大容量采集外周血干细胞用于自体和异体移植
作者：温柏平 李惠民 杨绵本 杨凌 李维佳 何争春 陈卫健 杨蜀云 黎承平
单位：温柏平(昆明医学院附一院血液科 昆明，650032)；李惠民(昆明医学院附一院血液科 昆明，650032)；杨绵本(昆明医学院附一院血液科 昆明，650032)；杨凌(昆明医学院附一院血液科 昆明，650032)；李维佳(昆明医学院附一院血液科 昆明，650032)；何争春(昆明医学院附一院血液科 昆明，650032)；陈卫健(昆明医学院附一院血液科 昆明，650032)；杨蜀云(昆明医学院附一院血液科 昆明，650032)；黎承平(昆明医学院附一院血液科 昆明，650032)
关键词：
临床血液学杂志000515 外周血干细胞(PBSC)是骨髓造血重建重要的干细胞来源。由 于造血恢复快，采集时不需全身麻醉等优点，PBSC临床应用范围不断扩大。PBSCT已从自体 移植进入了异体移植的临床应用阶段。干细胞的有效采集是移植的首要条件。为此，我们采 用新型血细胞分离机COBE Spectra采集健康供者和恶性淋巴瘤患者经动员的PBSC，初步分析 了动员方案，采集时机与效率和移植后造血重建，为今后进一步广泛应用PBSC打下基础。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 动员方案
3名健康供者(Allo-PBSCT供者)分别是3名急性白血病患者的同胞，经HLA配型符合供者要求 。供者1的动员方案为：rhG-CSF 300 μg/d×5 d，供者2，3的动员方案采用rhG-CSF 3 00 μg/d加rhG-CSF 150 μg/d合用，连续5 d。动员后根据CD34+细胞含量决定 采集时机。以上供者均在第6天采集。病例4，5为恶性淋巴瘤患者，进行自体移植。病例4， 诊断为HD患者，动员采用，CTX 800 mg×2次，VP-16，100 mg×6 d，5 d后加G-CSF 300 μg/d×4 d，第5天开始收集PBSC。病例5为NHL患者。动员方案为：CTX 800 mg×2次，吡 喃阿霉素40 mg×1次，VP-16 150 mg×6次，6 d后加G-CSF 300 μg/d×3，第4天开始采 集PBSC。
, 百拇医药
1.2 PBSC采集
选择血细胞分离机(COBE Spectra,version 5.1 software,LRS System,Lukewood，USA) MNC程序。输入参数(性别，身高，体重，Hct)。3名健康供者和2名患者血液流速为28.6 ～44 ml/min不等，血与抗凝剂比值为12∶1，终点分血量依据各自以总血容量(TBV)及当时 具体情况(如对ACD-A的耐受和期望MNC的产量等)决定。静脉穿刺采用双肘静脉(供者1，2) ，或单侧肘静脉和锁骨下静脉穿刺(供者3和患者4，5)。选择血流丰富的一侧静脉作入(机) 血通路。MNC采集效率按下列公式计算。
pre和Post-MNC分别代表采集前后供者的MNC数量
1.3 CD34+细胞的测定
, http://www.100md.com
采用美国Coulter公司XL型流式细胞仪。有核细胞与FITC标记的CD34+单抗(美国BD 公司)4℃混合30 min。测定动员前后外周血和收集产品中CD34+细胞的百分含量。
2 结果
2.1 MNC和CD34+细胞的产量及采集效率
我们对5人7次采集MNC的结果见表1。
表1 MNC采集的数据 供者和病人1)
采集时MNC
(×109/L)
, 百拇医药
采集时CD34+
(%)
终点分血量
(TBV)
采 集效率
(%)
MNC终产量
(×109)
CD34+细胞终产量
(×107)
1
, 百拇医药
1.78
2.0
2.6
43.0
1 6.5
24.2
1.83
2.0
3.2
53.0
31.3
49.0
2
, http://www.100md.com
1.91
4.5
3.3
83.0
64.0
256.0
1.86
4.0
2.0
85.0
45.0
45.0
3
, http://www.100md.com
1.90
1.0
3.1
68.0
40.0
104.0
4
0.84
1.0
3.3
76.0
39.0
50.0
, http://www.100md.com
5
1.60
1.1
3.1
88.0
40.0
195.0
1)供者1和2分别进行了两次连续采集 从表1看出，采集时CD34+细胞含量均>1%，每次采 集(除供者1第1次和供者2第2次外)的终点分血量均在3个TBV以上，采集MNC的效率各不相同 ，43%～88%不等，但都获得较高的MNC和CD34+细胞产量。此外，我们还对收集产品中MNC和CD34+细胞产量进行 了相关分析，结果表明二者呈正相关，相关系数r=0.748(P<0.05)。
, http://www.100md.com
2.2 收集产品的成份
表2列出了7次采集产品成份的实验室检测结果。
表2 采集产品成份及特征 供者和病人
收集体积(ml )
WBC(×109/L)
MNC(%)
CD34+细胞(%)
RBC(×1012/L)
PLT(×109/L)
1
, 百拇医药
214
295
25.0
1.5
0.66
1 350
327
335
28.0
1.6
0.50
986
2
, 百拇医药
348
283
65.0
1.0
0.49
2 170
200
296
75.0
4.0
0.52
907
3
, http://www.100md.com
322
264
47.0
2.6
0.63
2 075
4
340
167
68.0
1.2
0.42
895
, 百拇医药
5
334
123
95.0
5.0
0.61
3 700
由表2看出，收集产品中除主要含MNC外，还采集到其他一些 副产品，例如，RBC、PLT和PMN等。其中PLT的含量较高，RBC含量较少，Hct一般<5%。经验 表明，界面调整直接关系到MNC的收集效率，进而影响产品中MNC的含量。收集产品中CD 34+的百分含量较高>1.0%。
2.3 PBSC的回输与造血重建
, 百拇医药
表3列出了5名患者分别接受PBSC后造血重建时间的比较。表3 回输CD34+细胞数与造血恢复时间 病
人1)
移植类型
实际回输CD34+
细胞(×106/kg)
回输后(d)
PMN>0.5
×109/L
PLT>20
, 百拇医药 ×109/L[ ZB)
1
Allo-PBSCT
9.8
17
85
2
Allo-PBSCT
13.3
10
11
3
Allo-PBSCT
, 百拇医药
18.0
11
11
4
Allo-PBSCT
6.8
12
12
5
Allo-PBSCT
28.0
11
9
, http://www.100md.com
1)1，2和3号病人分别由供者1，2和3提供PBSC。以上造血恢复时间均为回输CD 34+细胞后加用rhG-CSF 表3看出，回输CD34+细胞后，异体和自体外周血干细胞移植患者， 造血恢复时间短，回输后约10 d，PLT和PMN均得到恢复。说明表3中所输入CD34+细 胞剂量是足够的，病例1 PLT和PMN恢复较慢，可能与供受者ABO血型不合有关。
3 讨论
外周血干细胞移植(PTSCT)首要的条件是干细胞的有效动员和采集。近年国内少数 单位虽已开展了此项工作，但是干细胞的产率远不如国外，而且平均每例采集次数较多。我 们用大容量白细胞单采(Iarge volume leukapheresis,LVL)外周血干细胞，获得优良效果。 为提高MNC采集效率和终产量，采集时机的选择十分重要。为决定采集的时机，监测动员后C D34+细胞的含量十分必要。动员目的在于促使更多CD34+细胞进入外周血 。检测结果表明，5例经动员后采集时CD34+细胞含量比动员前均有大幅度增加(> 1.0%)。健康供者一般在动员后5 d，患者则在细胞因子动员后3～4 d采集，干细胞采集 效率较高。此外，采集时MNC界面的调整也与干细胞的产率密切相关。为保障一个稳定的MNC 界面，保证出血压力的稳定极为重要，如波动太大会造成MNC采集效率低。LVL是近年来为提 高干细胞产率，减少采集次数的重要手段。国外文献(Comenzo*RL和Malachouski ME)报道 ，一次LVL，终点分血量>3.5 TBV时，才可采集到足够干细胞。我们的结果显示，3倍T BV时，便可采集到供移植所需的最低值(CD34+)>5×106/kg，移植后结果表明， 患者造血功能均较快恢复。PBSCT另一个优点是产品中RBC含量少，Hct<5%ABO血型不相合的 异体移植。这个量的RBC不会引起严重后果，而且避免了BMT时去除RBC的繁锁。对7次采集MN C和CD34+细胞数相关分析显示，二者存在正相关，相关系数r=0.748(P< 0.05)。说明CD34+细胞存在于MNC细胞群体中，随MNC采集量增加而增加之势。 所以，在目前现行动员方案中，要提高CD34+细胞的产率须通过：①提高MNC采集效 率。②增加终点分血量，即进行LVL。而对没有流式细胞仪的单位，可用MNC计数代替CD 34+的测定，具有实际意义。
(编辑 张揆一)
(收稿 1999-05-10), 百拇医药
单位：温柏平(昆明医学院附一院血液科 昆明，650032)；李惠民(昆明医学院附一院血液科 昆明，650032)；杨绵本(昆明医学院附一院血液科 昆明，650032)；杨凌(昆明医学院附一院血液科 昆明，650032)；李维佳(昆明医学院附一院血液科 昆明，650032)；何争春(昆明医学院附一院血液科 昆明，650032)；陈卫健(昆明医学院附一院血液科 昆明，650032)；杨蜀云(昆明医学院附一院血液科 昆明，650032)；黎承平(昆明医学院附一院血液科 昆明，650032)
关键词：
临床血液学杂志000515 外周血干细胞(PBSC)是骨髓造血重建重要的干细胞来源。由 于造血恢复快，采集时不需全身麻醉等优点，PBSC临床应用范围不断扩大。PBSCT已从自体 移植进入了异体移植的临床应用阶段。干细胞的有效采集是移植的首要条件。为此，我们采 用新型血细胞分离机COBE Spectra采集健康供者和恶性淋巴瘤患者经动员的PBSC，初步分析 了动员方案，采集时机与效率和移植后造血重建，为今后进一步广泛应用PBSC打下基础。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 动员方案
3名健康供者(Allo-PBSCT供者)分别是3名急性白血病患者的同胞，经HLA配型符合供者要求 。供者1的动员方案为：rhG-CSF 300 μg/d×5 d，供者2，3的动员方案采用rhG-CSF 3 00 μg/d加rhG-CSF 150 μg/d合用，连续5 d。动员后根据CD34+细胞含量决定 采集时机。以上供者均在第6天采集。病例4，5为恶性淋巴瘤患者，进行自体移植。病例4， 诊断为HD患者，动员采用，CTX 800 mg×2次，VP-16，100 mg×6 d，5 d后加G-CSF 300 μg/d×4 d，第5天开始收集PBSC。病例5为NHL患者。动员方案为：CTX 800 mg×2次，吡 喃阿霉素40 mg×1次，VP-16 150 mg×6次，6 d后加G-CSF 300 μg/d×3，第4天开始采 集PBSC。
, 百拇医药
1.2 PBSC采集
选择血细胞分离机(COBE Spectra,version 5.1 software,LRS System,Lukewood，USA) MNC程序。输入参数(性别，身高，体重，Hct)。3名健康供者和2名患者血液流速为28.6 ～44 ml/min不等，血与抗凝剂比值为12∶1，终点分血量依据各自以总血容量(TBV)及当时 具体情况(如对ACD-A的耐受和期望MNC的产量等)决定。静脉穿刺采用双肘静脉(供者1，2) ，或单侧肘静脉和锁骨下静脉穿刺(供者3和患者4，5)。选择血流丰富的一侧静脉作入(机) 血通路。MNC采集效率按下列公式计算。
pre和Post-MNC分别代表采集前后供者的MNC数量
1.3 CD34+细胞的测定
, http://www.100md.com
采用美国Coulter公司XL型流式细胞仪。有核细胞与FITC标记的CD34+单抗(美国BD 公司)4℃混合30 min。测定动员前后外周血和收集产品中CD34+细胞的百分含量。
2 结果
2.1 MNC和CD34+细胞的产量及采集效率
我们对5人7次采集MNC的结果见表1。
表1 MNC采集的数据 供者和病人1)
采集时MNC
(×109/L)
, 百拇医药
采集时CD34+
(%)
终点分血量
(TBV)
采 集效率
(%)
MNC终产量
(×109)
CD34+细胞终产量
(×107)
1
, 百拇医药
1.78
2.0
2.6
43.0
1 6.5
24.2
1.83
2.0
3.2
53.0
31.3
49.0
2
, http://www.100md.com
1.91
4.5
3.3
83.0
64.0
256.0
1.86
4.0
2.0
85.0
45.0
45.0
3
, http://www.100md.com
1.90
1.0
3.1
68.0
40.0
104.0
4
0.84
1.0
3.3
76.0
39.0
50.0
, http://www.100md.com
5
1.60
1.1
3.1
88.0
40.0
195.0
1)供者1和2分别进行了两次连续采集 从表1看出，采集时CD34+细胞含量均>1%，每次采 集(除供者1第1次和供者2第2次外)的终点分血量均在3个TBV以上，采集MNC的效率各不相同 ，43%～88%不等，但都获得较高的MNC和CD34+细胞产量。此外，我们还对收集产品中MNC和CD34+细胞产量进行 了相关分析，结果表明二者呈正相关，相关系数r=0.748(P<0.05)。
, http://www.100md.com
2.2 收集产品的成份
表2列出了7次采集产品成份的实验室检测结果。
表2 采集产品成份及特征 供者和病人
收集体积(ml )
WBC(×109/L)
MNC(%)
CD34+细胞(%)
RBC(×1012/L)
PLT(×109/L)
1
, 百拇医药
214
295
25.0
1.5
0.66
1 350
327
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28.0
1.6
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986
2
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348
283
65.0
1.0
0.49
2 170
200
296
75.0
4.0
0.52
907
3
, http://www.100md.com
322
264
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2.6
0.63
2 075
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340
167
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1.2
0.42
895
, 百拇医药
5
334
123
95.0
5.0
0.61
3 700
由表2看出，收集产品中除主要含MNC外，还采集到其他一些 副产品，例如，RBC、PLT和PMN等。其中PLT的含量较高，RBC含量较少，Hct一般<5%。经验 表明，界面调整直接关系到MNC的收集效率，进而影响产品中MNC的含量。收集产品中CD 34+的百分含量较高>1.0%。
2.3 PBSC的回输与造血重建
, 百拇医药
表3列出了5名患者分别接受PBSC后造血重建时间的比较。表3 回输CD34+细胞数与造血恢复时间 病
人1)
移植类型
实际回输CD34+
细胞(×106/kg)
回输后(d)
PMN>0.5
×109/L
PLT>20
, 百拇医药 ×109/L[ ZB)
1
Allo-PBSCT
9.8
17
85
2
Allo-PBSCT
13.3
10
11
3
Allo-PBSCT
, 百拇医药
18.0
11
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6.8
12
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Allo-PBSCT
28.0
11
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, http://www.100md.com
1)1，2和3号病人分别由供者1，2和3提供PBSC。以上造血恢复时间均为回输CD 34+细胞后加用rhG-CSF 表3看出，回输CD34+细胞后，异体和自体外周血干细胞移植患者， 造血恢复时间短，回输后约10 d，PLT和PMN均得到恢复。说明表3中所输入CD34+细 胞剂量是足够的，病例1 PLT和PMN恢复较慢，可能与供受者ABO血型不合有关。
3 讨论
外周血干细胞移植(PTSCT)首要的条件是干细胞的有效动员和采集。近年国内少数 单位虽已开展了此项工作，但是干细胞的产率远不如国外，而且平均每例采集次数较多。我 们用大容量白细胞单采(Iarge volume leukapheresis,LVL)外周血干细胞，获得优良效果。 为提高MNC采集效率和终产量，采集时机的选择十分重要。为决定采集的时机，监测动员后C D34+细胞的含量十分必要。动员目的在于促使更多CD34+细胞进入外周血 。检测结果表明，5例经动员后采集时CD34+细胞含量比动员前均有大幅度增加(> 1.0%)。健康供者一般在动员后5 d，患者则在细胞因子动员后3～4 d采集，干细胞采集 效率较高。此外，采集时MNC界面的调整也与干细胞的产率密切相关。为保障一个稳定的MNC 界面，保证出血压力的稳定极为重要，如波动太大会造成MNC采集效率低。LVL是近年来为提 高干细胞产率，减少采集次数的重要手段。国外文献(Comenzo*RL和Malachouski ME)报道 ，一次LVL，终点分血量>3.5 TBV时，才可采集到足够干细胞。我们的结果显示，3倍T BV时，便可采集到供移植所需的最低值(CD34+)>5×106/kg，移植后结果表明， 患者造血功能均较快恢复。PBSCT另一个优点是产品中RBC含量少，Hct<5%ABO血型不相合的 异体移植。这个量的RBC不会引起严重后果，而且避免了BMT时去除RBC的繁锁。对7次采集MN C和CD34+细胞数相关分析显示，二者存在正相关，相关系数r=0.748(P< 0.05)。说明CD34+细胞存在于MNC细胞群体中，随MNC采集量增加而增加之势。 所以，在目前现行动员方案中，要提高CD34+细胞的产率须通过：①提高MNC采集效 率。②增加终点分血量，即进行LVL。而对没有流式细胞仪的单位，可用MNC计数代替CD 34+的测定，具有实际意义。
(编辑 张揆一)
(收稿 1999-05-10), 百拇医药