Bax和TGFβRⅡ基因在肺癌组织中的移码突变
作者：陈国安 刘天菊 张伟 李申德 杨德昌 孙燕
单位：陈国安 杨德昌(西安医科大学第二附属医院呼吸科 710004)；刘天菊(美国密歇根大学医学院)；张伟 李申德 孙燕(中国医学科学院肿瘤医院)
关键词：肺肿瘤；Bax基因；TGFβRⅡ基因；微卫星DNA
中国肺癌杂志000509 【摘要】目的 探讨Bax和TGFβRⅡ基因在肺癌组织中的移码突变及其与微卫星改变的关系。方法 用PCR-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染法，检测50例肺癌组织Bax和TGFβRⅡ基因移码突变及微卫星改变。结果 Bax基因(G)8移码突变12例，占24%(12/50)，主要是碱基丢失。TGFβRⅡ的(A)10未发现移码突变。Bax移码突变与微卫星不稳定和/或杂合性缺失有密切关系(P<0.05)。结论 肺癌组织中存在Bax基因移码突变且与微卫星改变密切相关，它们在肺癌发病中可能有一定作用。
, http://www.100md.com
【中图分类号】R734.2；Q754
Bax and TGFβRⅡ frameshift mutations in lung cancer
CHEN Guoan，LIU Tianju,ZHANG Wei,LI Shende,YANG Dechang,SUN Yan
(Department of Respiratory Diseases,The Second Affiliated Hospital,Xi'an Medical University,Xi'an,Shanxi 710004,P.R.China)
【Abstract】Objective To explore frameshift mutations in the Bax and TGFβRⅡ genes and the relationship between frameshift mutations and microsatellite alterations in lung cancer.Methods Frameshift mutations and microsatellite alterations were detected in 50 primary lung cancer tissues by PCR,8% denature polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining.Results Bax gene (G)8 frameshift mutations were detected in 12 cases (24%，12/50),and all were base deletion mutations.Bax frameshift mutations correlated with microsatellite alterations (P<0.05).TGFβRⅡ (A)10 frameshift mutations were not found.Conclusion Bax gene frameshift mutations are found in lung cancer,and closely correlate with microsatellite alterations.Bax gene and microsatellite might play a certain role in carcinogenesis of lung cancer.
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【Key words】Lung neoplasms Bax gene TGFβRⅡ gene Microsatellite
Bax基因和转化生长因子βⅡ型受体(TGFβRⅡ)基因分别有促进细胞凋亡和抑制肿瘤细胞生长的作用，若发生突变或功能降低，将失去抗肿瘤生长作用。近来发现在结肠癌中，其突变热点分别位于基因编码区(G)8和(A)10，以丢失或插入为主，导致的移码突变与微卫星及错配修复基因改变有关[1]。肺癌中是否存在这一现象，鲜有报道。我们对50例肺癌Bax和TGFβRⅡ基因的移码突变及微卫星改变进行检测，探讨Bax和TGFβRⅡ基因在肺癌组织中的移码突变及其与微卫星改变的关系。
1 材料与方法
1.1 研究对象 50例原发性肺癌及相应的远离癌组织的正常肺组织，均经病理确诊。标本取自中国医学科学院肿瘤医院(1997年3月～5月)，术后1～3小时内获得，-70℃冰箱保存。鳞癌25例，腺癌19例，腺鳞癌5例，小细胞肺癌1例。男39例，女11例，年龄36～71岁。术前均未做过放疗或化疗。按1997年UICC标准进行TNM分期，均为Ⅰ～ⅢA期。
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1.2 Bax和TGFβRⅡ基因移码突变检测 引物设计：Bax和TGFβRⅡ移码突变位点分别是(G)8和(A)10，均位于基因编码区，主要观察移码突变情况，引物序列见表1。组织DNA提取、PCR、8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色均同微卫星检测[2]。结果判断：Bax和TGFβRⅡ基因在外显子上，显示一条带为正常，两条带则为移码突变，其中异常带在正常带前，为丢失突变，若异常带在后，则为插入突变[3]。
1.3 微卫星DNA检测 本组病例的微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI)和杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)检测方法及结果见文献2。统计学处理用χ2检验。
表1 Bax和TGFβRⅡ引物序列
Tab 1 The primer sequence of Bax and TGFβRⅡ Genes
, http://www.100md.com
Primer sequence
(5′3′)
Anneling tem.
(℃)
Size(bp)
Bax
ATCCAGGATCGAGCAGGGCG
58
94
ACTCGCTCAGCTTCTTGGTG
TGFβRⅡ
AAGCTCCCCTACCATGACT
, 百拇医药
55
118
TGCACTCATCAGAGCTACAG
2 结果
肺癌组织中Bax基因第三外显子(G)8移码突变12例，占24%(12/50)。未发现TGFβRⅡ的(A)10有移码突变，见图1。Bax移码突变主要是碱基丢失所致，未发现碱基插入突变。因未测序，不知具体的碱基丢失情况。Bax移码突变与肺癌组织类型、分化程度、临床分期及淋巴结转移无明显关系。
图1 肺癌组织中Bax与TGFβRⅡ基因移码突变分析(8% PAGE)
N：正常肺组织；T：肺癌组织。Bax基因在T2～T6和T8有突变带，TGFβRⅡ无突变带。
, 百拇医药
Fig 1 Frameshift mutations of Bax and TGFβRⅡ genes in lung cancer tissues (8% PAGE)
N:Normal lung tissues; T:Lung cancer tissues.Bax mutations were found in T2～T6 and T8 samples.TGFβRⅡ mutations was not found.
在所检测的6个微卫星位点中，MSI和/或LOH发生率为48%(24/50)。12例肺癌Bax基因突变者中有9例(75%，9/12)为MSI和/或LOH(≥2个位点)阳性，而在38例无Bax基因突变者中，只有15例(39.5%，15/38)为MSI和/或LOH阳性，两者差异有显著性(P<0.05，表2)。
, 百拇医药 表2 肺癌Bax突变与MSI和/或LOH的关系
Tab 2 The relationship between Bax mutations
and MSI and/or LOH in lung cancer Bax mutation
MSI and/or LOH(≥2 loci)
+(%)
-
Positive
9(75)
3
Negative
, 百拇医药
15(39.5)
23
χ2＝4.61，P<0.05
3 讨论
Bax基因属于细胞凋亡相关基因，可调节Bcl-2基因对细胞凋亡的抑制作用，其功能是受p53激活后，促进细胞凋亡。若Bax基因突变，功能丧失，细胞就持续生长而不凋亡。Bax基因突变与MSI、MMR基因突变密切相关，在MSI阳性的结肠癌中，Bax基因中的(G)8有51%发生移码突变[4～6]。在我们所测的50例肺癌中，Bax的(G)8突变率为24%，ⅢA期及有淋巴结转移者，突变率有增高趋势，因例数少未做统计学处理。有微卫星改变者，其Bax突变率为75%，较无微卫星改变者(39.5%)明显增高(P<0.05)，说明微卫星改变与Bax基因突变有密切关系。Bax移码突变主要是碱基丢失所致，未发现碱基插入突变。因未测序，不知丢失几个G。文献报道多是(G)8的1～3个G的丢失或插入。从我们的结果可推测Bax基因与MSI发生密切相关，在肺癌发病中可能有一定作用。
, 百拇医药
TGFβ对肿瘤生长有抑制作用，可能是通过诱导p15基因表达实现的。TGFβRⅡ突变，使TGFβ不能起作用，可能是致癌的原因之一。TGFβRⅡ基因在伴有MSI的结肠癌病例中的(A)10移码突变率为70.0%(23/33)，而在整个结肠癌人群中只有6.7%(30/450)[7～9]。本研究未发现TGFβRⅡ基因的(A)10在肺癌组织中有突变。TGFβRⅡ基因突变是否发生在其它部位及其在肺癌发病中的作用有待进一步研究。
总之，本研究初步确定了Bax基因在肺癌组织中有移码突变，且与微卫星改变有关。进一步研究其它微卫星靶基因(如错配修复基因hMSH3和hMSH6、IGFⅡR、PTEN和APC等)在肺癌中的改变及其与微卫星和错配修复基因的关系，对于揭示肺癌发病机理具有重要意义。
本研究受国家自然科学基金(39500065)资助
, 百拇医药 参考文献
1，Rampino N,Yamamoto H,Ionov Y,et al.Somatic frameshift mutations in the BAX gene in colon cancers of the microsatellite mutator phenotype.Science,1997,275(5302)∶967-969.
2，陈国安，孙燕，李申德，等.肺癌组织中微卫星DNA的改变.中华结核和呼吸杂志，1999，22(3)∶166-168.
3，Brimmell M,Mendiola R,Mangion J,et al.Bax frameshift mutations in cell lines derived from human haemopoietic malignancies are associated with resistance to apoptosis and microsatellite instability.Oncogene,1998,16(14)∶1803-1812.
, http://www.100md.com
4，Imai Y,Tsurutani N,Oda H,et al.Genetic instability and mutation of the TGF-β-receptor-Ⅱ gene in ampullary carcinomas.Int J Cancer,1998,76(3)∶407-411.
5，Yamamoto H,Sawai H,Perucho M.Frameshift somatic mutations in gastrointestinal cancer of the microsatellite mutator phenotype.Cancer Res,1997,57(19)∶4420-4426.
6，Grady WM,Myeroff LL,Swinler SE,et al.Mutational inactivation of transforming growth factor β receptor type Ⅱ in microsatellite stable colon cancers.Cancer Res,1999,59(2)∶320-324.
, 百拇医药
7，Amendt C,Schirmacher P,Weber H,et al.Expression of a dominant negative type Ⅱ TGF-β receptor in mouse skin results in an increase in carcinoma incidence and an acceleration of carcinoma development.Oncogene,1998,17(1)∶25-34.
8，Percesepe A,Kristo P,Aaltonen LA,et al.Mismatch repair genes and mononucleotide tracts as mutation targets in colorectal tumors with different degrees of microsatellite instability.Oncogene,1998,17(2)∶157-163.
9，Salomons GS,Buitenhuis CK,Martinez Munoz C,et al.Mutational analysis of Bax and Bcl-2 in childhood acute lymphoblastic leukaemia.Int J Cancer (Pred Oncol),1998,79(3)∶273-277.
收稿日期：1999-11-08
修回日期：2000-02-28, http://www.100md.com
单位：陈国安 杨德昌(西安医科大学第二附属医院呼吸科 710004)；刘天菊(美国密歇根大学医学院)；张伟 李申德 孙燕(中国医学科学院肿瘤医院)
关键词：肺肿瘤；Bax基因；TGFβRⅡ基因；微卫星DNA
中国肺癌杂志000509 【摘要】目的 探讨Bax和TGFβRⅡ基因在肺癌组织中的移码突变及其与微卫星改变的关系。方法 用PCR-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染法，检测50例肺癌组织Bax和TGFβRⅡ基因移码突变及微卫星改变。结果 Bax基因(G)8移码突变12例，占24%(12/50)，主要是碱基丢失。TGFβRⅡ的(A)10未发现移码突变。Bax移码突变与微卫星不稳定和/或杂合性缺失有密切关系(P<0.05)。结论 肺癌组织中存在Bax基因移码突变且与微卫星改变密切相关，它们在肺癌发病中可能有一定作用。
, http://www.100md.com
【中图分类号】R734.2；Q754
Bax and TGFβRⅡ frameshift mutations in lung cancer
CHEN Guoan，LIU Tianju,ZHANG Wei,LI Shende,YANG Dechang,SUN Yan
(Department of Respiratory Diseases,The Second Affiliated Hospital,Xi'an Medical University,Xi'an,Shanxi 710004,P.R.China)
【Abstract】Objective To explore frameshift mutations in the Bax and TGFβRⅡ genes and the relationship between frameshift mutations and microsatellite alterations in lung cancer.Methods Frameshift mutations and microsatellite alterations were detected in 50 primary lung cancer tissues by PCR,8% denature polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining.Results Bax gene (G)8 frameshift mutations were detected in 12 cases (24%，12/50),and all were base deletion mutations.Bax frameshift mutations correlated with microsatellite alterations (P<0.05).TGFβRⅡ (A)10 frameshift mutations were not found.Conclusion Bax gene frameshift mutations are found in lung cancer,and closely correlate with microsatellite alterations.Bax gene and microsatellite might play a certain role in carcinogenesis of lung cancer.
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【Key words】Lung neoplasms Bax gene TGFβRⅡ gene Microsatellite
Bax基因和转化生长因子βⅡ型受体(TGFβRⅡ)基因分别有促进细胞凋亡和抑制肿瘤细胞生长的作用，若发生突变或功能降低，将失去抗肿瘤生长作用。近来发现在结肠癌中，其突变热点分别位于基因编码区(G)8和(A)10，以丢失或插入为主，导致的移码突变与微卫星及错配修复基因改变有关[1]。肺癌中是否存在这一现象，鲜有报道。我们对50例肺癌Bax和TGFβRⅡ基因的移码突变及微卫星改变进行检测，探讨Bax和TGFβRⅡ基因在肺癌组织中的移码突变及其与微卫星改变的关系。
1 材料与方法
1.1 研究对象 50例原发性肺癌及相应的远离癌组织的正常肺组织，均经病理确诊。标本取自中国医学科学院肿瘤医院(1997年3月～5月)，术后1～3小时内获得，-70℃冰箱保存。鳞癌25例，腺癌19例，腺鳞癌5例，小细胞肺癌1例。男39例，女11例，年龄36～71岁。术前均未做过放疗或化疗。按1997年UICC标准进行TNM分期，均为Ⅰ～ⅢA期。
, http://www.100md.com
1.2 Bax和TGFβRⅡ基因移码突变检测 引物设计：Bax和TGFβRⅡ移码突变位点分别是(G)8和(A)10，均位于基因编码区，主要观察移码突变情况，引物序列见表1。组织DNA提取、PCR、8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色均同微卫星检测[2]。结果判断：Bax和TGFβRⅡ基因在外显子上，显示一条带为正常，两条带则为移码突变，其中异常带在正常带前，为丢失突变，若异常带在后，则为插入突变[3]。
1.3 微卫星DNA检测 本组病例的微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI)和杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)检测方法及结果见文献2。统计学处理用χ2检验。
表1 Bax和TGFβRⅡ引物序列
Tab 1 The primer sequence of Bax and TGFβRⅡ Genes
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Primer sequence
(5′3′)
Anneling tem.
(℃)
Size(bp)
Bax
ATCCAGGATCGAGCAGGGCG
58
94
ACTCGCTCAGCTTCTTGGTG
TGFβRⅡ
AAGCTCCCCTACCATGACT
, 百拇医药
55
118
TGCACTCATCAGAGCTACAG
2 结果
肺癌组织中Bax基因第三外显子(G)8移码突变12例，占24%(12/50)。未发现TGFβRⅡ的(A)10有移码突变，见图1。Bax移码突变主要是碱基丢失所致，未发现碱基插入突变。因未测序，不知具体的碱基丢失情况。Bax移码突变与肺癌组织类型、分化程度、临床分期及淋巴结转移无明显关系。
图1 肺癌组织中Bax与TGFβRⅡ基因移码突变分析(8% PAGE)
N：正常肺组织；T：肺癌组织。Bax基因在T2～T6和T8有突变带，TGFβRⅡ无突变带。
, 百拇医药
Fig 1 Frameshift mutations of Bax and TGFβRⅡ genes in lung cancer tissues (8% PAGE)
N:Normal lung tissues; T:Lung cancer tissues.Bax mutations were found in T2～T6 and T8 samples.TGFβRⅡ mutations was not found.
在所检测的6个微卫星位点中，MSI和/或LOH发生率为48%(24/50)。12例肺癌Bax基因突变者中有9例(75%，9/12)为MSI和/或LOH(≥2个位点)阳性，而在38例无Bax基因突变者中，只有15例(39.5%，15/38)为MSI和/或LOH阳性，两者差异有显著性(P<0.05，表2)。
, 百拇医药 表2 肺癌Bax突变与MSI和/或LOH的关系
Tab 2 The relationship between Bax mutations
and MSI and/or LOH in lung cancer Bax mutation
MSI and/or LOH(≥2 loci)
+(%)
-
Positive
9(75)
3
Negative
, 百拇医药
15(39.5)
23
χ2＝4.61，P<0.05
3 讨论
Bax基因属于细胞凋亡相关基因，可调节Bcl-2基因对细胞凋亡的抑制作用，其功能是受p53激活后，促进细胞凋亡。若Bax基因突变，功能丧失，细胞就持续生长而不凋亡。Bax基因突变与MSI、MMR基因突变密切相关，在MSI阳性的结肠癌中，Bax基因中的(G)8有51%发生移码突变[4～6]。在我们所测的50例肺癌中，Bax的(G)8突变率为24%，ⅢA期及有淋巴结转移者，突变率有增高趋势，因例数少未做统计学处理。有微卫星改变者，其Bax突变率为75%，较无微卫星改变者(39.5%)明显增高(P<0.05)，说明微卫星改变与Bax基因突变有密切关系。Bax移码突变主要是碱基丢失所致，未发现碱基插入突变。因未测序，不知丢失几个G。文献报道多是(G)8的1～3个G的丢失或插入。从我们的结果可推测Bax基因与MSI发生密切相关，在肺癌发病中可能有一定作用。
, 百拇医药
TGFβ对肿瘤生长有抑制作用，可能是通过诱导p15基因表达实现的。TGFβRⅡ突变，使TGFβ不能起作用，可能是致癌的原因之一。TGFβRⅡ基因在伴有MSI的结肠癌病例中的(A)10移码突变率为70.0%(23/33)，而在整个结肠癌人群中只有6.7%(30/450)[7～9]。本研究未发现TGFβRⅡ基因的(A)10在肺癌组织中有突变。TGFβRⅡ基因突变是否发生在其它部位及其在肺癌发病中的作用有待进一步研究。
总之，本研究初步确定了Bax基因在肺癌组织中有移码突变，且与微卫星改变有关。进一步研究其它微卫星靶基因(如错配修复基因hMSH3和hMSH6、IGFⅡR、PTEN和APC等)在肺癌中的改变及其与微卫星和错配修复基因的关系，对于揭示肺癌发病机理具有重要意义。
本研究受国家自然科学基金(39500065)资助
, 百拇医药 参考文献
1，Rampino N,Yamamoto H,Ionov Y,et al.Somatic frameshift mutations in the BAX gene in colon cancers of the microsatellite mutator phenotype.Science,1997,275(5302)∶967-969.
2，陈国安，孙燕，李申德，等.肺癌组织中微卫星DNA的改变.中华结核和呼吸杂志，1999，22(3)∶166-168.
3，Brimmell M,Mendiola R,Mangion J,et al.Bax frameshift mutations in cell lines derived from human haemopoietic malignancies are associated with resistance to apoptosis and microsatellite instability.Oncogene,1998,16(14)∶1803-1812.
, http://www.100md.com
4，Imai Y,Tsurutani N,Oda H,et al.Genetic instability and mutation of the TGF-β-receptor-Ⅱ gene in ampullary carcinomas.Int J Cancer,1998,76(3)∶407-411.
5，Yamamoto H,Sawai H,Perucho M.Frameshift somatic mutations in gastrointestinal cancer of the microsatellite mutator phenotype.Cancer Res,1997,57(19)∶4420-4426.
6，Grady WM,Myeroff LL,Swinler SE,et al.Mutational inactivation of transforming growth factor β receptor type Ⅱ in microsatellite stable colon cancers.Cancer Res,1999,59(2)∶320-324.
, 百拇医药
7，Amendt C,Schirmacher P,Weber H,et al.Expression of a dominant negative type Ⅱ TGF-β receptor in mouse skin results in an increase in carcinoma incidence and an acceleration of carcinoma development.Oncogene,1998,17(1)∶25-34.
8，Percesepe A,Kristo P,Aaltonen LA,et al.Mismatch repair genes and mononucleotide tracts as mutation targets in colorectal tumors with different degrees of microsatellite instability.Oncogene,1998,17(2)∶157-163.
9，Salomons GS,Buitenhuis CK,Martinez Munoz C,et al.Mutational analysis of Bax and Bcl-2 in childhood acute lymphoblastic leukaemia.Int J Cancer (Pred Oncol),1998,79(3)∶273-277.
收稿日期：1999-11-08
修回日期：2000-02-28, http://www.100md.com