螺旋藻酸性杂多糖的分离纯化和分析
作者：张文雄 梁宏 覃海错 黄文榜
单位：广西师范大学化学化工系 桂林 541004
关键词：螺旋藻 酸性杂多糖 PSP1 PSP2
中草药000503摘 要 螺旋藻藻粉经热水抽提，乙醇沉淀，Sevag法去蛋白质，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀得酸性杂多糖，再经DEAE-纤维素柱层析分级纯化两次得多糖PSP1和PSP2。PSP1和PSP2经HPLC的Carbohydrate Analysis 柱层析为单一对称峰，证明为均一多糖。纸层析和硫酸-咔唑反应分析表明：PSP1主要由D-半乳糖、D-甘露糖、葡萄糖醛酸及D-葡萄糖四种残基组成，比例为2.1∶3.0∶1.9∶2.8；PSP2主要由D-甘露糖和葡萄糖醛酸两种残基组成，比例为6.2∶3.8。由粘度法测得其分子量分别为12 400和16 800。IR、1HNMR和13CNMR证明：SP11主要含α型糖苷键及部分β型糖苷键，PSP2主要含α型糖苷键。
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Separation, Purification and Structural Analysis of Acidic
Heteropolysaccharides from Spirulina platensis
Zhang Wenxiong, Liang Hong, Qin Haicuo and Huang Wenbang
(Department of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi Normal University Guilin 541004)
Abstract Crude polysaccharides were prepared by ethanol precipitation of the hot water extract of powdered Spirulina platensis and deproteinized by Sevag method. Complex acidic heteropolysaccharides of S. platensis (PSP1) and (PSP2) were then obtained by further treatment with cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) and chromatographed on DEAE-cellulose column. Their homogeneity was proved by HPLC carbohydrate analysis. Their mean molecular weights were estimated to be 12 400 and 16 800, respectively. According to paper partition chromatography (PPC) and Dische analysis, PSP1 proved to be composed of D-galactose, D-mannose, glucuronic acid and D-glucose in a molar ratio of about 2.1∶3.0∶1.9∶2.8 and PSP2 was composed of D-mannose and glucuronic acid in a molar ratio of about 6.2∶3.8. IR, 1HNMR and 13CNMR indicated that PSP1 had α and β configurations, and PSP2 had α configuration.
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Key words Spirulina platensis, S. platensis polysaccharide1 (PSP1) S. platensis polysaccharide2 (PSP2)
螺旋藻的主要成分是蛋白质，占干重的60%～70%，且包含人体所需的8 种氨基酸及多种生物活性物质，具有特殊的医疗保健作用[1]。后经发现，螺旋藻化学成分中尤其引人注意的是占2.0%～3.0%的螺旋藻多糖。螺旋藻多糖是从螺旋藻中分离纯化的一种水溶性酸性杂多糖，为一种白色粉末状物质，对人体无毒，具有显著的抗辐射、抗突变功能，可用于防癌、抗衰老、增强机体免疫力等方面[2]。因此，它在实践应用上具有诱人的前景。目前，国内外对螺旋藻进行了多方面的研究，但对螺旋藻多糖的研究尚不够充分，对如何提高多糖得率，多糖的化学组成，结构性质及其与生理功能之间的内在联系等方面仍有许多工作需要探索。
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1 材料与方法
1.1 多糖的分离，分级和纯化：螺旋藻藻粉购自广西北海市绿海生物保健食品有限责任公司。取100 g藻粉加7 倍体积的水于80 ℃水浴中搅拌加热4 h，如此重复3 次。离心，收集上清液，减压浓缩至适当体积，加3～5倍体积的95%乙醇沉淀，收集沉淀，溶解于水，对蒸馏水透析2 d，未透过的部分按Sevag法去除蛋白质[3]，然后用蒸馏水透析2 d，3～5倍体积95%乙醇沉淀，静置过夜，离心收集沉淀，以乙醇、丙酮相继洗涤，室温真空干燥得粗多糖样品。配成2.5%多糖溶液，滴加1.5%CTAB溶液，37 ℃保温24 h，离心得沉淀，1 mol/L MgCl2溶液溶解，用蒸馏水透析2 d，浓缩，在DEAE-纤维素柱上层析，用0～2 mol/L NaCl分段洗脱，得2 个多糖PSP1和PSP2。然后用蒸馏水透析2 d，减压浓缩至适当体积，再分别经DEAE-纤维素柱层析1 次，收集多糖部分洗脱液，用蒸馏水透析2 d，减压浓缩，乙醇沉淀，室温真空干燥得纯化多糖PSP1和PSP2。
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1.2 多糖纯度鉴定及分子量测定：本实验用高效液相色谱仪鉴定多糖纯度。高效液相色谱仪为HP1100，Carbohydrate Analysis 色谱柱，HP1047A型示差折光检测器，HP化学工作站数据处理，流动相为CH3CN-H2O=80：20，流速为1.8 mL/min。
粘度法测定多糖分子量[4]：称取样品PSP10.1 113 g，PSP20.090 g溶于水，定容至50 mL于25 ℃恒温，用乌氏粘度计测定流出时间，作图，由公式[η]=KMηα求得。
1.3 部分理化性质的测定：通过硫酸-咔唑反应[5]和茚三酮反应分别检测己糖醛酸、氨基酸及肽的存在。
1.4 多糖的组成分析：分别称取PSP1和PSP2 10 mg，加入2 mol/L硫酸5 mL封管110 ℃水解6 h，碳酸钡中和，滤液浓缩后点样于层析纸(10 cm×35 cm，Whatman 1号滤纸)，并用多种常见标准单糖作对照。溶剂系统为正丁醇-醋酸-水=4∶1∶5，显色剂为苯胺-邻苯二甲酸正丁醇饱和水溶液105 ℃喷雾显色10 min。
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1.5 红外光谱测定：在NICOLET-5DX型红外光谱仪上进行，样品用KBr压片
1.6 1HNMR和13CNMR测定：以D2O为溶剂，TMS为内标，在INOVA500NB核磁共振仪上记录。
2 结果与讨论
2.1 PSP1和PSP2为白色粉末，易溶于水。硫酸-咔唑反应呈阴性，证明不含氨基酸或肽。PSP1和PSP2分别经HPLC分析结果为单一对称峰(图1)，证明为均一多糖。由粘度法测得其分子量分别为12 400和16 800。紫外扫描无260 nm的核酸特征吸收峰和280 nm的蛋白质特征吸收峰。
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图1 多糖PSP1和PSP2在Carbohydrate Analy-sis柱上的HPLC图
1-D-葡萄糖
2-D-半乳糖
3-D-甘露糖
4-葡萄糖醛酸
5-PSP1
6-PSP2
图2 多糖PSP1和PSP2经完全酸水解后纸层析色谱图
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2.2 纸层析(图2)结果表明，PSP1的糖基组成为：D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖及葡萄糖醛酸；PSP2的糖基组成为：D-甘露糖、葡萄糖醛酸。
2.3 红外谱图分析PSP1和PSP2均具有多糖类物质的特征吸收峰。PSP1的IR谱图分析如下：3 444 cm-1(ν-OH)，2 973 cm-1，2 938 cm-1(ν-C-H)，1 710 cm-1(νCOOH)，1 651 cm-1(酰胺羰基)，1 530 cm-1(δN-H)，1 454 cm-1，1 250 cm-1(δC-H)，1 412 cm-1(羧基的νC-O)，1 131 cm-1，1 053 cm-1(νC-O-H，νC-O-C)，885 cm-1(吡喃环β端基差向异构体的δC-H)，834 cm-1(α端基差向异构体的δC-H)。PSP2的谱图分析如下：3 409 cm-1(ν-OH)，2 938 cm-1(νC-H)，1 700 cm-1(νCOOH)，1 651 cm-1(ν-NHCOCH3)，1 525 cm-1(δN-H)，1 489 cm-1，1 377 cm-1，1 243 cm-1(δC-H)，1 419 cm-1(羧基的νC-O)，1 173 cm-1，1 060 cm-1(νC-O-H，νC-O-C)，837 cm-1(α端基差向异构体的δC-H)。
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2.4 1HNMR和13CNMR谱图分析：PSP1和PSP2的1HNMR谱图分析这2 种多糖为杂多糖，多糖PSP1的4 种单糖残基的C1上质子的信号化学位移是5.1，5.0，4.9，4.8，PSP2为5.0，4.9，3.2～4.5难于辨认。13CNMR谱图分析：PSP1化学位移在97～105之间，主要出现4 个峰，化学位移分别是103.8，100.4，99.7，97.0，分别为D-半乳糖、D-甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖C1上的化学位移，通过抗门控实验技术，由峰的相对高度可推知这4 种单糖残基的比例约为2.1∶3.0∶1.9∶2.8，与文献[6]组成基本相符。174.5为羧基碳的化学位移。PSP2主要由3 种单糖残基组成，化学位移是100.3，96.9，它们分别是D-甘露糖和葡萄糖醛酸C1上的化学位移，172为羧基碳的化学位移，通过抗门控实验技术，由峰的相对高度可推知这2 种糖残基组成比例约为6.2∶3.8。
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2.5 结论：本文首次从螺旋藻中得到2 个酸性杂多糖PSP1和PSP2，PSP1与文献[6]组成相似，但由IR、1HNMR和13CNMR得出PSP1含α型和β型糖苷键(文献仅α型)，PSP2是一种新的杂多糖，主要含α型糖苷键。2 种多糖的活性测定有待进一步研究。
致谢：中山大学测试中心为样品测试。
Address: Zhang Wenxiong, Department of Chemistry and Chemical Ind ustry, Guangxi Normal University, Guilin
△ 广西高校自然科学基金资助项目(桂教高科[1995]408号)
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张文雄 1973年生，1996年毕业于湖南师范大学化学系，当年入广西师范大学攻读有机化学 硕士研究生。从事螺旋藻的研究与开发工作，已发表相关文章3 篇。1999年入南开大学化学 系攻读有机专业博士研究生。
参 考 文 献
1，Riccardi G, et al. J Bacteriolog,1981,147:1001
2，郭宝江，等.植物学报，1992，34(10)：809
3，Whistler L R. Removal of Protein:Sevage Method in Carbonhydrate Chemistry. Acadmic Press, New York and London, 1965,v. 25
4，复旦大学等编.物理化学实验.北京：高等教育出版社，1993：177
5，Oische Z J. J Biol Chem, 1947,167:189
6，庞启深，等.生物化学与生物物理学报，1989，21(5)：45
(收稿1999-06-15), 百拇医药
单位：广西师范大学化学化工系 桂林 541004
关键词：螺旋藻 酸性杂多糖 PSP1 PSP2
中草药000503摘 要 螺旋藻藻粉经热水抽提，乙醇沉淀，Sevag法去蛋白质，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀得酸性杂多糖，再经DEAE-纤维素柱层析分级纯化两次得多糖PSP1和PSP2。PSP1和PSP2经HPLC的Carbohydrate Analysis 柱层析为单一对称峰，证明为均一多糖。纸层析和硫酸-咔唑反应分析表明：PSP1主要由D-半乳糖、D-甘露糖、葡萄糖醛酸及D-葡萄糖四种残基组成，比例为2.1∶3.0∶1.9∶2.8；PSP2主要由D-甘露糖和葡萄糖醛酸两种残基组成，比例为6.2∶3.8。由粘度法测得其分子量分别为12 400和16 800。IR、1HNMR和13CNMR证明：SP11主要含α型糖苷键及部分β型糖苷键，PSP2主要含α型糖苷键。
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Separation, Purification and Structural Analysis of Acidic
Heteropolysaccharides from Spirulina platensis
Zhang Wenxiong, Liang Hong, Qin Haicuo and Huang Wenbang
(Department of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi Normal University Guilin 541004)
Abstract Crude polysaccharides were prepared by ethanol precipitation of the hot water extract of powdered Spirulina platensis and deproteinized by Sevag method. Complex acidic heteropolysaccharides of S. platensis (PSP1) and (PSP2) were then obtained by further treatment with cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) and chromatographed on DEAE-cellulose column. Their homogeneity was proved by HPLC carbohydrate analysis. Their mean molecular weights were estimated to be 12 400 and 16 800, respectively. According to paper partition chromatography (PPC) and Dische analysis, PSP1 proved to be composed of D-galactose, D-mannose, glucuronic acid and D-glucose in a molar ratio of about 2.1∶3.0∶1.9∶2.8 and PSP2 was composed of D-mannose and glucuronic acid in a molar ratio of about 6.2∶3.8. IR, 1HNMR and 13CNMR indicated that PSP1 had α and β configurations, and PSP2 had α configuration.
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Key words Spirulina platensis, S. platensis polysaccharide1 (PSP1) S. platensis polysaccharide2 (PSP2)
螺旋藻的主要成分是蛋白质，占干重的60%～70%，且包含人体所需的8 种氨基酸及多种生物活性物质，具有特殊的医疗保健作用[1]。后经发现，螺旋藻化学成分中尤其引人注意的是占2.0%～3.0%的螺旋藻多糖。螺旋藻多糖是从螺旋藻中分离纯化的一种水溶性酸性杂多糖，为一种白色粉末状物质，对人体无毒，具有显著的抗辐射、抗突变功能，可用于防癌、抗衰老、增强机体免疫力等方面[2]。因此，它在实践应用上具有诱人的前景。目前，国内外对螺旋藻进行了多方面的研究，但对螺旋藻多糖的研究尚不够充分，对如何提高多糖得率，多糖的化学组成，结构性质及其与生理功能之间的内在联系等方面仍有许多工作需要探索。
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1 材料与方法
1.1 多糖的分离，分级和纯化：螺旋藻藻粉购自广西北海市绿海生物保健食品有限责任公司。取100 g藻粉加7 倍体积的水于80 ℃水浴中搅拌加热4 h，如此重复3 次。离心，收集上清液，减压浓缩至适当体积，加3～5倍体积的95%乙醇沉淀，收集沉淀，溶解于水，对蒸馏水透析2 d，未透过的部分按Sevag法去除蛋白质[3]，然后用蒸馏水透析2 d，3～5倍体积95%乙醇沉淀，静置过夜，离心收集沉淀，以乙醇、丙酮相继洗涤，室温真空干燥得粗多糖样品。配成2.5%多糖溶液，滴加1.5%CTAB溶液，37 ℃保温24 h，离心得沉淀，1 mol/L MgCl2溶液溶解，用蒸馏水透析2 d，浓缩，在DEAE-纤维素柱上层析，用0～2 mol/L NaCl分段洗脱，得2 个多糖PSP1和PSP2。然后用蒸馏水透析2 d，减压浓缩至适当体积，再分别经DEAE-纤维素柱层析1 次，收集多糖部分洗脱液，用蒸馏水透析2 d，减压浓缩，乙醇沉淀，室温真空干燥得纯化多糖PSP1和PSP2。
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1.2 多糖纯度鉴定及分子量测定：本实验用高效液相色谱仪鉴定多糖纯度。高效液相色谱仪为HP1100，Carbohydrate Analysis 色谱柱，HP1047A型示差折光检测器，HP化学工作站数据处理，流动相为CH3CN-H2O=80：20，流速为1.8 mL/min。
粘度法测定多糖分子量[4]：称取样品PSP10.1 113 g，PSP20.090 g溶于水，定容至50 mL于25 ℃恒温，用乌氏粘度计测定流出时间，作图，由公式[η]=KMηα求得。
1.3 部分理化性质的测定：通过硫酸-咔唑反应[5]和茚三酮反应分别检测己糖醛酸、氨基酸及肽的存在。
1.4 多糖的组成分析：分别称取PSP1和PSP2 10 mg，加入2 mol/L硫酸5 mL封管110 ℃水解6 h，碳酸钡中和，滤液浓缩后点样于层析纸(10 cm×35 cm，Whatman 1号滤纸)，并用多种常见标准单糖作对照。溶剂系统为正丁醇-醋酸-水=4∶1∶5，显色剂为苯胺-邻苯二甲酸正丁醇饱和水溶液105 ℃喷雾显色10 min。
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1.5 红外光谱测定：在NICOLET-5DX型红外光谱仪上进行，样品用KBr压片
1.6 1HNMR和13CNMR测定：以D2O为溶剂，TMS为内标，在INOVA500NB核磁共振仪上记录。
2 结果与讨论
2.1 PSP1和PSP2为白色粉末，易溶于水。硫酸-咔唑反应呈阴性，证明不含氨基酸或肽。PSP1和PSP2分别经HPLC分析结果为单一对称峰(图1)，证明为均一多糖。由粘度法测得其分子量分别为12 400和16 800。紫外扫描无260 nm的核酸特征吸收峰和280 nm的蛋白质特征吸收峰。
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图1 多糖PSP1和PSP2在Carbohydrate Analy-sis柱上的HPLC图
1-D-葡萄糖
2-D-半乳糖
3-D-甘露糖
4-葡萄糖醛酸
5-PSP1
6-PSP2
图2 多糖PSP1和PSP2经完全酸水解后纸层析色谱图
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2.2 纸层析(图2)结果表明，PSP1的糖基组成为：D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖及葡萄糖醛酸；PSP2的糖基组成为：D-甘露糖、葡萄糖醛酸。
2.3 红外谱图分析PSP1和PSP2均具有多糖类物质的特征吸收峰。PSP1的IR谱图分析如下：3 444 cm-1(ν-OH)，2 973 cm-1，2 938 cm-1(ν-C-H)，1 710 cm-1(νCOOH)，1 651 cm-1(酰胺羰基)，1 530 cm-1(δN-H)，1 454 cm-1，1 250 cm-1(δC-H)，1 412 cm-1(羧基的νC-O)，1 131 cm-1，1 053 cm-1(νC-O-H，νC-O-C)，885 cm-1(吡喃环β端基差向异构体的δC-H)，834 cm-1(α端基差向异构体的δC-H)。PSP2的谱图分析如下：3 409 cm-1(ν-OH)，2 938 cm-1(νC-H)，1 700 cm-1(νCOOH)，1 651 cm-1(ν-NHCOCH3)，1 525 cm-1(δN-H)，1 489 cm-1，1 377 cm-1，1 243 cm-1(δC-H)，1 419 cm-1(羧基的νC-O)，1 173 cm-1，1 060 cm-1(νC-O-H，νC-O-C)，837 cm-1(α端基差向异构体的δC-H)。
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2.4 1HNMR和13CNMR谱图分析：PSP1和PSP2的1HNMR谱图分析这2 种多糖为杂多糖，多糖PSP1的4 种单糖残基的C1上质子的信号化学位移是5.1，5.0，4.9，4.8，PSP2为5.0，4.9，3.2～4.5难于辨认。13CNMR谱图分析：PSP1化学位移在97～105之间，主要出现4 个峰，化学位移分别是103.8，100.4，99.7，97.0，分别为D-半乳糖、D-甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖C1上的化学位移，通过抗门控实验技术，由峰的相对高度可推知这4 种单糖残基的比例约为2.1∶3.0∶1.9∶2.8，与文献[6]组成基本相符。174.5为羧基碳的化学位移。PSP2主要由3 种单糖残基组成，化学位移是100.3，96.9，它们分别是D-甘露糖和葡萄糖醛酸C1上的化学位移，172为羧基碳的化学位移，通过抗门控实验技术，由峰的相对高度可推知这2 种糖残基组成比例约为6.2∶3.8。
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2.5 结论：本文首次从螺旋藻中得到2 个酸性杂多糖PSP1和PSP2，PSP1与文献[6]组成相似，但由IR、1HNMR和13CNMR得出PSP1含α型和β型糖苷键(文献仅α型)，PSP2是一种新的杂多糖，主要含α型糖苷键。2 种多糖的活性测定有待进一步研究。
致谢：中山大学测试中心为样品测试。
Address: Zhang Wenxiong, Department of Chemistry and Chemical Ind ustry, Guangxi Normal University, Guilin
△ 广西高校自然科学基金资助项目(桂教高科[1995]408号)
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张文雄 1973年生，1996年毕业于湖南师范大学化学系，当年入广西师范大学攻读有机化学 硕士研究生。从事螺旋藻的研究与开发工作，已发表相关文章3 篇。1999年入南开大学化学 系攻读有机专业博士研究生。
参 考 文 献
1，Riccardi G, et al. J Bacteriolog,1981,147:1001
2，郭宝江，等.植物学报，1992，34(10)：809
3，Whistler L R. Removal of Protein:Sevage Method in Carbonhydrate Chemistry. Acadmic Press, New York and London, 1965,v. 25
4，复旦大学等编.物理化学实验.北京：高等教育出版社，1993：177
5，Oische Z J. J Biol Chem, 1947,167:189
6，庞启深，等.生物化学与生物物理学报，1989，21(5)：45
(收稿1999-06-15), 百拇医药