筛选抗HBV药物的外周血单个核细胞体外培养系统的建立
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南京医科大学学报 2000年第5期第20卷 短篇论著
作者：邢益平 黄祖瑚 唐保元 李锡官 孙志坚 奚安义
单位：南京医科大学第一附属医院传染病科，南京 210029
关键词：肝炎病毒；乙型；磷甲酸钠；外周血单个核细胞；药物筛选
南京医科大学学报000530 由于乙型肝炎病毒(HBV)宿主范围狭小，主要对人类和黑猩猩易感，因而为抗HBV药物筛选的研究带来了很大的困难。本文探索建立了一种利用乙型肝炎病人外周血单个核细胞(PBMC)进行体外培养来筛选抗HBV药物的新系统，取得了一定的效果。
1 资料和方法
病例：选自1996年本科收治住院的慢性乙型肝炎病人，共20例。
PBMC分离与培养：无菌抽取病人外周静脉血10 ml，常规法分离并培养PBMC，连续培养3天，分别收集培养上清及细胞，-20℃保存备检。
, 百拇医药
药物：试验药物为磷甲酸钠(PFA)、阿昔洛韦、肝炎灵注射液、注射用蜂毒、干扰素α-2b(IFN)，以上各药物均用培养液稀释成不同浓度(表1)，分别加入各实验孔内，同时设空白对照。 HBV-DNA检测：选用斑点杂交法和PCR法。
HBsAg、HBeAg检测：采用酶联免疫测定法。
2 结 果
培养系统中HBV标志物的检测：20例中，无论培养上清还是培养细胞，HBsAg、HBeAg、HBV-DNA(斑点杂交法)检测均为阴性，但用PCR法测定时，20例培养上清中有16例HBV-DNA阳性。20例培养的PBMC细胞中均呈HBV-DNA强阳性。
5种药物对HBV-DNA的影响：对培养上清中检测到HBV-DNA(PCR法)的16例病人均进行药物筛选试验。结果表明，5种受检药物中仅PFA能明显抑制培养上清中的HBV-DNA，而且抑制呈剂量依赖性，其余4种则未见抑制效应(表1)。PBMC培养细胞中，所有5种受检药物和对照组均呈HBV-DNA阳性，未见差异。
, 百拇医药
表1 5种药物对PBMC培养上清中HBV-DNA(PCR)的影响 药物
药物浓度(HBV-DNA)
PFA
0.1(-)
0.1×5-1(-)
0.1×5-2(-)
0.1×5-3(-)
0.1×5-4(+)
对照(+)
阿昔洛韦
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0.1(+)
0.1×5-1(+)
0.1×5-2(+)
0.1×5-3(+)
0.1×5-4(+)
对照(+)
蜂毒
0.1(+)
0.1×5-1(+)
0.1×5-2(+)
, 百拇医药
0.1×5-3(+)
0.1×5-4(+)
对照(+)
肝炎灵
1∶10(+)
1∶100(+)
1∶1000(+)
1∶100000(+)
对照(+)
IFN
10(+)
100(+)
, 百拇医药
1000(+)
10000(+)
对照(+)
PFA、阿昔洛韦、蜂毒浓度均为g.L-1，IFN浓度为IU.ml-1，肝炎灵为稀释倍数。
5种药物对培养细胞的毒性作用：在5种受检药物的实验浓度范围内，培养细胞生长良好，均未见明显毒性作用。
3 讨 论
目前已建立了几种体外抗HBV药物筛选系统，如原代肝细胞体外培养和转染细胞株等，但前者方法条件严格，材料来源困难，而后者的HBV-DNA在细胞内的存在状态与自然感染时不同。因此，本文建立了乙型肝炎病人外周血PBMC体外培养系统来筛选抗HBV药物。结果显示在培养系统的上清液和培养细胞中均能检测到HBV-DNA，提示培养细胞中存在着乙型肝炎病毒复制，并且能将病毒分泌到上清液中，表明该培养系统基本代表了乙型肝炎病毒在体内感染、复制和分泌过程，因而可以用来作为一个抗HBV药物的筛选系统。
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初步药物筛选实验表明，应用不同的5种药物进行抗病毒试验，仅PFA显示出明显的抑制病毒复制作用，而肝炎灵、阿昔洛韦、蜂毒、干扰素α-2b则未见对PBMC内病毒复制有抑制作用。
我们认为，由于PFA可以与病毒DNA聚合酶的焦磷酸盐结合位点形成复合物，封闭病毒引物模板的延伸[1]，直接抑制了PBMC中HBV-DNA复制，使培养系统的上清液中HBV-DNA阴转。而干扰素的抗病毒作用主要通过诱导抗病毒蛋白和蛋白激酶如2′5′-寡腺苷酸合成酶等，调节其他细胞因子如IL-6、TNF[2]，诱导感染细胞膜HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ类抗原表达，提高机体巨噬细胞和自然杀伤细胞的数量和活性，加强细胞毒T淋巴细胞反应[3]。IFN抗病毒作用需要有机体整个免疫系统的参与。因而干扰素在短暂的体外培养系统中没有表现出明显的病毒抑制作用。
在本系统中未能从培养上清中检测到乙型肝炎病毒的表达蛋白，如HBsAg\,HBeAg等，主要原因可能是与乙肝病人体内有大量肝细胞不同，体外培养的PBMC数量毕竟有限，HBsAg\,HBeAg表达量极少，尚不能达到目前检测方法的敏感性。
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本系统共用16例病人PBMC反复进行药物筛选验证，结果完全一致，说明方法可靠，且具有以下优点：①取材方便，方法简单易行；②培养系统中乙型肝炎病毒为自然感染，能真实地反映人体内感染的实际状态，避免了转染与自然感染的差异；③观察指标为HBV-DNA，直接反映药物的抗病毒效应。
参考文献
1，Justman J, Zabezhanskaya M. Image in clinical medicine. N Engl J Med, 1999, 340(16):1253
2，Ferenci P. Have we achieved the optimal dosing of interferon in hepatitis C? Viral Hepatitis Reviews, 1999, 5(4):229
3，Davis G, Hoofnagle J. Interferon in viral hepatitis: role in pathogenesis and treatment. Hepatology, 1986, 6(5):1038
(1999-12-09收稿)
江苏省教委自然科学基金资助项目(No 93085)
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单位：南京医科大学第一附属医院传染病科，南京 210029
关键词：肝炎病毒；乙型；磷甲酸钠；外周血单个核细胞；药物筛选
南京医科大学学报000530 由于乙型肝炎病毒(HBV)宿主范围狭小，主要对人类和黑猩猩易感，因而为抗HBV药物筛选的研究带来了很大的困难。本文探索建立了一种利用乙型肝炎病人外周血单个核细胞(PBMC)进行体外培养来筛选抗HBV药物的新系统，取得了一定的效果。
1 资料和方法
病例：选自1996年本科收治住院的慢性乙型肝炎病人，共20例。
PBMC分离与培养：无菌抽取病人外周静脉血10 ml，常规法分离并培养PBMC，连续培养3天，分别收集培养上清及细胞，-20℃保存备检。
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药物：试验药物为磷甲酸钠(PFA)、阿昔洛韦、肝炎灵注射液、注射用蜂毒、干扰素α-2b(IFN)，以上各药物均用培养液稀释成不同浓度(表1)，分别加入各实验孔内，同时设空白对照。 HBV-DNA检测：选用斑点杂交法和PCR法。
HBsAg、HBeAg检测：采用酶联免疫测定法。
2 结 果
培养系统中HBV标志物的检测：20例中，无论培养上清还是培养细胞，HBsAg、HBeAg、HBV-DNA(斑点杂交法)检测均为阴性，但用PCR法测定时，20例培养上清中有16例HBV-DNA阳性。20例培养的PBMC细胞中均呈HBV-DNA强阳性。
5种药物对HBV-DNA的影响：对培养上清中检测到HBV-DNA(PCR法)的16例病人均进行药物筛选试验。结果表明，5种受检药物中仅PFA能明显抑制培养上清中的HBV-DNA，而且抑制呈剂量依赖性，其余4种则未见抑制效应(表1)。PBMC培养细胞中，所有5种受检药物和对照组均呈HBV-DNA阳性，未见差异。
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表1 5种药物对PBMC培养上清中HBV-DNA(PCR)的影响 药物
药物浓度(HBV-DNA)
PFA
0.1(-)
0.1×5-1(-)
0.1×5-2(-)
0.1×5-3(-)
0.1×5-4(+)
对照(+)
阿昔洛韦
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0.1(+)
0.1×5-1(+)
0.1×5-2(+)
0.1×5-3(+)
0.1×5-4(+)
对照(+)
蜂毒
0.1(+)
0.1×5-1(+)
0.1×5-2(+)
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0.1×5-3(+)
0.1×5-4(+)
对照(+)
肝炎灵
1∶10(+)
1∶100(+)
1∶1000(+)
1∶100000(+)
对照(+)
IFN
10(+)
100(+)
, 百拇医药
1000(+)
10000(+)
对照(+)
PFA、阿昔洛韦、蜂毒浓度均为g.L-1，IFN浓度为IU.ml-1，肝炎灵为稀释倍数。
5种药物对培养细胞的毒性作用：在5种受检药物的实验浓度范围内，培养细胞生长良好，均未见明显毒性作用。
3 讨 论
目前已建立了几种体外抗HBV药物筛选系统，如原代肝细胞体外培养和转染细胞株等，但前者方法条件严格，材料来源困难，而后者的HBV-DNA在细胞内的存在状态与自然感染时不同。因此，本文建立了乙型肝炎病人外周血PBMC体外培养系统来筛选抗HBV药物。结果显示在培养系统的上清液和培养细胞中均能检测到HBV-DNA，提示培养细胞中存在着乙型肝炎病毒复制，并且能将病毒分泌到上清液中，表明该培养系统基本代表了乙型肝炎病毒在体内感染、复制和分泌过程，因而可以用来作为一个抗HBV药物的筛选系统。
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初步药物筛选实验表明，应用不同的5种药物进行抗病毒试验，仅PFA显示出明显的抑制病毒复制作用，而肝炎灵、阿昔洛韦、蜂毒、干扰素α-2b则未见对PBMC内病毒复制有抑制作用。
我们认为，由于PFA可以与病毒DNA聚合酶的焦磷酸盐结合位点形成复合物，封闭病毒引物模板的延伸[1]，直接抑制了PBMC中HBV-DNA复制，使培养系统的上清液中HBV-DNA阴转。而干扰素的抗病毒作用主要通过诱导抗病毒蛋白和蛋白激酶如2′5′-寡腺苷酸合成酶等，调节其他细胞因子如IL-6、TNF[2]，诱导感染细胞膜HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ类抗原表达，提高机体巨噬细胞和自然杀伤细胞的数量和活性，加强细胞毒T淋巴细胞反应[3]。IFN抗病毒作用需要有机体整个免疫系统的参与。因而干扰素在短暂的体外培养系统中没有表现出明显的病毒抑制作用。
在本系统中未能从培养上清中检测到乙型肝炎病毒的表达蛋白，如HBsAg\,HBeAg等，主要原因可能是与乙肝病人体内有大量肝细胞不同，体外培养的PBMC数量毕竟有限，HBsAg\,HBeAg表达量极少，尚不能达到目前检测方法的敏感性。
, http://www.100md.com
本系统共用16例病人PBMC反复进行药物筛选验证，结果完全一致，说明方法可靠，且具有以下优点：①取材方便，方法简单易行；②培养系统中乙型肝炎病毒为自然感染，能真实地反映人体内感染的实际状态，避免了转染与自然感染的差异；③观察指标为HBV-DNA，直接反映药物的抗病毒效应。
参考文献
1，Justman J, Zabezhanskaya M. Image in clinical medicine. N Engl J Med, 1999, 340(16):1253
2，Ferenci P. Have we achieved the optimal dosing of interferon in hepatitis C? Viral Hepatitis Reviews, 1999, 5(4):229
3，Davis G, Hoofnagle J. Interferon in viral hepatitis: role in pathogenesis and treatment. Hepatology, 1986, 6(5):1038
(1999-12-09收稿)
江苏省教委自然科学基金资助项目(No 93085)
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