从母血中分离胎儿细胞及产前诊断应用
作者：廖云星 李名根 陶寻明
单位：廖云星(中国人民解放军第533医院，云南 昆明 650224)；李名根(中国人民解放军第533医院，云南 昆明 650224)；陶寻明(中国人民解放军第533医院，云南 昆明 650224)
关键词：孕母外周血；胎儿细胞；产前诊断
现代诊断与治疗000508 摘要：当前国内外正在积极研究一种非侵袭性产前诊断方法--从母体 外周血分离胎儿细胞进行产前诊断。孕母外周血中存在微量胎儿细胞。采用各种先进的分离 富集方法，可获得胎儿细胞，通过对这些细胞进行分析，即可获得产前诊断信息。该技术仍 处在研究阶段，尚存在一些问题需要解决，故目前还不能广泛应用于临床，但它的应用前景 非常光明。
中图分类号：R714.55 文献标识码：A 文章编号：1001-8174(2000)05-0274-03
, 百拇医药
Isolation of Fetal Cells from Maternal Blood and Its Application in Pre natal
Diagnosis
LIAO Yun-xing，LI Ming-gen，TAO Xun-ming
(The 533th Hospital of PLA,Kunming 650224,China)
Abstract:In recent years,considerable progress has been achieved in nonivasive prenatal diagnosis using fetal cells isolated from maternal blood .Many kinds of fetal cells have been found in maternal blood,but they are often present in very small numbers.Fetal cells can be isolated and enriched from mate rnal blood by many advanced methods.Fetal chromosomal abnormalities,fetal sex,fe tal RHD blood type and so on can be detected on isolated fetal cells.In current ,there are many unanswered problems about this technique,but the outlook for non ivasive diagnosis in the future is optimistic.
, 百拇医药
Key words:Maternal blood;Fetal cells;Prenatal diagnosis
及时准确地进行产前诊断是确保人口素质的重 要措施。目前常规使用的方法有：羊水细胞法、绒毛细胞法、胎儿脐带血法及胎儿皮肤法等 ，这些方法诊断的准确性都相当高，但都属有创性操作，均有伤及胎儿或干扰胎儿健康发育 的可能[1]。为消除这一风险，研究者们正积极致力于无创性产前诊断技术的研究 ，即从母体外周血分离胎儿细胞进行产前诊断。
1 母血中存在胎儿细胞
早在1893年，Schmol[2]就提出死于子痫的孕妇肺循环中存在胚胎滋养叶 细胞。该观点被其他研究者所证实[1]，1961年Attwood通过对220例死于妊娠期妇 女的肺切片观察，在96例中获得了合胞体滋养叶细胞的形态学证据；另外Walknows于1969年 报道了在21例孕妇人工培养淋巴细胞中观察到46，XY核型，结果其中有19例生产的是男婴， 证明孕妇血中存在胎儿淋巴细胞。随着分子生物学技术及细胞分离技术的提高，人们又相继 从孕母血中分离到其它胎儿细胞[3]。综合目前文献，孕母血中至少存在5种胎儿细 胞：(1)滋养叶细胞及类滋养叶细胞；(2)淋巴细胞；(3)粒细胞；(4)有核红细胞(NRBC)；(5 )血小板。除血小板无细胞核外，其它四类细胞均可用于产前诊断。
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2 胎儿细胞在母血中的数量
胎儿细胞在母血中的数量极少。在大部分孕妇血中，每105～106个有核细胞中 才含有1个胎儿有核细胞[4]，甚至低至1/109[5]。Price等[4]研 究发现在20ml孕母外周血中约有200～2000个胎儿NRBC，即在80000～800000个母体有核细胞 中才有1个NRBC。Hamada等[6]用荧光原位杂交技术(FISH)结合Y染色体探针研究认 为胎儿细胞含量可达1/104。
胎儿细胞在母血中的含量不是恒定的，存在个体差异，且不同妊娠期含量不同，总体趋势是 随着妊娠进展含量增加[6]。另外还有其它因素也会影响孕母血中胎儿细胞的含量 染色体的细胞，其中包括那位27年前生产过的妇女，这些细胞主要是CD34+CD 38+的胎儿造血干细胞。另有人报道在生过男胎的妇女血中找到男性淋巴细胞，持 续时间达1～5年[1]。还有研究者认为胎儿细胞在产后母血中仅存在几个月[1 4]。而Lo等[2]用PCR扩增和Y染色体探针技术却没能在产后母血中找到有胎儿细 胞存在的证据。
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胎儿细胞在产后母血中滞留将会影响用孕母血中的细胞进行产前诊断结果的准确性。因为从 理论上讲，从母血中分离到的胎儿细胞可能是前次妊娠留下的，故可能会引起误诊[1 ]。Lo等[2]认为胎儿细胞在产后母血中存留并不是个大问题，它只存在少数妇 女中，而且数量极微，用单次PCR方法很难发现，必须用双倍PCR或Net-PCR方法才能测出， 所以对诊断结果影响不大，几乎可以忽略不计。
4 胎儿细胞的分离富集
由于母血中的胎儿细胞极少，尽管有高度敏感的分子生物学诊断技术，但诊断的准 确性仍大受影响。为解决这一问题，自70年代以来，研究者们便积极致力于从母血中分离富 集胎儿细胞，并取得不少进展[1]。常用的方法有荧光激活细胞分离法(FACS)、免 疫磁珠法、磁激活细胞分离法(MACS)、抗体结合柱法等[15]。分离胎儿细胞的方法 很多，但关键都是用特异性抗体去识别胎儿细胞。当前所用的特异性抗体很多，不同胎儿细 胞所用抗体亦不同。
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4.1 滋养叶细胞 滋养叶细胞是最早被证实存在于母血中，且由于其独特的形态学特征， 理论上应很容易分离，但实际上却不然。主要是由于母体能迅速清除进入其肺循环的滋养叶 细胞，而且不容易得到能与滋养叶细胞表面抗原特异性结合的抗体。早先人们常用的H315单 克隆抗体，被证明为特异性不高，分离出来的大部分是母体细胞[16]。为找到特异 性滋养叶细胞的单克隆抗体，研究者们为此作出了不懈努力。Hawes等[16]应用制 备的三种单克隆抗体FDO?468、FDO?161G和FDO?101X从12/14例正常孕妇外周血中成功地 分离出胎儿滋养叶细胞。Yoshiki等[17]则采用杂交瘤技术制备出7种针对滋养叶细 胞表面抗原的特异性抗体：BW-108、BW-110、BW-123、BW-124、HP-15、HP-16及HP- 17，实验证明这些抗体特异性非常高。Latham等[18]发现一种抗人胎盘催乳素(HPL )的单克隆抗体FDO?202N，在模型系统中研究发现能非常有效地分离出滋养叶细胞。还有其 他研究者亦制备出多种特异性抗体用于分离滋养叶细胞[2]。但是应用胚胎滋养叶 细胞进行产前诊断存在两个缺点：一是其多核特性，妨碍了FISH技术在诊断上的应用 ；二 是胎盘细胞嵌合体现象，人们己认识到这一点，大约有1%的标本其滋养叶细胞核型不同于胎 儿细胞，因而采用滋养叶细胞作产前诊断会有可能误诊[1]。这在一定程度上阻碍 了胚胎滋养叶细胞广泛应用于产前诊断。
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4.2 淋巴细胞和粒细胞 淋巴细胞和粒细胞研究得相对较迟，1970年后才陆续有人涉足 [1]。且由于胎儿与母体淋巴、粒细胞表面抗原难以区分，不易制备出只针对胎儿细 胞的特异性抗体，故分离困难，应用受限；再加上胎儿淋巴细胞在母血中可以滞留较长时间 ，产前诊断结果可能不反映当次妊娠而误诊。当前从母血中分离胎儿淋巴细胞和粒细胞进行 产前诊断的研究并不多。
4.3 有核红细胞 胎儿有核红细胞(NRBC)是当前研究最多，且被认为最有应用前途的一类 细胞。因为：(1)胚胎NRBC便于分离；(2)在早期胎儿血中含量丰富，而在母体外周血中含量 极少，有研究发现在妊娠11周胎儿血中NRBC占红细胞总数的10%，到妊娠19周时己降至1.5% ，而在成人血中比例更低[2]；(3)胎儿NRBC生命周期较短，在产后母血中基本不会 滞留，故应用于产前诊断相对较准确。
NRBC的标记物很多，有利于细胞分离[1]。Bianchi等[3]在1990年首先应 用抗CD71(转铁蛋白受体)抗体，经流式细胞分离法成功地分出胎儿NRBC。其后多位研 究者亦应用单克隆抗体分离出胎儿NRBC[4，11，12]。最常见有效的单克隆抗体主 要有抗CD71抗体、抗C36(Thrombospondin受体)抗体、抗细胞膜磷脂糖A(GPA) 抗体。对于这三种抗体究竟哪种最有效，研究者们尚未达成一致。Bianchi等[19] 研究发现用抗CD71抗体分离的胎儿有核红细胞进行性别测定，其准确率为57%，抗CD 36抗体为88%，抗GPA抗体与抗CD71抗体或抗CD36抗体联用时均为100%， 而抗GPA抗体单独应用时其准确率亦达100%，所以他们认为抗GPA抗体是分离胎儿NRBC是最有 效的抗体。而Simpson等[20]研究发现用抗GPA抗体分离胎儿细胞时普遍出现凝集现 象，实际应用效果并不佳。Lewis[21]亦证实用抗GPA抗体分离母血中胎儿NRBC时， 易引起凝集反应，由于有核细胞与无核细胞凝集在一起，引起光的折射及荧光性质发生改变 ，从而严重干扰了胎儿NRBC的分离，故不提倡用抗 GPA抗体分离NRBC，而仍使用抗CD71 抗体。为提高分离特异性，可同时加用抗CD45(白细胞共同抗原)抗体去除有核细胞 中的白细胞(淋巴细胞、粒细胞)，或者加用血红蛋白γ链抗体筛选[21]。根据胎 儿NRBC内含有特异性血红蛋白珠蛋白肽链，有不少研究者己着手从这方面进行胎儿NRBC的分 离富集。Bianchi[3]采用Kleihauer-Betke技术对HbF(胎儿血红蛋白，α2γ 2)进行染色而分离到胎儿NRBC。De Maria等[22]在应用细胞表面特异性抗体分离的 基础上，再结合抗γ珠蛋白肽链的单克隆抗体细胞内染色法进一步分离NRBC，在对一模型系 统(男胎脐血细胞和未怀孕成年女性外周血的单核细胞混合物)分离中，结果发现胎儿细胞回 收率达39%～100%，胎儿细胞纯度达59%～73%，远远高于他们自己先前单用细胞表面抗体分 离的纯度(0.01%～4.8%)；进一步用FISH技术证实，抗γ肽链阳性细胞为胎儿细胞准确率达 ：男胎儿细胞83%～100%，女胎儿细胞82%～100%。Yokobata等人[1]曾筛选出抗胎 儿特有的血红蛋白ξ肽链的单克隆抗体，并认为该抗体对分离NRBC大有帮助，但未见该抗体 的应用报道，可能跟ξ肽链在胎儿血中存在时间过短有关(ξ肽链在妊娠第8周己基本消失) 。
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5 胎儿细胞分离所面临的问题
尽管有众多各式各样的分离方法，层出不穷的特异性单克隆抗体，但目前胎儿细胞 分离所面临的最大问题还是母体细胞的混杂。这主要是由于目前所制备的众多抗体中还没有 一个是纯粹特异性的，即特异到只结合胎儿细胞而不结合母体细胞。如分离NRBC常用的CD 71抗体，它不仅结合NRBC，还结合母体部分激活淋细胞、网织红细胞等；即便是分离富 集的NRBC中，大部分仍是来自母体[23]。至于前面提到的特异性很高的γ肽链抗体 ，在实际应用中也不一定完全有效，因为在成人血红蛋白中仍存在1%左右的HbF(α2γ2 )。要解决母体细胞混杂问题还需要做大量工作，首先须加强对胎儿细胞性质研究，包括特 异性抗原、形态学特征及独特的物理化学特性，制备出高特异性抗体；其次是多抗体联合应 用；三是加用微控制分离技术。Takabayashi等[24]表示亦能通过微控制技术分离 得到单个NRBC，Cheung等[25]亦报道了从母体外周血中用磁化细胞法分离NRBC，再 用显微切割技术获得纯的NRBC。
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6 母血中分离的胎儿细胞在诊断上的应用
综合目前的报道，分离的胎儿细胞主要用于性别测定，Rh阴性孕母的胎儿Rh基因测 定，胎儿非整倍体检测及一些单基因遗传病的诊断(如β地中海贫血、Lepore-Boston血红 蛋白病、α及β血红蛋白病、囊性纤维变性、杜兴氏肌营养不良症以及与X染色体连锁的脆 性精神发育迟缓症等[1]。当前应用分离的胎儿细胞做产前诊断最有意义的当属Rh 阴性母亲的胎儿Rh基因测定，因为这有利于防止危害较大，且发病率不低(1.06%)的Rh血型 不合胎儿溶血症。1993年Lo等[26]用分离的胎儿细胞成功地鉴定了Rh阴性母亲的胎 儿Rh状态；Geifman-Holtzman等[27]应用流式细胞分离法分出的CD34+ GPA+胎儿NRBC对Rh阴性孕母的胎儿进行了Rh基因测定，结果阳性预告率达100%，阴性预告 率达67%。其次是胎儿性别测定[6，10]，因母体不含Y染色体，所以胎儿细胞不纯 对此无明显影响。另外就是胎儿非整倍体检测[1，12]，多采用FISH法，己诊断出 的非整倍体有：21三倍体，18三倍体，47、XYY核型，47、XXY核型等。至于单基因病的诊断 ，由于混杂细胞的影响。应用受限，只有 trong>廖云星(1971-)，男，江西南丰人，主治医师，硕 士，主要从事儿科血液与遗传研究。
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参考文献：
[1]Bianchi DW.Prenatal diagnosis by analysis of fetal cell in maternal blood[J].J Pediatr,1995，127(6)：847-856.
[2]Lo YMD.Noninvasive prenatal diagnosis using fetal cell in maternal blood[J].J Clin Pathol,1994,47:1060-1065.
[3]Bianchi DW,Flint AF,Pizzimenti MF,et al.Isolation of fetal DNA from nucleated erythrocyte in maternal blood[J].Proc Natl Acad Sci USA,1990，87：32 79-3283.
, http://www.100md.com
[4]Price JO,Elias S,Wachtel SS,et al.Prenatal diagnosis using fetal cel ls isolated from maternal blood by multiparameter flow cytometry[J].Am J Obste t Gynecol,1991，165：1731-1737.
[5]Ganshirt-Ahlert D,Pohlschmidt M,Gal A,et al.Ratio of fetal to mater nal DNA is less than 1 in 5000 at different gestational age in maternal blood[J ].Clin Genet,1990，38：38-43.
[6]Hamada H,Ariami T,Kubo T,et al.Fetal nucleated cells in maternal per ipheral blood:frequency and relationship to gestation age[J].Hum Genet,1993，9 1：427-432.
, http://www.100md.com
[7]Kuhlmann RS,Werner AL,Abramowicz J,et al.Placental histology in fetu ses between 18 and 23 weeks gestation with abnormal karyotype[J].Am J Obstet G ynecol,1990，163：1264-1270.
[8]Chua S,Wilkins T,Sargent I,et al.Trophoblast deportation in pre-ecl amptic pregnancy[J].Br J Obstet Gynaecol，1991，98：973-979.
[9]Lo YMD,Noakes L,Bowell PJ,et al.Detection of fetal RhD sequence from peripheral blood of sensitised RhD-negative pregnant women[J].Br J Haematol, 1994，87：658-660.
, 百拇医药
[10]Thomas MR,Williamson S,Craft I,et al.Y chromosome sequence DNA ampl ifled from peripheral blood of women in early pregnancy[J].Lancet,1994，343：4 13-414.
[11]Bianchi DW,Stewaty JE,Garber MF,et al.Possible effect of gestationa l age on the detection of fetal nucleated erythrocyte in maternal blood[J].Pre nat Diagn，1991，11：523-528.
[12]Ganshirt-Ahlet D,Borjesson-Stoll R,Burschyk M,et al.Detection of fetal trisomies 21 and 18 from maternal blood using triple gradient and magnetic cell sorting[J].Am J Reprod Immunol,1993，30：193-200.
, 百拇医药
[13]Bianchi DW,Zickwolf GK,Weil GJ,et al.Male fetal progenitor cells pe rsist in maenal blood for as long as 27 years postpartum[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996，93(2)：705-708.
[14]Hamada H,Arinami T,Hamagachi H,et al.Fetal nucleated cells in mater nal peripheral blood after delivery[J].Am J Obstet Gynecol,1994，170：1188-11 93.
[15] Bianchi DW,Klinger KW,Vadnais TJ,et al.Development of model system to compare cell separation methods for isolation of fetal cells from maternal b lood[J].Prenat Diagn,1996，16(4)：289-298.
, 百拇医药
[16]Hawes CS,Suskin HA,Petropoulos A,et al.A morphologic study of troph oblast isolated from peripheral blood of pregnant women[J].Am J Obstet Gynecol ,1994,170:1297-1300.
[17]Yoshiki T,Yang YY,Lee Y,et al.Generation and characterization of mo noclonal antibodies specific to surface antigens of human trophoblast cells[J] .Am J Reprod Immunol,1995，34(3)：148-155.
[18]Latham SE,Suskin HA,Petropoulos A,et al.A monocoonal antibody to hu man placental lactogen hormone facilitates isolation of fetal cells from materna l blood in a model system[J].Prenat Diagn,1996，16(9)：813-821.
, 百拇医药
[19]Bianchi DW,Zickwolf GK,Yih MC,et al.Erythroid-specific antibodies enhance detection of fetal nucleated erythrocytes in maternal blood[J].Prenat Diagn，1993，3：293-300.
[20]Simposon JL,Lewis DE,Bischoff FZ,et al.Isolating fetal nucleated re d blood cells from maternal blood:the Baylor experience--1995[J].Prenat Diag n,1995，15(10)：907-912.
[21]Lewis DE,Schober W,Murrell S,et al.Rare event selection of fetal nu cleated ertythrocytes in maternal blood by flow cytometry[J].Cytometry,1996,23 (3):218-227
, http://www.100md.com
[22]De Maria MA,Zheng YL,Zhen D,et al.Improved fetal nucleated erythroc yte sorting purity using intracellular antifetal hemoglobin and Hoechst 33342[J ].Cytometry,1996,25(1):37-45.
[23]Slunga-Tallberg A,El-Rifai W,Keinanen M,et al.Maternal origin o f nucleated erythrocytes in peripheral venus blood of pregnant women[J].Hum Ge net,1995,96:53-57.
[24]Takabayashi H,Kuwabra S,Ukita T,et al.Development of noninvasive fetal DNA diagnosis from maternal blood[J].Prenat Diagn,1995,15:74-77.
, http://www.100md.com
[25]Cheung MC,Goldberg JD,Kan YM.Prenatal diagnosis of sickle cell anaemia and thalassaemia by analysis of fetal cells in matenal blood[J].Nat Genet,1996,14 (3):264-268.
[26]Lo MD,Bowel PJ,Selinger M,et al.Prenatal determination of fetal RhD status by analysis of peripheral blood of Rhesus negative mothers[J].Lancet,1993,34: 114-1148.
[27]Geifman-Holtzman O,Bernstein IM,Berry SM,et al.Fetal RhD genotyping in fe tal cells flow sorted from maternal blood[J].Am J Obstet Gynecol,1996,174(3):8 18-822.
, 百拇医药
[28]Hawes CS,Suskin HA,Kalionis B,et al.Detection of paternally inherited muta tions for β-thalassemia in trophoblast isolated form peripheral maternal blood [J].Ann NY Acad Sci,1994,.731:181-185.
[29]Camaschella C,Alfarano A,Gottardi E,et al.Prenatal diagnosis of fetal hemo globin Lepore-Boston disease on maternal peripheral blood[J].Blood,1990,75:21 01-2106.
收稿日期：1999-11-03, 百拇医药
单位：廖云星(中国人民解放军第533医院，云南 昆明 650224)；李名根(中国人民解放军第533医院，云南 昆明 650224)；陶寻明(中国人民解放军第533医院，云南 昆明 650224)
关键词：孕母外周血；胎儿细胞；产前诊断
现代诊断与治疗000508 摘要：当前国内外正在积极研究一种非侵袭性产前诊断方法--从母体 外周血分离胎儿细胞进行产前诊断。孕母外周血中存在微量胎儿细胞。采用各种先进的分离 富集方法，可获得胎儿细胞，通过对这些细胞进行分析，即可获得产前诊断信息。该技术仍 处在研究阶段，尚存在一些问题需要解决，故目前还不能广泛应用于临床，但它的应用前景 非常光明。
中图分类号：R714.55 文献标识码：A 文章编号：1001-8174(2000)05-0274-03
, 百拇医药
Isolation of Fetal Cells from Maternal Blood and Its Application in Pre natal
Diagnosis
LIAO Yun-xing，LI Ming-gen，TAO Xun-ming
(The 533th Hospital of PLA,Kunming 650224,China)
Abstract:In recent years,considerable progress has been achieved in nonivasive prenatal diagnosis using fetal cells isolated from maternal blood .Many kinds of fetal cells have been found in maternal blood,but they are often present in very small numbers.Fetal cells can be isolated and enriched from mate rnal blood by many advanced methods.Fetal chromosomal abnormalities,fetal sex,fe tal RHD blood type and so on can be detected on isolated fetal cells.In current ,there are many unanswered problems about this technique,but the outlook for non ivasive diagnosis in the future is optimistic.
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Key words:Maternal blood;Fetal cells;Prenatal diagnosis
及时准确地进行产前诊断是确保人口素质的重 要措施。目前常规使用的方法有：羊水细胞法、绒毛细胞法、胎儿脐带血法及胎儿皮肤法等 ，这些方法诊断的准确性都相当高，但都属有创性操作，均有伤及胎儿或干扰胎儿健康发育 的可能[1]。为消除这一风险，研究者们正积极致力于无创性产前诊断技术的研究 ，即从母体外周血分离胎儿细胞进行产前诊断。
1 母血中存在胎儿细胞
早在1893年，Schmol[2]就提出死于子痫的孕妇肺循环中存在胚胎滋养叶 细胞。该观点被其他研究者所证实[1]，1961年Attwood通过对220例死于妊娠期妇 女的肺切片观察，在96例中获得了合胞体滋养叶细胞的形态学证据；另外Walknows于1969年 报道了在21例孕妇人工培养淋巴细胞中观察到46，XY核型，结果其中有19例生产的是男婴， 证明孕妇血中存在胎儿淋巴细胞。随着分子生物学技术及细胞分离技术的提高，人们又相继 从孕母血中分离到其它胎儿细胞[3]。综合目前文献，孕母血中至少存在5种胎儿细 胞：(1)滋养叶细胞及类滋养叶细胞；(2)淋巴细胞；(3)粒细胞；(4)有核红细胞(NRBC)；(5 )血小板。除血小板无细胞核外，其它四类细胞均可用于产前诊断。
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2 胎儿细胞在母血中的数量
胎儿细胞在母血中的数量极少。在大部分孕妇血中，每105～106个有核细胞中 才含有1个胎儿有核细胞[4]，甚至低至1/109[5]。Price等[4]研 究发现在20ml孕母外周血中约有200～2000个胎儿NRBC，即在80000～800000个母体有核细胞 中才有1个NRBC。Hamada等[6]用荧光原位杂交技术(FISH)结合Y染色体探针研究认 为胎儿细胞含量可达1/104。
胎儿细胞在母血中的含量不是恒定的，存在个体差异，且不同妊娠期含量不同，总体趋势是 随着妊娠进展含量增加[6]。另外还有其它因素也会影响孕母血中胎儿细胞的含量 染色体的细胞，其中包括那位27年前生产过的妇女，这些细胞主要是CD34+CD 38+的胎儿造血干细胞。另有人报道在生过男胎的妇女血中找到男性淋巴细胞，持 续时间达1～5年[1]。还有研究者认为胎儿细胞在产后母血中仅存在几个月[1 4]。而Lo等[2]用PCR扩增和Y染色体探针技术却没能在产后母血中找到有胎儿细 胞存在的证据。
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胎儿细胞在产后母血中滞留将会影响用孕母血中的细胞进行产前诊断结果的准确性。因为从 理论上讲，从母血中分离到的胎儿细胞可能是前次妊娠留下的，故可能会引起误诊[1 ]。Lo等[2]认为胎儿细胞在产后母血中存留并不是个大问题，它只存在少数妇 女中，而且数量极微，用单次PCR方法很难发现，必须用双倍PCR或Net-PCR方法才能测出， 所以对诊断结果影响不大，几乎可以忽略不计。
4 胎儿细胞的分离富集
由于母血中的胎儿细胞极少，尽管有高度敏感的分子生物学诊断技术，但诊断的准 确性仍大受影响。为解决这一问题，自70年代以来，研究者们便积极致力于从母血中分离富 集胎儿细胞，并取得不少进展[1]。常用的方法有荧光激活细胞分离法(FACS)、免 疫磁珠法、磁激活细胞分离法(MACS)、抗体结合柱法等[15]。分离胎儿细胞的方法 很多，但关键都是用特异性抗体去识别胎儿细胞。当前所用的特异性抗体很多，不同胎儿细 胞所用抗体亦不同。
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4.1 滋养叶细胞 滋养叶细胞是最早被证实存在于母血中，且由于其独特的形态学特征， 理论上应很容易分离，但实际上却不然。主要是由于母体能迅速清除进入其肺循环的滋养叶 细胞，而且不容易得到能与滋养叶细胞表面抗原特异性结合的抗体。早先人们常用的H315单 克隆抗体，被证明为特异性不高，分离出来的大部分是母体细胞[16]。为找到特异 性滋养叶细胞的单克隆抗体，研究者们为此作出了不懈努力。Hawes等[16]应用制 备的三种单克隆抗体FDO?468、FDO?161G和FDO?101X从12/14例正常孕妇外周血中成功地 分离出胎儿滋养叶细胞。Yoshiki等[17]则采用杂交瘤技术制备出7种针对滋养叶细 胞表面抗原的特异性抗体：BW-108、BW-110、BW-123、BW-124、HP-15、HP-16及HP- 17，实验证明这些抗体特异性非常高。Latham等[18]发现一种抗人胎盘催乳素(HPL )的单克隆抗体FDO?202N，在模型系统中研究发现能非常有效地分离出滋养叶细胞。还有其 他研究者亦制备出多种特异性抗体用于分离滋养叶细胞[2]。但是应用胚胎滋养叶 细胞进行产前诊断存在两个缺点：一是其多核特性，妨碍了FISH技术在诊断上的应用 ；二 是胎盘细胞嵌合体现象，人们己认识到这一点，大约有1%的标本其滋养叶细胞核型不同于胎 儿细胞，因而采用滋养叶细胞作产前诊断会有可能误诊[1]。这在一定程度上阻碍 了胚胎滋养叶细胞广泛应用于产前诊断。
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4.2 淋巴细胞和粒细胞 淋巴细胞和粒细胞研究得相对较迟，1970年后才陆续有人涉足 [1]。且由于胎儿与母体淋巴、粒细胞表面抗原难以区分，不易制备出只针对胎儿细 胞的特异性抗体，故分离困难，应用受限；再加上胎儿淋巴细胞在母血中可以滞留较长时间 ，产前诊断结果可能不反映当次妊娠而误诊。当前从母血中分离胎儿淋巴细胞和粒细胞进行 产前诊断的研究并不多。
4.3 有核红细胞 胎儿有核红细胞(NRBC)是当前研究最多，且被认为最有应用前途的一类 细胞。因为：(1)胚胎NRBC便于分离；(2)在早期胎儿血中含量丰富，而在母体外周血中含量 极少，有研究发现在妊娠11周胎儿血中NRBC占红细胞总数的10%，到妊娠19周时己降至1.5% ，而在成人血中比例更低[2]；(3)胎儿NRBC生命周期较短，在产后母血中基本不会 滞留，故应用于产前诊断相对较准确。
NRBC的标记物很多，有利于细胞分离[1]。Bianchi等[3]在1990年首先应 用抗CD71(转铁蛋白受体)抗体，经流式细胞分离法成功地分出胎儿NRBC。其后多位研 究者亦应用单克隆抗体分离出胎儿NRBC[4，11，12]。最常见有效的单克隆抗体主 要有抗CD71抗体、抗C36(Thrombospondin受体)抗体、抗细胞膜磷脂糖A(GPA) 抗体。对于这三种抗体究竟哪种最有效，研究者们尚未达成一致。Bianchi等[19] 研究发现用抗CD71抗体分离的胎儿有核红细胞进行性别测定，其准确率为57%，抗CD 36抗体为88%，抗GPA抗体与抗CD71抗体或抗CD36抗体联用时均为100%， 而抗GPA抗体单独应用时其准确率亦达100%，所以他们认为抗GPA抗体是分离胎儿NRBC是最有 效的抗体。而Simpson等[20]研究发现用抗GPA抗体分离胎儿细胞时普遍出现凝集现 象，实际应用效果并不佳。Lewis[21]亦证实用抗GPA抗体分离母血中胎儿NRBC时， 易引起凝集反应，由于有核细胞与无核细胞凝集在一起，引起光的折射及荧光性质发生改变 ，从而严重干扰了胎儿NRBC的分离，故不提倡用抗 GPA抗体分离NRBC，而仍使用抗CD71 抗体。为提高分离特异性，可同时加用抗CD45(白细胞共同抗原)抗体去除有核细胞 中的白细胞(淋巴细胞、粒细胞)，或者加用血红蛋白γ链抗体筛选[21]。根据胎 儿NRBC内含有特异性血红蛋白珠蛋白肽链，有不少研究者己着手从这方面进行胎儿NRBC的分 离富集。Bianchi[3]采用Kleihauer-Betke技术对HbF(胎儿血红蛋白，α2γ 2)进行染色而分离到胎儿NRBC。De Maria等[22]在应用细胞表面特异性抗体分离的 基础上，再结合抗γ珠蛋白肽链的单克隆抗体细胞内染色法进一步分离NRBC，在对一模型系 统(男胎脐血细胞和未怀孕成年女性外周血的单核细胞混合物)分离中，结果发现胎儿细胞回 收率达39%～100%，胎儿细胞纯度达59%～73%，远远高于他们自己先前单用细胞表面抗体分 离的纯度(0.01%～4.8%)；进一步用FISH技术证实，抗γ肽链阳性细胞为胎儿细胞准确率达 ：男胎儿细胞83%～100%，女胎儿细胞82%～100%。Yokobata等人[1]曾筛选出抗胎 儿特有的血红蛋白ξ肽链的单克隆抗体，并认为该抗体对分离NRBC大有帮助，但未见该抗体 的应用报道，可能跟ξ肽链在胎儿血中存在时间过短有关(ξ肽链在妊娠第8周己基本消失) 。
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5 胎儿细胞分离所面临的问题
尽管有众多各式各样的分离方法，层出不穷的特异性单克隆抗体，但目前胎儿细胞 分离所面临的最大问题还是母体细胞的混杂。这主要是由于目前所制备的众多抗体中还没有 一个是纯粹特异性的，即特异到只结合胎儿细胞而不结合母体细胞。如分离NRBC常用的CD 71抗体，它不仅结合NRBC，还结合母体部分激活淋细胞、网织红细胞等；即便是分离富 集的NRBC中，大部分仍是来自母体[23]。至于前面提到的特异性很高的γ肽链抗体 ，在实际应用中也不一定完全有效，因为在成人血红蛋白中仍存在1%左右的HbF(α2γ2 )。要解决母体细胞混杂问题还需要做大量工作，首先须加强对胎儿细胞性质研究，包括特 异性抗原、形态学特征及独特的物理化学特性，制备出高特异性抗体；其次是多抗体联合应 用；三是加用微控制分离技术。Takabayashi等[24]表示亦能通过微控制技术分离 得到单个NRBC，Cheung等[25]亦报道了从母体外周血中用磁化细胞法分离NRBC，再 用显微切割技术获得纯的NRBC。
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6 母血中分离的胎儿细胞在诊断上的应用
综合目前的报道，分离的胎儿细胞主要用于性别测定，Rh阴性孕母的胎儿Rh基因测 定，胎儿非整倍体检测及一些单基因遗传病的诊断(如β地中海贫血、Lepore-Boston血红 蛋白病、α及β血红蛋白病、囊性纤维变性、杜兴氏肌营养不良症以及与X染色体连锁的脆 性精神发育迟缓症等[1]。当前应用分离的胎儿细胞做产前诊断最有意义的当属Rh 阴性母亲的胎儿Rh基因测定，因为这有利于防止危害较大，且发病率不低(1.06%)的Rh血型 不合胎儿溶血症。1993年Lo等[26]用分离的胎儿细胞成功地鉴定了Rh阴性母亲的胎 儿Rh状态；Geifman-Holtzman等[27]应用流式细胞分离法分出的CD34+ GPA+胎儿NRBC对Rh阴性孕母的胎儿进行了Rh基因测定，结果阳性预告率达100%，阴性预告 率达67%。其次是胎儿性别测定[6，10]，因母体不含Y染色体，所以胎儿细胞不纯 对此无明显影响。另外就是胎儿非整倍体检测[1，12]，多采用FISH法，己诊断出 的非整倍体有：21三倍体，18三倍体，47、XYY核型，47、XXY核型等。至于单基因病的诊断 ，由于混杂细胞的影响。应用受限，只有 trong>廖云星(1971-)，男，江西南丰人，主治医师，硕 士，主要从事儿科血液与遗传研究。
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参考文献：
[1]Bianchi DW.Prenatal diagnosis by analysis of fetal cell in maternal blood[J].J Pediatr,1995，127(6)：847-856.
[2]Lo YMD.Noninvasive prenatal diagnosis using fetal cell in maternal blood[J].J Clin Pathol,1994,47:1060-1065.
[3]Bianchi DW,Flint AF,Pizzimenti MF,et al.Isolation of fetal DNA from nucleated erythrocyte in maternal blood[J].Proc Natl Acad Sci USA,1990，87：32 79-3283.
, http://www.100md.com
[4]Price JO,Elias S,Wachtel SS,et al.Prenatal diagnosis using fetal cel ls isolated from maternal blood by multiparameter flow cytometry[J].Am J Obste t Gynecol,1991，165：1731-1737.
[5]Ganshirt-Ahlert D,Pohlschmidt M,Gal A,et al.Ratio of fetal to mater nal DNA is less than 1 in 5000 at different gestational age in maternal blood[J ].Clin Genet,1990，38：38-43.
[6]Hamada H,Ariami T,Kubo T,et al.Fetal nucleated cells in maternal per ipheral blood:frequency and relationship to gestation age[J].Hum Genet,1993，9 1：427-432.
, http://www.100md.com
[7]Kuhlmann RS,Werner AL,Abramowicz J,et al.Placental histology in fetu ses between 18 and 23 weeks gestation with abnormal karyotype[J].Am J Obstet G ynecol,1990，163：1264-1270.
[8]Chua S,Wilkins T,Sargent I,et al.Trophoblast deportation in pre-ecl amptic pregnancy[J].Br J Obstet Gynaecol，1991，98：973-979.
[9]Lo YMD,Noakes L,Bowell PJ,et al.Detection of fetal RhD sequence from peripheral blood of sensitised RhD-negative pregnant women[J].Br J Haematol, 1994，87：658-660.
, 百拇医药
[10]Thomas MR,Williamson S,Craft I,et al.Y chromosome sequence DNA ampl ifled from peripheral blood of women in early pregnancy[J].Lancet,1994，343：4 13-414.
[11]Bianchi DW,Stewaty JE,Garber MF,et al.Possible effect of gestationa l age on the detection of fetal nucleated erythrocyte in maternal blood[J].Pre nat Diagn，1991，11：523-528.
[12]Ganshirt-Ahlet D,Borjesson-Stoll R,Burschyk M,et al.Detection of fetal trisomies 21 and 18 from maternal blood using triple gradient and magnetic cell sorting[J].Am J Reprod Immunol,1993，30：193-200.
, 百拇医药
[13]Bianchi DW,Zickwolf GK,Weil GJ,et al.Male fetal progenitor cells pe rsist in maenal blood for as long as 27 years postpartum[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996，93(2)：705-708.
[14]Hamada H,Arinami T,Hamagachi H,et al.Fetal nucleated cells in mater nal peripheral blood after delivery[J].Am J Obstet Gynecol,1994，170：1188-11 93.
[15] Bianchi DW,Klinger KW,Vadnais TJ,et al.Development of model system to compare cell separation methods for isolation of fetal cells from maternal b lood[J].Prenat Diagn,1996，16(4)：289-298.
, 百拇医药
[16]Hawes CS,Suskin HA,Petropoulos A,et al.A morphologic study of troph oblast isolated from peripheral blood of pregnant women[J].Am J Obstet Gynecol ,1994,170:1297-1300.
[17]Yoshiki T,Yang YY,Lee Y,et al.Generation and characterization of mo noclonal antibodies specific to surface antigens of human trophoblast cells[J] .Am J Reprod Immunol,1995，34(3)：148-155.
[18]Latham SE,Suskin HA,Petropoulos A,et al.A monocoonal antibody to hu man placental lactogen hormone facilitates isolation of fetal cells from materna l blood in a model system[J].Prenat Diagn,1996，16(9)：813-821.
, 百拇医药
[19]Bianchi DW,Zickwolf GK,Yih MC,et al.Erythroid-specific antibodies enhance detection of fetal nucleated erythrocytes in maternal blood[J].Prenat Diagn，1993，3：293-300.
[20]Simposon JL,Lewis DE,Bischoff FZ,et al.Isolating fetal nucleated re d blood cells from maternal blood:the Baylor experience--1995[J].Prenat Diag n,1995，15(10)：907-912.
[21]Lewis DE,Schober W,Murrell S,et al.Rare event selection of fetal nu cleated ertythrocytes in maternal blood by flow cytometry[J].Cytometry,1996,23 (3):218-227
, http://www.100md.com
[22]De Maria MA,Zheng YL,Zhen D,et al.Improved fetal nucleated erythroc yte sorting purity using intracellular antifetal hemoglobin and Hoechst 33342[J ].Cytometry,1996,25(1):37-45.
[23]Slunga-Tallberg A,El-Rifai W,Keinanen M,et al.Maternal origin o f nucleated erythrocytes in peripheral venus blood of pregnant women[J].Hum Ge net,1995,96:53-57.
[24]Takabayashi H,Kuwabra S,Ukita T,et al.Development of noninvasive fetal DNA diagnosis from maternal blood[J].Prenat Diagn,1995,15:74-77.
, http://www.100md.com
[25]Cheung MC,Goldberg JD,Kan YM.Prenatal diagnosis of sickle cell anaemia and thalassaemia by analysis of fetal cells in matenal blood[J].Nat Genet,1996,14 (3):264-268.
[26]Lo MD,Bowel PJ,Selinger M,et al.Prenatal determination of fetal RhD status by analysis of peripheral blood of Rhesus negative mothers[J].Lancet,1993,34: 114-1148.
[27]Geifman-Holtzman O,Bernstein IM,Berry SM,et al.Fetal RhD genotyping in fe tal cells flow sorted from maternal blood[J].Am J Obstet Gynecol,1996,174(3):8 18-822.
, 百拇医药
[28]Hawes CS,Suskin HA,Kalionis B,et al.Detection of paternally inherited muta tions for β-thalassemia in trophoblast isolated form peripheral maternal blood [J].Ann NY Acad Sci,1994,.731:181-185.
[29]Camaschella C,Alfarano A,Gottardi E,et al.Prenatal diagnosis of fetal hemo globin Lepore-Boston disease on maternal peripheral blood[J].Blood,1990,75:21 01-2106.
收稿日期：1999-11-03, 百拇医药