椎间盘纤维环中糖胺多糖的实验研究
作者：王方 沈姗安 黄淦堂 徐岚 吴士 姜为民
单位：王方 沈姗安 黄淦堂(上海市第二人民医院，上海 200011)；徐岚 吴士 姜为民(苏州医学院，江苏 苏州)
关键词：糖胺多糖；椎间盘突出；腰；病理学；透明质酸；硫酸角质
中国骨伤000505 【摘要】 目的 研究正常和退变腰椎间盘纤维环中糖胺多糖(GAG)含量及其主要成份百分组成，探讨椎间盘退变的发生机理。方法 对34个正常纤维环和35个椎间盘突出症纤维环标本中GAG含量进行测定，并用醋酸纤维素膜电泳和光密度扫描的方法对GAG主要成份百分组成进行测定。结果 正常纤维环GAG含量为4.17±0.94 g/100 g，退变纤维环GAG含量为3.57±0.98 g/100 g，低于正常组(P<0.05)；退变组GAG中硫酸软骨素(CS)百分值低于正常组(P<0.05)；而其透明质酸(HA)和硫酸角质(KS)高于正常组(P<0.05)。结论 椎间盘纤维环中GAG含量下降，是引起纤维环胶原纤维稳定性降低，影响纤维环板层滑动，导致椎间盘退变、突出症发生的重要原因之一。退变纤维环GAG含量下降由其主要成分CS含量下降所致。
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An Experimental Study of the Glycosaminoglycan in the Annuli Fibrosus of the Normal and Degenerated Intervertebral Disci
WANG Fang SHEN Shan-an HUANG Gan-tang et al
(The Second People′s Hospital Shanghai，200011)
【Abstract】 Objective To study the glycosaminoglycan(GAG)content and its percentage composition in annuli fibrosus of normal and degenerated intervertebral disci，and to discuss the pathogenesis of degeneration of intervertebral disc.Methods The GAG content and its percentage composition were determined in 34 specimens of normal annulus fibrosus(from autopsy specimens of patients of cerebral injury and in 35 degenerated specimens of annulus fibrosus.Celluloseacetate membrane electrophoresis and optical density scanning were used in this experiment.Results The GAG content in normal group was higher than those in degenerated group(P<0.05)；The percentage composition of chondroitin sulfate(CS) in the degenerated group was lower than that in the normal group(P<0.05)；The percentage composition of hyaluronic acid(HA)and keratin sulfate(KS)was higher than that in the normal group(P<0.05).Conclusion The decrease of GAG content in annuli fibrosus plays an important role in the decrease of stability of collagenous fibers.It also affects sliding of annuli fibrosus lamella and leads to the degeneration and herniation of intervertebral disc.The decrease of GAG content in the degenerated annuli fibrosus is mainly caused by the decrease of CS.
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【Key Words】 Glycosaminoglycan Intervertebral disc displacement，lumbar Pathology Hyaluronic acid Keratosulfate
本文采用蛋白多糖分解后的提取物——糖胺多糖(Glycosaminoglycan，GAG)生化测定分析方法[1]对正常纤维环和椎间盘突出症纤维环标本进行了研究。
1 材料和方法
1.1 取材 正常纤维环标本取自7例急性脑外伤患者，范围L1～S1，共34个标本，均为男性，平均年龄26.9岁(21～34岁)；退变纤维环标本取自29例腰椎间盘突出症手术患者，范围L3～S1共35个，男性20例，女性9例，平均年龄27.4岁(20～34岁)。标本取出后用0 ℃生理盐水洗去表层血液，小玻璃瓶中密封-30℃短期保存。
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1.2 匀浆制备 切取少许纤维环标本，称取每份标本用量；切碎后加入0.1 MNaOH1.5 ml，在冰水槽中用匀浆器制成乳白色匀浆；加入0.1 MHCl调至中性，加入2%NaN3两滴。
1.3 GAG提取 在各试管中加入胰蛋白酶1 mg/ml，混匀后37℃保存24h；加入60%三氯醋酸至终浓度为10%，混匀后放置24 h；以14000 r/min离心20 min，留上清液，加入4倍体积无水乙醇，放置48 h出现白色絮状沉淀；以14000 r/min离心20 min，弃上清液，沉淀溶于1 ml蒸馏水中即得GAG溶液。
1.4 GAG含量测定 取GAG溶液0.1 ml(标准管中取1 mg/ml氨基半乳糖0.1 ml)，以6 MHCl水解GAG游离出氨基己糖；加入乙酰丙酮10.5 ml，90℃水浴30 min，使氨基己糖生成吡咯衍生物；冷却后加入95%乙醇2.5 ml，混匀后放置20 min，加入对二甲氨基苯甲醛混匀后显红色，10分钟内用530 nm分光光度计测定吸光值OD。纤维环GAG含量＝(样本管OD值/标准管OD值)×1×0.1×(沉淀物稀释倍数/样本用量)(单位：g/100 g湿重纤维环)。
, 百拇医药
1.5 GAG成份分析 GAG为多聚阴离子，主要成份有透明质酸(hyaluronic acid，HA)、硫酸角质(karatin sulfate，KS)和硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)等。本实验标准品和样本GAG点样经醋酸纤维素膜吡啶甲酸缓冲液电泳，8 V/cm，通电60 min，取出后用阿利新蓝染色，经过脱色液10 min、20 min、40 min脱色后烘干，用岛津-930荧光密度仪扫描，自动积分记录各区带相对百分值，得到GAG主要成份相对百分值。
1.6 统计学处理 电泳扫描图上由GAG点样端向阳极端多呈HA、KS、CS三条区带；但有的只有两条区带，为KS不明显；有的有四条区带，为CS分为4-CS和6-CS之故。为便于统计分析，考虑KS区带不明显或KS和HA区带未完全分开，本文将HA+KS百分值之和作为一组数据进行处理。计算正常组和退变组的GAG、CS和HA+KS共六组数据的均数加减标准误，并对正常组和退变组数据之间存在的差异是否有显著性，作t检验。
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2 结果
2.1 纤维环GAG含量(单位：g/100 g湿重纤维环) 正常组含量为4.17±0.94；退变组含量为3.57±0.98，低于正常组，差异有显著性(P<0.05)。
2.2 纤维环GAG主要成份分析(单位：%) 正常组CS百分值为72.6±15.3；退变组CS百分值为57.9±13.0，低于正常组，差异有显著性(P<0.05)。正常组HA+KS百分值为27.2±13.3；退变组HA+KS百分值为42.0±12.9，高于正常组，差异有显著性(P<0.05)。
3 讨论
正常椎间盘纤维环中，水含量占60%～70%，胶原蛋白占其干重的60%，蛋白多糖占干重的20%，其余为少量的弹性蛋白、年龄色素[2]。GAG糖链与纤维环中胶原纤维直接连接，使胶原纤维更加稳定[3]；同时蛋白多糖在纤维环板层间沉积，其GAG糖链与水结合，使纤维板层之间具有粘性，当脊柱在伸屈等运动过程中有利于纤维环板层间的滑动[4]。椎间盘纤维环GAG含量的下降，会影响纤维环中胶原纤维的稳定性和纤维板层间的滑动，加剧纤维环退变进程，进一步诱发椎间盘突出。
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根据GAG不同成分所带电荷的不同，电泳时迁移率也就不同，在实验中可将GAG分离。椎间盘纤维环中蛋白多糖水解出的GAG糖链，主要有CS、KS、HA和少量的硫酸肤质(DS)。椎间盘中大多数细胞(约60%)能产生CS、KS等GAG成份[5]。本实验结果发现：退变组GAG含量较正常组下降的同时，其GAG中的CS百分值也较正常组下降，而退变组HA+KS百分值较正常组上升。纤维环中GAG主要成份以CS占绝大多数，因此退变纤维环中GAG含量下降由CS含量下降所致。椎间盘纤维环主要基质成份中，以GAG含量与其中水含量直接相关，而GAG不同主要成份中CS与水的亲和力最强[6]。随年龄增长而逐渐加剧的椎间盘退变过程中，虽然HA+KS随年龄增长而增加，但是不足以补偿其中CS含量的下降，从而引起椎间盘纤维环中GAG含量和水含量下降[4]。国外有关椎间盘GAG主要成份HA+KS的实验研究结果有较大的差异，可能与实验取材部位、方法的差异、实验误差有关。有实验研究发现，椎间盘退变时首先是GAG和水丢失，早期可刺激组织修复，当退变程度加重时这种修复不易进行，纤维环和髓核变性[7]。
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当压力、扭转外力作用于脊柱时，先作用于椎间盘软骨终板，再经过凝胶状髓核均匀地传递到纤维环，纤维环的作用为抗张力、保持椎间盘髓核容积、限制椎体间运动、维持椎体骨与韧带间解剖关系的稳定[8]。GAG含量和水含量减少会影响椎间盘纤维环生物力学性能，在退变的基础上易于破裂，引起椎间盘髓核突出。
总之，椎间盘纤维环中GAG含量(主要是CS含量)下降，是引起胶原纤维稳定性降低、影响纤维环板层滑动、导致椎间盘组织退变、椎间盘突出的重要原因之一。
参考文献
[1] 方德福，周吕，丁濂，等.现代医学实验技巧全书.北京：北京医科大学、协和医科大学联合出版社.1995.679-684.
[2] Sedowofia KA，Tomlinson IW，Weiss JB，et al.Collagenolytic enzyme systems in human intervertebral disc.Spine，1982，7(3)：213-221.
, http://www.100md.com
[3] Bernick S，Walker JM，Paule WJ.Age changes to the annulus fibrosus in human intervertebral disc.Spine，1991，16(5)：520-524.
[4] Scott JE，Bosworth TR，Cribb AM，et al.The chemical morphology of age-related changes in human intervertebral disc glycosaminoglycans from cervical，thoracic and lumbar nucleus pulposus and annulus fibrosus.J Anat，1994，184(2)：73-82.
[5] Chelberg MK，Banks GM，Geiger DF，et al.Identification of heterogeneous cell populations in normal human intervertebral disc.J Anat，1995，186(1)：43-53.
, 百拇医药
[6] Antoniou J，Steffen T，Nelson F，et al.The human lumbar intervertebral disc.J Clin Invest，1996，98(4)：996-1003.
[7] Lipson SJ，Muir H.Biochemical analysis of the prolapse′s intervertebral disc for rabbit.Spine，1981，6(2)：194-210.
[8] Skaggs DL，Weidenbaum M，Latridis JC，et al.Regional variation in tensile propertie and biochemical composition of the human lumbar annulus fibrosus.Spine，1994，19(12)：1310-1319.
收稿：1998-12-07
修回：1999-09-14, http://www.100md.com
单位：王方 沈姗安 黄淦堂(上海市第二人民医院，上海 200011)；徐岚 吴士 姜为民(苏州医学院，江苏 苏州)
关键词：糖胺多糖；椎间盘突出；腰；病理学；透明质酸；硫酸角质
中国骨伤000505 【摘要】 目的 研究正常和退变腰椎间盘纤维环中糖胺多糖(GAG)含量及其主要成份百分组成，探讨椎间盘退变的发生机理。方法 对34个正常纤维环和35个椎间盘突出症纤维环标本中GAG含量进行测定，并用醋酸纤维素膜电泳和光密度扫描的方法对GAG主要成份百分组成进行测定。结果 正常纤维环GAG含量为4.17±0.94 g/100 g，退变纤维环GAG含量为3.57±0.98 g/100 g，低于正常组(P<0.05)；退变组GAG中硫酸软骨素(CS)百分值低于正常组(P<0.05)；而其透明质酸(HA)和硫酸角质(KS)高于正常组(P<0.05)。结论 椎间盘纤维环中GAG含量下降，是引起纤维环胶原纤维稳定性降低，影响纤维环板层滑动，导致椎间盘退变、突出症发生的重要原因之一。退变纤维环GAG含量下降由其主要成分CS含量下降所致。
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WANG Fang SHEN Shan-an HUANG Gan-tang et al
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【Abstract】 Objective To study the glycosaminoglycan(GAG)content and its percentage composition in annuli fibrosus of normal and degenerated intervertebral disci，and to discuss the pathogenesis of degeneration of intervertebral disc.Methods The GAG content and its percentage composition were determined in 34 specimens of normal annulus fibrosus(from autopsy specimens of patients of cerebral injury and in 35 degenerated specimens of annulus fibrosus.Celluloseacetate membrane electrophoresis and optical density scanning were used in this experiment.Results The GAG content in normal group was higher than those in degenerated group(P<0.05)；The percentage composition of chondroitin sulfate(CS) in the degenerated group was lower than that in the normal group(P<0.05)；The percentage composition of hyaluronic acid(HA)and keratin sulfate(KS)was higher than that in the normal group(P<0.05).Conclusion The decrease of GAG content in annuli fibrosus plays an important role in the decrease of stability of collagenous fibers.It also affects sliding of annuli fibrosus lamella and leads to the degeneration and herniation of intervertebral disc.The decrease of GAG content in the degenerated annuli fibrosus is mainly caused by the decrease of CS.
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【Key Words】 Glycosaminoglycan Intervertebral disc displacement，lumbar Pathology Hyaluronic acid Keratosulfate
本文采用蛋白多糖分解后的提取物——糖胺多糖(Glycosaminoglycan，GAG)生化测定分析方法[1]对正常纤维环和椎间盘突出症纤维环标本进行了研究。
1 材料和方法
1.1 取材 正常纤维环标本取自7例急性脑外伤患者，范围L1～S1，共34个标本，均为男性，平均年龄26.9岁(21～34岁)；退变纤维环标本取自29例腰椎间盘突出症手术患者，范围L3～S1共35个，男性20例，女性9例，平均年龄27.4岁(20～34岁)。标本取出后用0 ℃生理盐水洗去表层血液，小玻璃瓶中密封-30℃短期保存。
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1.2 匀浆制备 切取少许纤维环标本，称取每份标本用量；切碎后加入0.1 MNaOH1.5 ml，在冰水槽中用匀浆器制成乳白色匀浆；加入0.1 MHCl调至中性，加入2%NaN3两滴。
1.3 GAG提取 在各试管中加入胰蛋白酶1 mg/ml，混匀后37℃保存24h；加入60%三氯醋酸至终浓度为10%，混匀后放置24 h；以14000 r/min离心20 min，留上清液，加入4倍体积无水乙醇，放置48 h出现白色絮状沉淀；以14000 r/min离心20 min，弃上清液，沉淀溶于1 ml蒸馏水中即得GAG溶液。
1.4 GAG含量测定 取GAG溶液0.1 ml(标准管中取1 mg/ml氨基半乳糖0.1 ml)，以6 MHCl水解GAG游离出氨基己糖；加入乙酰丙酮10.5 ml，90℃水浴30 min，使氨基己糖生成吡咯衍生物；冷却后加入95%乙醇2.5 ml，混匀后放置20 min，加入对二甲氨基苯甲醛混匀后显红色，10分钟内用530 nm分光光度计测定吸光值OD。纤维环GAG含量＝(样本管OD值/标准管OD值)×1×0.1×(沉淀物稀释倍数/样本用量)(单位：g/100 g湿重纤维环)。
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1.5 GAG成份分析 GAG为多聚阴离子，主要成份有透明质酸(hyaluronic acid，HA)、硫酸角质(karatin sulfate，KS)和硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)等。本实验标准品和样本GAG点样经醋酸纤维素膜吡啶甲酸缓冲液电泳，8 V/cm，通电60 min，取出后用阿利新蓝染色，经过脱色液10 min、20 min、40 min脱色后烘干，用岛津-930荧光密度仪扫描，自动积分记录各区带相对百分值，得到GAG主要成份相对百分值。
1.6 统计学处理 电泳扫描图上由GAG点样端向阳极端多呈HA、KS、CS三条区带；但有的只有两条区带，为KS不明显；有的有四条区带，为CS分为4-CS和6-CS之故。为便于统计分析，考虑KS区带不明显或KS和HA区带未完全分开，本文将HA+KS百分值之和作为一组数据进行处理。计算正常组和退变组的GAG、CS和HA+KS共六组数据的均数加减标准误，并对正常组和退变组数据之间存在的差异是否有显著性，作t检验。
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2 结果
2.1 纤维环GAG含量(单位：g/100 g湿重纤维环) 正常组含量为4.17±0.94；退变组含量为3.57±0.98，低于正常组，差异有显著性(P<0.05)。
2.2 纤维环GAG主要成份分析(单位：%) 正常组CS百分值为72.6±15.3；退变组CS百分值为57.9±13.0，低于正常组，差异有显著性(P<0.05)。正常组HA+KS百分值为27.2±13.3；退变组HA+KS百分值为42.0±12.9，高于正常组，差异有显著性(P<0.05)。
3 讨论
正常椎间盘纤维环中，水含量占60%～70%，胶原蛋白占其干重的60%，蛋白多糖占干重的20%，其余为少量的弹性蛋白、年龄色素[2]。GAG糖链与纤维环中胶原纤维直接连接，使胶原纤维更加稳定[3]；同时蛋白多糖在纤维环板层间沉积，其GAG糖链与水结合，使纤维板层之间具有粘性，当脊柱在伸屈等运动过程中有利于纤维环板层间的滑动[4]。椎间盘纤维环GAG含量的下降，会影响纤维环中胶原纤维的稳定性和纤维板层间的滑动，加剧纤维环退变进程，进一步诱发椎间盘突出。
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根据GAG不同成分所带电荷的不同，电泳时迁移率也就不同，在实验中可将GAG分离。椎间盘纤维环中蛋白多糖水解出的GAG糖链，主要有CS、KS、HA和少量的硫酸肤质(DS)。椎间盘中大多数细胞(约60%)能产生CS、KS等GAG成份[5]。本实验结果发现：退变组GAG含量较正常组下降的同时，其GAG中的CS百分值也较正常组下降，而退变组HA+KS百分值较正常组上升。纤维环中GAG主要成份以CS占绝大多数，因此退变纤维环中GAG含量下降由CS含量下降所致。椎间盘纤维环主要基质成份中，以GAG含量与其中水含量直接相关，而GAG不同主要成份中CS与水的亲和力最强[6]。随年龄增长而逐渐加剧的椎间盘退变过程中，虽然HA+KS随年龄增长而增加，但是不足以补偿其中CS含量的下降，从而引起椎间盘纤维环中GAG含量和水含量下降[4]。国外有关椎间盘GAG主要成份HA+KS的实验研究结果有较大的差异，可能与实验取材部位、方法的差异、实验误差有关。有实验研究发现，椎间盘退变时首先是GAG和水丢失，早期可刺激组织修复，当退变程度加重时这种修复不易进行，纤维环和髓核变性[7]。
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当压力、扭转外力作用于脊柱时，先作用于椎间盘软骨终板，再经过凝胶状髓核均匀地传递到纤维环，纤维环的作用为抗张力、保持椎间盘髓核容积、限制椎体间运动、维持椎体骨与韧带间解剖关系的稳定[8]。GAG含量和水含量减少会影响椎间盘纤维环生物力学性能，在退变的基础上易于破裂，引起椎间盘髓核突出。
总之，椎间盘纤维环中GAG含量(主要是CS含量)下降，是引起胶原纤维稳定性降低、影响纤维环板层滑动、导致椎间盘组织退变、椎间盘突出的重要原因之一。
参考文献
[1] 方德福，周吕，丁濂，等.现代医学实验技巧全书.北京：北京医科大学、协和医科大学联合出版社.1995.679-684.
[2] Sedowofia KA，Tomlinson IW，Weiss JB，et al.Collagenolytic enzyme systems in human intervertebral disc.Spine，1982，7(3)：213-221.
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[4] Scott JE，Bosworth TR，Cribb AM，et al.The chemical morphology of age-related changes in human intervertebral disc glycosaminoglycans from cervical，thoracic and lumbar nucleus pulposus and annulus fibrosus.J Anat，1994，184(2)：73-82.
[5] Chelberg MK，Banks GM，Geiger DF，et al.Identification of heterogeneous cell populations in normal human intervertebral disc.J Anat，1995，186(1)：43-53.
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[6] Antoniou J，Steffen T，Nelson F，et al.The human lumbar intervertebral disc.J Clin Invest，1996，98(4)：996-1003.
[7] Lipson SJ，Muir H.Biochemical analysis of the prolapse′s intervertebral disc for rabbit.Spine，1981，6(2)：194-210.
[8] Skaggs DL，Weidenbaum M，Latridis JC，et al.Regional variation in tensile propertie and biochemical composition of the human lumbar annulus fibrosus.Spine，1994，19(12)：1310-1319.
收稿：1998-12-07
修回：1999-09-14, http://www.100md.com