条件下处理PASMC，其生长状况接近常氧情况，具有对抗缺氧的效应。但是，实验表明，CO可以使急性缺氧导致的[Ca²⁺]和cGMP的升高趋势降低，cGMP含量升高，cAMP升高影响不明显。所以，这种对抗效应只能是部分的。低浓度CO通过第二信使系统只能部分地调节缺氧的效应。Verma等^[6]报道，CO在细胞内也能激活SGC，进而调节cGMP合成。我们的实验证明，外源性低CO既可以通过调节PASMC内cGMP的水平，也可以通过调节细胞内[Ca²⁺]水平来对PASMC发挥作用。

    基金项目：国家自然科学基金资助项目(39700057)

    作者简介：王关嵩(1967-)，男，河南省平顶山市人，博士研究生，讲师，主要从事慢性阻塞性肺病发病机制及防治方面的研究，发表论文10篇。电话：(023)68755320

    参考文献：

    [1] Hayward C S, Rogers P, Keogh A M, et al. Inhaled nitric oxide in cardiac failure:vascular versus vetricular effects[J]. J Cardiovas Pharmacol,1996,27(1):80-85.

    [2] Hamid Q, Springall D R, Riveros M V. Induction of nitric oxide synthase in asthma[J]. Lancet,1993,342(3):1 510-1 516.

    [3] 王关嵩，杨晓静，钱桂生，等.大鼠血管平滑肌细胞分离培养的探讨[J].第三军医大学学报，1998，20(4)：348-350.

    [4] 罗 兰，蔡英年，李世强，等.缺氧对新生小牛肺血管平滑肌细胞增殖的影响及764-3的抑制作用[J].中国应用生理学杂志，1993，9(2)：205-209.

    [5] Kourembrane S P, Marsder A, McQuillan L P, et al. Hypoxia induces endothelin gene expression and secrection in cultured human endothelium[J]. J Clin Invest,1991,88(2):1 054-1 057.

    [6] Verma A, Hirsch D J, Glatt C E, et al. Carbon monoxide: a putative neural messenger[J]. Science,1993,259(5 093):381-384.

    收稿日期：1999-11-15；修回日期：2000-03-06

    百拇医药网 http://www.100md.com/html/analecta/2000/05/01/15/173.htm