氟尿嘧啶对人结肠癌细胞凋亡及Rb蛋白表达的影响
作者：冬毕华 周军民 陈凯 唐小卿 周建国 董琳 曹建国
单位：冬毕华 周军民 陈凯 唐小卿 周建国 董琳 曹建国(衡阳医学院肿瘤研究所，湖南 衡阳421001)
关键词：大肠肿瘤；Rb蛋白；氟尿嘧啶；细胞凋亡
癌症000513
【摘要】目的：探讨氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)诱导体外人结肠癌细胞株(HIC/S)细胞凋亡与Rb蛋白表达之间的影响。方法：应用MTT比色法和琼脂培养克隆形成法检测5-Fu对HIC/S细胞增殖抑制作用；采用DNA断片法和末端标记法(TUNEL)观测5-Fu对HIC/S细胞凋亡的诱导效应。使用S-P免疫组化技术对HIC/S细胞Rb蛋白表达状态进行再证实并用Western blot法对HIC/S细胞Rb蛋白作半定量分析。结果：1.5-Fu(0.16～100.00μg/ml)显著抑制HIC/S细胞增殖和克隆形成能力，呈剂量相关性(P<0.05～0.001)。2.5-Fu(12.00μg/ml)处理HIC/S细胞48小时后出现细胞凋亡的典型“梯形条带”图谱，细胞呈现细胞凋亡的特征性蓝紫色颗粒。3.S-P免疫组化染色证实HIC/S细胞Rb蛋白表达阳性；5-Fu(12.00μg/ml)处理HIC/S细胞48小时后，可使HIC/S细胞内Rb蛋白表达量增高(曲线下面积占总面积百分比：47.0%VS21.2%)。结论：5-Fu能有效地诱导HIC/S细胞凋亡；5-Fu诱导HIC/S细胞凋亡与促进HIC/S细胞内Rb蛋白表达增高相关。
, http://www.100md.com
中图分类号：R979.1文献标识码：A文章编号：1000-467X(2000)05-0439-03
The influence of 5-fluorouracil on expression of Rb and apoptosis of colorectal cancer cells
DONG Bi-hua,et al.
(Institute of oncology Hengyang medical college, Hengyang 421001， P.R.China)
ZHOU Jun-min, CHEN Kai
(Department of Pharmacology, Hengyang Medical College, Hengyang 421001,P.R.China)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective： To investigate the roles that 5-fluorouracil (5-Fu) plays in the expression of Rb gene and inducing apoptosis of human colorectal cancer line(HIC/S) cells cultured in vitro. Methods： The MTT colorimetric assay and the agar cultured colony formation method were used to examine the growth inhibition of HIC/S cells treated with 5-Fu， and DNA fragmentation method and TUNEL staining were used to observe the apoptosis induced by 5-Fu in HIC/S cells. Expression of pRb of HIC/S cells were proved again by Streptavidin- Peroxidase(S-P) immunohistochemical method and western blot analysis of Rb protein isolated from HIC/S cells. Results： 1. 5-Fu (0.16～ 100.00 μ g/ml) inhibited significantly proliferation and colony formation of HIC/S cells, which is in dose dependente a manner (P<0.05～ 0.001). 2. HIC/S cells treatad with 5-Fu (12.00 μ g/ml) for 48 hours showed DNA fragment ladder and bluepurplish grain which are characteristric for apoptosis by DNA agrose gel electrophoresis and TUNEL staining. 3.The intracellular expression of pRb in HIC/S cells could promote treated with 5-Fu (12.00 μ g/ml) for 48 hours (relative area is 47.0% VS 21.2% ). Conclusions： 5-Fu induced significant apoptosis of HIC/S cells cultured in vitro. 5-Fu induced apoptosis of HIC/S cells was possibly involved in promoting the intracellular expression of pRb.
, 百拇医药
Key words： Colorectal neoplasms; Rb protein; 5-Fuluorouracil; Apoptosis
近年来研究发现，许多抗肿瘤药物通过引起肿瘤细胞凋亡(apoptosis)来发挥治疗作用。而肿瘤细胞凋亡与抑癌基因表达状态密切相关，其中以p53和Rb起主要调控作用[1，2]。Rb基因即视网膜母细胞瘤抑制基因。Rb蛋白是细胞周期调控和细胞分化中重要的转录调节因子，处于细胞生长和分化的中心环节。
氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)目前仍是大肠癌化疗首选的药物之一，其公认的作用机理是5-Fu在体内转变为氟尿嘧啶脱氧核苷酸，与胸腺嘧啶核苷酸合酶特异性结合，影响细胞DNA的合成，最终导致细胞死亡。李威威等报道在骨肉瘤Saos-2细胞(Rb功能被阻断)中导入RbcDNA可以促进肿瘤细胞生长减慢，诱导凋亡；转染后的Saos-2细胞对5-Fu的敏感性大大提高，其IC50值降低2.3～4.1倍，提示5-Fu可能通过调控Rb而发挥抗肿瘤作用[3]。
, 百拇医药
本文应用MTT比色法和琼脂培养克隆形成法检测5-Fu对HIC/S细胞增殖抑制作用，采用DNA断片法和末端标记法(TUNEL)观测5-Fu诱导HIC/S细胞凋亡作用，使用Westernblot技术对HIC/S细胞的Rb蛋白作半定量分析，试图阐明5-Fu诱导HIC/S细胞凋亡与Rb蛋白表达量的关系。
1材料与方法
1.1细胞
人结肠癌(HIC/S)细胞株(Rb+)细胞购自上海第二医科大学肿瘤所细胞中心，用含10%小牛血清(FCS)的M199培养基培养，5～6天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。
2.2药物和试剂
5-Fu为上海旭东海普药业有限公司产品；兔抗小鼠Rb多克隆抗体、S-P免疫组化试剂盒、TUNEL检测试剂盒购于福建迈新公司；Rb单克隆抗体(一抗)购自Santa Cruz公司；辣根酶标记羊抗鼠IgG(JA-2000)(二抗)为Jackson公司产品；碱性磷酸酶试剂盒由北京医科大学惠赠，DNA梯子提取试剂盒购于北京鼎国生物技术发展中心；标准分子量DNA由美国纪念斯隆-凯特林癌症中心李威威惠赠。
, 百拇医药
1.3MTT比色法测定和琼脂培养克隆形成法
参照文献[4]方法进行。
1.4DNA断片法测定
参照Wesenlborg[5]的方法进行。将药物处理后及对照组细胞用PBS液制成单细胞悬液，调节浓度为每毫升5×106个细胞，常规酚/氯仿法提取DNA，1.2%琼脂糖凝胶电泳后，置紫外光下观察DNA断片。
1.5TUNEL法测定
参照文献[6]方法进行。
1.6Rb蛋白Western blot法分析
收集细胞(约1×108)，按常规提取蛋白质样品、配制6%的SDS-PAGE分离胶和3%的积层胶，样品加入上样孔底，置电泳缓冲液中，80V，20min，至样品进入分离胶后，160V，1h：将与凝胶同样大小的硝酸纤维膜和滤纸浸入转印液中10min，常规方法转印，按1∶200加入Rb单抗，4℃过夜，TBS洗膜5×10min，将硝酸纤维膜浸入TBS配制的1∶2000HRP-IgG中定温作用1h，重复洗膜10min×3次，碱性磷酸酶试剂盒显色。并用密度扫描仪(ZEISS全自动图像分析仪，VIDAS数据分析)测定差异条带面积和灰度，以二者之乘积进行半定量分析。
, 百拇医药
1.7统计学处理
实验结果用
±s表示，显著性检验用方差分析。均数间比较t检验。显著性标准为P<0.05(双侧)。
2结果
2.15-Fu对HIC/S细胞增殖的影响
HIC/S细胞在每孔接种细胞数(1.25～20.00)×103范围内，与吸光度(A值)呈线性相关(r=0.956,P<0.01)；与克隆形成数亦呈线性相关(r="0.919,P<"0.001)。5Fu对HIC/S细胞生长增殖和克隆形成能力有显著抑制作用，且呈剂量相关性(见表1)。
2.25-Fu对HIC/S细胞凋亡的影响
, 百拇医药
5-Fu(12.0μg/ml)作用48小时后表现出明显的DNA“梯型条带”图谱。TUNEL染色HIC/S细胞呈特征性蓝紫颗粒，显微镜下计数1000个细胞中含
表1 5-Fu对HIC/S细胞的相对抑制率
和克隆抑制率(孵育48小时) 药物
浓度
(μg/ml)
值*
(±s)
相对抑制率
(%)
, 百拇医药
克隆数＃
(±s)
克隆
抑制率(%)
PBS
-
0.97±0.04
-
68.5±1.2
-
5-Fu
0.16
, http://www.100md.com
0.46±0.03**
52.58
42.0±1.0
38.69
5-Fu
0.80
0.37±0.02**
61.86
28.5±1.3＃＃
58.3
5-Fu
, 百拇医药 4.00
0.26±0.02**
73.20
13.7±2.3＃＃＃
79.93
5-Fu
20.00
0.17±0.02**
82.47
5.0±0.2＃＃＃
92.10
, 百拇医药
5-Fu
100.00
0.11±0.01***
88.33
1.00±0.2＃＃＃
98.06
注：n=12；*示A值均数与溶媒(PBS)对照组比较P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；＃示克隆均数与溶媒(PBS)对照组比较P<0.05，＃＃P<0.01，＃＃＃P<0.001。
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图1 5-Fu(12.00μg/ml)作用48小时TUNEL染色×40
蓝紫色颗粒细胞所占的百分比为凋亡率，凋亡率56.3%，较溶媒(PBS)对照组(8.8%)显著增高(P<0.01)。表明5Fu能有效地诱导HIC/S细胞凋亡(见图1)。
2.35-Fu对HIC/S细胞Rb蛋白表达的影响
S-P免疫组化染色HIC/S细胞株细胞涂片Rb染色中等阳性，细胞染成黄褐色。证实HIC/S细胞株细胞有Rb蛋白表达。经Western blot法测定，5-Fu(12.00μg/ml)处理48小时后，HIC/S细胞株细胞内Rb蛋白表达量升高，密度扫描仪测得曲线下面积占总面积的百分比47.7%，是溶媒(PBS)对照组(21.2%)的2.22倍。
3讨论
Rb蛋白是细胞周期和细胞分化中重要的转录调节因子，在控制细胞进入细胞分裂周期及脱离细胞周期进入分化状态中起关键作用。肿瘤中Rb蛋白缺失或功能被阻断高达40%[6]。李威威等[3]研究发现：5-Fu可能通过调控Rb而起抗肿瘤作用。
, http://www.100md.com
我们的实验结果证实：5-Fu对人结肠癌细胞株(HIC/S)细胞生长增殖具有显著抑制作用，呈剂量相关性，并能有效地诱导HIC/S细胞凋亡。经Westernblot法测定，我们发现5-Fu具有促进HIC/S细胞内Rb蛋白表达量增高作用。表明5-Fu通过增高细胞内Rb蛋白表达进而抑制细胞增生和诱导细胞凋亡可能是其抗肿瘤作用的机制之一。进一步深入研究抗肿瘤药物调控Rb蛋白量和功能与其诱导肿瘤细胞凋亡的因果关系，或许能为抗肿瘤药物筛选提供一个新的作用靶点。
[参考文献]
1，Yonich-Rouach E, Resnitzky D, Lotem J, et al. Wild- type p53 induces apoptosis of myeloid leukemic cells that is inhibitable by interleukin-6 [J]. Nature, 1991, 352∶ 345～ 347.
, 百拇医药
2，Williams GT. Programmed cell death： apoptosis and oncogenesis[J]. Cell, 1991, 65∶ 1097～ 1102.
3，Li W, Fan J, Hochhauser D, et al. Lack of functional retinoblastoma protein mediates increased resistance to antimetabolites in human sarcoma cell lines [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1995,92∶ 10436～ 10440.
4，曹建国，廖端芳，陈剑雄，等.琼脂培养MTT法测定混合培养HeLa细胞和人胚肺纤维细胞药物敏感性[J].中国肿瘤临床，1995，22(7)∶495～499.
5，Wesenlborg S, Janssen O, Kabelitz D. Induction of activation-driven death(apoptosis) in activated but not resting periperal blood T cells [J]. J Immunol 1993,150∶ 4338～ 4345.
6，周军民,曹建国,廖端芳.鬼臼乙叉甙对人结肠癌细胞增殖和凋亡的影响[J].癌症,2000,19(4)：328～330.
7，Bookstein R, Demers W, Gregory R, et al. p53 gene therapy in vivo of hepatocellular and liver metastatic colorectal cancer [J]. Semin Oncol, 1996,23∶ 66～ 77.
收稿日期：1999-09-15；修回日期：1999-10-19, 百拇医药
单位：冬毕华 周军民 陈凯 唐小卿 周建国 董琳 曹建国(衡阳医学院肿瘤研究所，湖南 衡阳421001)
关键词：大肠肿瘤；Rb蛋白；氟尿嘧啶；细胞凋亡
癌症000513
【摘要】目的：探讨氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)诱导体外人结肠癌细胞株(HIC/S)细胞凋亡与Rb蛋白表达之间的影响。方法：应用MTT比色法和琼脂培养克隆形成法检测5-Fu对HIC/S细胞增殖抑制作用；采用DNA断片法和末端标记法(TUNEL)观测5-Fu对HIC/S细胞凋亡的诱导效应。使用S-P免疫组化技术对HIC/S细胞Rb蛋白表达状态进行再证实并用Western blot法对HIC/S细胞Rb蛋白作半定量分析。结果：1.5-Fu(0.16～100.00μg/ml)显著抑制HIC/S细胞增殖和克隆形成能力，呈剂量相关性(P<0.05～0.001)。2.5-Fu(12.00μg/ml)处理HIC/S细胞48小时后出现细胞凋亡的典型“梯形条带”图谱，细胞呈现细胞凋亡的特征性蓝紫色颗粒。3.S-P免疫组化染色证实HIC/S细胞Rb蛋白表达阳性；5-Fu(12.00μg/ml)处理HIC/S细胞48小时后，可使HIC/S细胞内Rb蛋白表达量增高(曲线下面积占总面积百分比：47.0%VS21.2%)。结论：5-Fu能有效地诱导HIC/S细胞凋亡；5-Fu诱导HIC/S细胞凋亡与促进HIC/S细胞内Rb蛋白表达增高相关。
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中图分类号：R979.1文献标识码：A文章编号：1000-467X(2000)05-0439-03
The influence of 5-fluorouracil on expression of Rb and apoptosis of colorectal cancer cells
DONG Bi-hua,et al.
(Institute of oncology Hengyang medical college, Hengyang 421001， P.R.China)
ZHOU Jun-min, CHEN Kai
(Department of Pharmacology, Hengyang Medical College, Hengyang 421001,P.R.China)
, 百拇医药
【Abstract】 Objective： To investigate the roles that 5-fluorouracil (5-Fu) plays in the expression of Rb gene and inducing apoptosis of human colorectal cancer line(HIC/S) cells cultured in vitro. Methods： The MTT colorimetric assay and the agar cultured colony formation method were used to examine the growth inhibition of HIC/S cells treated with 5-Fu， and DNA fragmentation method and TUNEL staining were used to observe the apoptosis induced by 5-Fu in HIC/S cells. Expression of pRb of HIC/S cells were proved again by Streptavidin- Peroxidase(S-P) immunohistochemical method and western blot analysis of Rb protein isolated from HIC/S cells. Results： 1. 5-Fu (0.16～ 100.00 μ g/ml) inhibited significantly proliferation and colony formation of HIC/S cells, which is in dose dependente a manner (P<0.05～ 0.001). 2. HIC/S cells treatad with 5-Fu (12.00 μ g/ml) for 48 hours showed DNA fragment ladder and bluepurplish grain which are characteristric for apoptosis by DNA agrose gel electrophoresis and TUNEL staining. 3.The intracellular expression of pRb in HIC/S cells could promote treated with 5-Fu (12.00 μ g/ml) for 48 hours (relative area is 47.0% VS 21.2% ). Conclusions： 5-Fu induced significant apoptosis of HIC/S cells cultured in vitro. 5-Fu induced apoptosis of HIC/S cells was possibly involved in promoting the intracellular expression of pRb.
, 百拇医药
Key words： Colorectal neoplasms; Rb protein; 5-Fuluorouracil; Apoptosis
近年来研究发现，许多抗肿瘤药物通过引起肿瘤细胞凋亡(apoptosis)来发挥治疗作用。而肿瘤细胞凋亡与抑癌基因表达状态密切相关，其中以p53和Rb起主要调控作用[1，2]。Rb基因即视网膜母细胞瘤抑制基因。Rb蛋白是细胞周期调控和细胞分化中重要的转录调节因子，处于细胞生长和分化的中心环节。
氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)目前仍是大肠癌化疗首选的药物之一，其公认的作用机理是5-Fu在体内转变为氟尿嘧啶脱氧核苷酸，与胸腺嘧啶核苷酸合酶特异性结合，影响细胞DNA的合成，最终导致细胞死亡。李威威等报道在骨肉瘤Saos-2细胞(Rb功能被阻断)中导入RbcDNA可以促进肿瘤细胞生长减慢，诱导凋亡；转染后的Saos-2细胞对5-Fu的敏感性大大提高，其IC50值降低2.3～4.1倍，提示5-Fu可能通过调控Rb而发挥抗肿瘤作用[3]。
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本文应用MTT比色法和琼脂培养克隆形成法检测5-Fu对HIC/S细胞增殖抑制作用，采用DNA断片法和末端标记法(TUNEL)观测5-Fu诱导HIC/S细胞凋亡作用，使用Westernblot技术对HIC/S细胞的Rb蛋白作半定量分析，试图阐明5-Fu诱导HIC/S细胞凋亡与Rb蛋白表达量的关系。
1材料与方法
1.1细胞
人结肠癌(HIC/S)细胞株(Rb+)细胞购自上海第二医科大学肿瘤所细胞中心，用含10%小牛血清(FCS)的M199培养基培养，5～6天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。
2.2药物和试剂
5-Fu为上海旭东海普药业有限公司产品；兔抗小鼠Rb多克隆抗体、S-P免疫组化试剂盒、TUNEL检测试剂盒购于福建迈新公司；Rb单克隆抗体(一抗)购自Santa Cruz公司；辣根酶标记羊抗鼠IgG(JA-2000)(二抗)为Jackson公司产品；碱性磷酸酶试剂盒由北京医科大学惠赠，DNA梯子提取试剂盒购于北京鼎国生物技术发展中心；标准分子量DNA由美国纪念斯隆-凯特林癌症中心李威威惠赠。
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1.3MTT比色法测定和琼脂培养克隆形成法
参照文献[4]方法进行。
1.4DNA断片法测定
参照Wesenlborg[5]的方法进行。将药物处理后及对照组细胞用PBS液制成单细胞悬液，调节浓度为每毫升5×106个细胞，常规酚/氯仿法提取DNA，1.2%琼脂糖凝胶电泳后，置紫外光下观察DNA断片。
1.5TUNEL法测定
参照文献[6]方法进行。
1.6Rb蛋白Western blot法分析
收集细胞(约1×108)，按常规提取蛋白质样品、配制6%的SDS-PAGE分离胶和3%的积层胶，样品加入上样孔底，置电泳缓冲液中，80V，20min，至样品进入分离胶后，160V，1h：将与凝胶同样大小的硝酸纤维膜和滤纸浸入转印液中10min，常规方法转印，按1∶200加入Rb单抗，4℃过夜，TBS洗膜5×10min，将硝酸纤维膜浸入TBS配制的1∶2000HRP-IgG中定温作用1h，重复洗膜10min×3次，碱性磷酸酶试剂盒显色。并用密度扫描仪(ZEISS全自动图像分析仪，VIDAS数据分析)测定差异条带面积和灰度，以二者之乘积进行半定量分析。
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1.7统计学处理
实验结果用
±s表示，显著性检验用方差分析。均数间比较t检验。显著性标准为P<0.05(双侧)。2结果
2.15-Fu对HIC/S细胞增殖的影响
HIC/S细胞在每孔接种细胞数(1.25～20.00)×103范围内，与吸光度(A值)呈线性相关(r=0.956,P<0.01)；与克隆形成数亦呈线性相关(r="0.919,P<"0.001)。5Fu对HIC/S细胞生长增殖和克隆形成能力有显著抑制作用，且呈剂量相关性(见表1)。
2.25-Fu对HIC/S细胞凋亡的影响
, 百拇医药
5-Fu(12.0μg/ml)作用48小时后表现出明显的DNA“梯型条带”图谱。TUNEL染色HIC/S细胞呈特征性蓝紫颗粒，显微镜下计数1000个细胞中含
表1 5-Fu对HIC/S细胞的相对抑制率
和克隆抑制率(孵育48小时) 药物
浓度
(μg/ml)
值*(
±s)相对抑制率
(%)
, 百拇医药
克隆数＃
(
±s)克隆
抑制率(%)
PBS
-
0.97±0.04
-
68.5±1.2
-
5-Fu
0.16
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0.46±0.03**
52.58
42.0±1.0
38.69
5-Fu
0.80
0.37±0.02**
61.86
28.5±1.3＃＃
58.3
5-Fu
, 百拇医药 4.00
0.26±0.02**
73.20
13.7±2.3＃＃＃
79.93
5-Fu
20.00
0.17±0.02**
82.47
5.0±0.2＃＃＃
92.10
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5-Fu
100.00
0.11±0.01***
88.33
1.00±0.2＃＃＃
98.06
注：n=12；*示A值均数与溶媒(PBS)对照组比较P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；＃示克隆均数与溶媒(PBS)对照组比较P<0.05，＃＃P<0.01，＃＃＃P<0.001。
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图1 5-Fu(12.00μg/ml)作用48小时TUNEL染色×40
蓝紫色颗粒细胞所占的百分比为凋亡率，凋亡率56.3%，较溶媒(PBS)对照组(8.8%)显著增高(P<0.01)。表明5Fu能有效地诱导HIC/S细胞凋亡(见图1)。
2.35-Fu对HIC/S细胞Rb蛋白表达的影响
S-P免疫组化染色HIC/S细胞株细胞涂片Rb染色中等阳性，细胞染成黄褐色。证实HIC/S细胞株细胞有Rb蛋白表达。经Western blot法测定，5-Fu(12.00μg/ml)处理48小时后，HIC/S细胞株细胞内Rb蛋白表达量升高，密度扫描仪测得曲线下面积占总面积的百分比47.7%，是溶媒(PBS)对照组(21.2%)的2.22倍。
3讨论
Rb蛋白是细胞周期和细胞分化中重要的转录调节因子，在控制细胞进入细胞分裂周期及脱离细胞周期进入分化状态中起关键作用。肿瘤中Rb蛋白缺失或功能被阻断高达40%[6]。李威威等[3]研究发现：5-Fu可能通过调控Rb而起抗肿瘤作用。
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我们的实验结果证实：5-Fu对人结肠癌细胞株(HIC/S)细胞生长增殖具有显著抑制作用，呈剂量相关性，并能有效地诱导HIC/S细胞凋亡。经Westernblot法测定，我们发现5-Fu具有促进HIC/S细胞内Rb蛋白表达量增高作用。表明5-Fu通过增高细胞内Rb蛋白表达进而抑制细胞增生和诱导细胞凋亡可能是其抗肿瘤作用的机制之一。进一步深入研究抗肿瘤药物调控Rb蛋白量和功能与其诱导肿瘤细胞凋亡的因果关系，或许能为抗肿瘤药物筛选提供一个新的作用靶点。
[参考文献]
1，Yonich-Rouach E, Resnitzky D, Lotem J, et al. Wild- type p53 induces apoptosis of myeloid leukemic cells that is inhibitable by interleukin-6 [J]. Nature, 1991, 352∶ 345～ 347.
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2，Williams GT. Programmed cell death： apoptosis and oncogenesis[J]. Cell, 1991, 65∶ 1097～ 1102.
3，Li W, Fan J, Hochhauser D, et al. Lack of functional retinoblastoma protein mediates increased resistance to antimetabolites in human sarcoma cell lines [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1995,92∶ 10436～ 10440.
4，曹建国，廖端芳，陈剑雄，等.琼脂培养MTT法测定混合培养HeLa细胞和人胚肺纤维细胞药物敏感性[J].中国肿瘤临床，1995，22(7)∶495～499.
5，Wesenlborg S, Janssen O, Kabelitz D. Induction of activation-driven death(apoptosis) in activated but not resting periperal blood T cells [J]. J Immunol 1993,150∶ 4338～ 4345.
6，周军民,曹建国,廖端芳.鬼臼乙叉甙对人结肠癌细胞增殖和凋亡的影响[J].癌症,2000,19(4)：328～330.
7，Bookstein R, Demers W, Gregory R, et al. p53 gene therapy in vivo of hepatocellular and liver metastatic colorectal cancer [J]. Semin Oncol, 1996,23∶ 66～ 77.
收稿日期：1999-09-15；修回日期：1999-10-19, 百拇医药