脐血LAK细胞的制备及其生物活性的测定
作者：祁岩超 李铮 田培 周文 陈汉奎
单位：(广东省广州市肿瘤医院 510095)
关键词：脐血；LAK细胞；生物活性
广东医学000514 【摘要】 目的 寻找新的高效杀伤活性的细胞，探讨脐血单个核细胞作为LAK细胞前体细胞的可行性和意义。方法 分离的脐血单个核细胞，分别用IL-2和IL-2+IFNα诱导LAK细胞，并于培养后d 2, 4, 7, 11, 14分别测其细胞扩增数量和对K562细胞的杀伤活性。结果 于培养后d 11时，脐血单个核细胞的扩增倍数最高，两组分别为培养前的20倍和25倍，其对K562的杀伤活性分别为对照组培养前的2.7倍和3.5倍。结论 ①脐血单个核细胞是良好的LAK细胞的前体细胞；②其细胞数量和杀伤能力在培养的d 11达高峰；③IL-2+IFNα组的细胞数量和杀伤活性优于单用IL-2组。
, 百拇医药 Preparation and bioactivity assay of LAK cell from umbilical blood
Qi Yanchao Li Zheng Tian Pei et al
( Guangzhou Tumor Hospital, Guangzhou 510095)
【Abstract】 Objective To seek new activated killer cells, the feasibility of preparing LAK cell from umbilical blood was explored. Methods IL-2 and IL-2+IFN-α was used to induce LAK cells from umbilical blood mononuclear cells. The number and bio-activity of LAK cell were examined on the 2nd, 4th, 7th, 11th, 14th day after culture. Results The number of LAK cell and bio-activity of killing cancer cell (K562) reached their peaks on 11th day. The cell number and the cancer cell killing activity were greater in the IL-2+IFN-α group than those in IL-2 group.Conclusion ①The umbilical mononuclear cells is a good source for LAK cell;②The cell number and killing activity of umbilical blood LAK cells reach their peaks on the 11th day after culture;③The cell number and the killing activity are greater in IL-2+IFN-α group than those in the IL-2 group.
, 百拇医药
【Key words】 Umbilical blood LAK cell Bio-activity
肿瘤的生物治疗是继手术、放疗和化疗后的第四种有前途的新疗法，国内外有资料表明，它既可以成为一种有独特疗效的主体疗法，又可以作为一种有特异疗效的辅助疗法。到目前为止，使用最多，而且临床疗效比较肯定的主要是LAK细胞疗法[1]。为了提高肿瘤生物治疗的水平和LAK细胞的临床疗效，我们对脐血LAK细胞的制备及其生物学性质进行了研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和材料 CO2恒温培养箱，日本Hikama公司；倒置显微镜，日本Olympus公司；MB-Ⅲ型酶标仪，北京新技术应用研究所；超净工作台，恒温水浴锅，离心机均为国产。K562细胞株，本室培养；基因工程白细胞介素-2(IL-2)，北京中化合通公司；基因重组α-干扰素(IFNα)，沈阳三生制药公司；RPMI-1640培养基，Gibco公司；Ficoll-hypaque(淋细胞分离液)，上海试剂二厂，D=1.077；人AB血清，广州中心血站提供。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 脐血采集 脐血取自29名正常足月妊娠健康产妇，于胎儿娩出断脐消毒后，选择较粗脐静脉穿刺，封闭式采取血液入无菌肝素抗凝血袋中。采血量40～95 ml/份，平均58 ml/份。
1.2.2 LAK细胞制备及实验室分组 用Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液(2 000 r/min)，分离出脐血单个核细胞，再用RPMI-1640培养液离心洗涤2次，用含有5%人AB血清的RPMI-1640培养液调细胞含量为5×106/ml，分3组进行实验，①对照组：RPMI-1640培养液；②IL-2组：培养液含IL-2 1 000 μ/ml；③IL-2+IFNα组：培养液含IL-2和IFNα各1 000 μ/ml， 37℃， 5% CO2条件下培养，分别于d 2,4, 7,11,14测细胞扩增情况及LAK细胞的NK杀伤活性。
, 百拇医药 1.2.3 LAK细胞的NK活性测定 靶细胞为K562细胞，常规培养于5%小牛血清的RPMI-1640培养基中，选生长良好的K562细胞，调细胞含量为5×105/ml备用。效应细胞为脐血LAK细胞，调细胞含量为5×106/ml备用。LAK细胞的NK活性检测法参照王新江的方法[2]：具体方法为取96孔培养板，实验组每孔加入效应细胞(LAK)和靶细胞(K562)悬液各0.1 ml，效靶比为10∶1。同时设对照组和空白组，对照组为单纯靶细胞(K562)0.1 ml+0.1 ml RPMI-1640培养液；空白组为单纯效应细胞(LAK) 0.1 ml+0.1 ml RPMI-1640培养液，每组均设3个平行管，于37℃，5% CO2条件下作用4 h，吸弃0.1 ml上清后，于每孔加入MTT储液10 μl，37 ℃，5% CO2条件下再孵育2 h，再加入酸化异丙醇100 μl，溶解甲赞颗粒，然后用MB-Ⅲ型酶标仪(570 nm)测OD值，按下式计算LAK细胞的NK杀伤率：
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1.3 统计学处理方法 计量资料以
±s表示，其组间比较采用t检验。
2 结果
2.1 LAK细胞的形态观察 ①对照组脐血单核细胞培养过程中未见明显的形态改变，无不规则形，三角形细胞，成团现象较少。②IL-2组LAK细胞于培养d 2，数量未见明显增加，有少数细胞体积增大，细胞成团现象较少。d 4～5，细胞数量明显增多，且细胞团增多，折光性增强，细胞形态出现不规则和三角形等。③IL-2+IFNα组，培养d 2即出现数量明显增加，细胞体积明显增大，且有抱团现象，d 4～5，细胞数量持续增多，成团的细胞集落呈蘑菇状，由培养瓶底面向上生长，细胞体积增大，细胞形态不规则。
2.2 脐血LAK细胞的增殖能力 于培养的d 2，4，7， 11， 14分别计算活细胞数，发现细胞数目到d 11达到最高峰，实验组细胞数分别达到原始细胞数的20倍和25倍；d 14细胞数目有所下降。见表1。
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表1 不同培养时间脐血LAK细胞的扩增倍数±s
d 2
d 4
d 7
d 11
d 14
对照组
0.7±0.1
1.9±0.3
3.2±1.0
5.4±1.9
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2.8±0.9
IL-2组
1.3±0.2
2.3±0.4
6.3±3.3
19.81±3.1
7.8±3.1
IL-2+IFNα组
1.6±0.2
3.0±0.4
8.8±1.0
25.36±3.5
, 百拇医药
21.5±2.4
各组间比较，P<0.01
2.3 脐血LAK细胞的杀伤活性 于培养的d 2，4，7， 11，14分别用MTT法测脐血LAK细胞的杀伤活性，发现其于培养的d 11时两组LAK细胞活性最高，分别为对照组培养d 2的2.7倍和3.5倍，d 14时略有下降，见表2。
表2 不同培养时间脐血LAK细胞的杀伤率 (±s)%
d 2
d 4
d 7
d 11
, 百拇医药
d 14
对照组
27.3±1.9
32.1±1.8
40.6±2.1
42.7±2.2
30.0±1.9
IL-2组
29.5±1.9
41.3±1.6
70.1±2.7
72.2±2.3
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66.3±2.1
IL-2+IFNα组
47.7±1.7
59.7±1.8
82.0±2.3
96.1±3.3
81.2±1.6
各组间比较，P<0.01
3 讨论
LAK细胞的实验和临床应用研究已成为肿瘤生物治疗的一个重要内容，受到了广泛的重视，并取得了一定的成效。但把脐血作为LAK细胞前体细胞的基础和临床应用研究的文章尚少。
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我们的研究结果发现，脐血单个核细胞在IL-2的作用下，其细胞数量和对K562的杀伤能力都有明显提高，其细胞数量于d 4,7, 11 分别增长2倍，6倍，20倍，即d 11增殖率最高，但d 14略有下降，而在IL-2+IFNα的作用下，其增殖速度更快，也是在d 7～11增殖率最高，11 d时达25倍，同样d 14的细胞数略有下降。这和赵丽[3]用IL-2和CD3单克隆抗体制备脐血LAK细胞在培养的d 3～4增殖率最高的情况下略有不同，其增殖高峰出现较早是否CD3单克隆抗体作用，有待进一步讨论。
从表2可以看出，单纯IL-2作用下，脐血LAK细胞的杀伤活性d 2达30%，d 4达40%。但本研究的脐血LAK细胞的杀伤活性高峰在培养的d 11，其杀伤活性达72.2%(IL-2组)。而在IL-2+IFNα共同作用的脐血LAK细胞的杀伤活性又进一步提高到96.1%。
结果表明：①脐血单个核细胞在IL-2的作用下有较强的增殖能力和明显的杀癌细胞的生物活性；②在IL-2+IFNα共同作用下其增殖能力和生物活性会更进一步提高。
, 百拇医药
所以我们认为，脐血来源丰富，体外增殖速度快，容易达到治疗数量，抗肿瘤活性强，临床效果会更明显，是一种很有潜力的LAK细胞的前体细胞。用脐血制备LAK细胞进行规范的肿瘤生物治疗是一种可行的方法。
参考文献
1，杜 平. 生物治疗法的地位. 见：曹广文，杜 平，主编. 现代癌症生物治疗学. 北京：人民军医出版社，1995.6
2，王新江. 用MTT比色法检测人NK细胞活性. 中华实验和临床病毒学杂志， 1992， 6(1)：69
3，赵 丽. 脐血LAK细胞和CD3AK细胞的制备及杀伤活性的研究. 第五届全国血液学学术会论文摘要汇编， 1996. 228
收稿日期：1999-10-25, 百拇医药
单位：(广东省广州市肿瘤医院 510095)
关键词：脐血；LAK细胞；生物活性
广东医学000514 【摘要】 目的 寻找新的高效杀伤活性的细胞，探讨脐血单个核细胞作为LAK细胞前体细胞的可行性和意义。方法 分离的脐血单个核细胞，分别用IL-2和IL-2+IFNα诱导LAK细胞，并于培养后d 2, 4, 7, 11, 14分别测其细胞扩增数量和对K562细胞的杀伤活性。结果 于培养后d 11时，脐血单个核细胞的扩增倍数最高，两组分别为培养前的20倍和25倍，其对K562的杀伤活性分别为对照组培养前的2.7倍和3.5倍。结论 ①脐血单个核细胞是良好的LAK细胞的前体细胞；②其细胞数量和杀伤能力在培养的d 11达高峰；③IL-2+IFNα组的细胞数量和杀伤活性优于单用IL-2组。
, 百拇医药 Preparation and bioactivity assay of LAK cell from umbilical blood
Qi Yanchao Li Zheng Tian Pei et al
( Guangzhou Tumor Hospital, Guangzhou 510095)
【Abstract】 Objective To seek new activated killer cells, the feasibility of preparing LAK cell from umbilical blood was explored. Methods IL-2 and IL-2+IFN-α was used to induce LAK cells from umbilical blood mononuclear cells. The number and bio-activity of LAK cell were examined on the 2nd, 4th, 7th, 11th, 14th day after culture. Results The number of LAK cell and bio-activity of killing cancer cell (K562) reached their peaks on 11th day. The cell number and the cancer cell killing activity were greater in the IL-2+IFN-α group than those in IL-2 group.Conclusion ①The umbilical mononuclear cells is a good source for LAK cell;②The cell number and killing activity of umbilical blood LAK cells reach their peaks on the 11th day after culture;③The cell number and the killing activity are greater in IL-2+IFN-α group than those in the IL-2 group.
, 百拇医药
【Key words】 Umbilical blood LAK cell Bio-activity
肿瘤的生物治疗是继手术、放疗和化疗后的第四种有前途的新疗法，国内外有资料表明，它既可以成为一种有独特疗效的主体疗法，又可以作为一种有特异疗效的辅助疗法。到目前为止，使用最多，而且临床疗效比较肯定的主要是LAK细胞疗法[1]。为了提高肿瘤生物治疗的水平和LAK细胞的临床疗效，我们对脐血LAK细胞的制备及其生物学性质进行了研究，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要仪器和材料 CO2恒温培养箱，日本Hikama公司；倒置显微镜，日本Olympus公司；MB-Ⅲ型酶标仪，北京新技术应用研究所；超净工作台，恒温水浴锅，离心机均为国产。K562细胞株，本室培养；基因工程白细胞介素-2(IL-2)，北京中化合通公司；基因重组α-干扰素(IFNα)，沈阳三生制药公司；RPMI-1640培养基，Gibco公司；Ficoll-hypaque(淋细胞分离液)，上海试剂二厂，D=1.077；人AB血清，广州中心血站提供。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 脐血采集 脐血取自29名正常足月妊娠健康产妇，于胎儿娩出断脐消毒后，选择较粗脐静脉穿刺，封闭式采取血液入无菌肝素抗凝血袋中。采血量40～95 ml/份，平均58 ml/份。
1.2.2 LAK细胞制备及实验室分组 用Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液(2 000 r/min)，分离出脐血单个核细胞，再用RPMI-1640培养液离心洗涤2次，用含有5%人AB血清的RPMI-1640培养液调细胞含量为5×106/ml，分3组进行实验，①对照组：RPMI-1640培养液；②IL-2组：培养液含IL-2 1 000 μ/ml；③IL-2+IFNα组：培养液含IL-2和IFNα各1 000 μ/ml， 37℃， 5% CO2条件下培养，分别于d 2,4, 7,11,14测细胞扩增情况及LAK细胞的NK杀伤活性。
, 百拇医药 1.2.3 LAK细胞的NK活性测定 靶细胞为K562细胞，常规培养于5%小牛血清的RPMI-1640培养基中，选生长良好的K562细胞，调细胞含量为5×105/ml备用。效应细胞为脐血LAK细胞，调细胞含量为5×106/ml备用。LAK细胞的NK活性检测法参照王新江的方法[2]：具体方法为取96孔培养板，实验组每孔加入效应细胞(LAK)和靶细胞(K562)悬液各0.1 ml，效靶比为10∶1。同时设对照组和空白组，对照组为单纯靶细胞(K562)0.1 ml+0.1 ml RPMI-1640培养液；空白组为单纯效应细胞(LAK) 0.1 ml+0.1 ml RPMI-1640培养液，每组均设3个平行管，于37℃，5% CO2条件下作用4 h，吸弃0.1 ml上清后，于每孔加入MTT储液10 μl，37 ℃，5% CO2条件下再孵育2 h，再加入酸化异丙醇100 μl，溶解甲赞颗粒，然后用MB-Ⅲ型酶标仪(570 nm)测OD值，按下式计算LAK细胞的NK杀伤率：
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1.3 统计学处理方法 计量资料以
±s表示，其组间比较采用t检验。2 结果
2.1 LAK细胞的形态观察 ①对照组脐血单核细胞培养过程中未见明显的形态改变，无不规则形，三角形细胞，成团现象较少。②IL-2组LAK细胞于培养d 2，数量未见明显增加，有少数细胞体积增大，细胞成团现象较少。d 4～5，细胞数量明显增多，且细胞团增多，折光性增强，细胞形态出现不规则和三角形等。③IL-2+IFNα组，培养d 2即出现数量明显增加，细胞体积明显增大，且有抱团现象，d 4～5，细胞数量持续增多，成团的细胞集落呈蘑菇状，由培养瓶底面向上生长，细胞体积增大，细胞形态不规则。
2.2 脐血LAK细胞的增殖能力 于培养的d 2，4，7， 11， 14分别计算活细胞数，发现细胞数目到d 11达到最高峰，实验组细胞数分别达到原始细胞数的20倍和25倍；d 14细胞数目有所下降。见表1。
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表1 不同培养时间脐血LAK细胞的扩增倍数
±sd 2
d 4
d 7
d 11
d 14
对照组
0.7±0.1
1.9±0.3
3.2±1.0
5.4±1.9
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2.8±0.9
IL-2组
1.3±0.2
2.3±0.4
6.3±3.3
19.81±3.1
7.8±3.1
IL-2+IFNα组
1.6±0.2
3.0±0.4
8.8±1.0
25.36±3.5
, 百拇医药
21.5±2.4
各组间比较，P<0.01
2.3 脐血LAK细胞的杀伤活性 于培养的d 2，4，7， 11，14分别用MTT法测脐血LAK细胞的杀伤活性，发现其于培养的d 11时两组LAK细胞活性最高，分别为对照组培养d 2的2.7倍和3.5倍，d 14时略有下降，见表2。
表2 不同培养时间脐血LAK细胞的杀伤率 (
±s)%d 2
d 4
d 7
d 11
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d 14
对照组
27.3±1.9
32.1±1.8
40.6±2.1
42.7±2.2
30.0±1.9
IL-2组
29.5±1.9
41.3±1.6
70.1±2.7
72.2±2.3
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66.3±2.1
IL-2+IFNα组
47.7±1.7
59.7±1.8
82.0±2.3
96.1±3.3
81.2±1.6
各组间比较，P<0.01
3 讨论
LAK细胞的实验和临床应用研究已成为肿瘤生物治疗的一个重要内容，受到了广泛的重视，并取得了一定的成效。但把脐血作为LAK细胞前体细胞的基础和临床应用研究的文章尚少。
, http://www.100md.com
我们的研究结果发现，脐血单个核细胞在IL-2的作用下，其细胞数量和对K562的杀伤能力都有明显提高，其细胞数量于d 4,7, 11 分别增长2倍，6倍，20倍，即d 11增殖率最高，但d 14略有下降，而在IL-2+IFNα的作用下，其增殖速度更快，也是在d 7～11增殖率最高，11 d时达25倍，同样d 14的细胞数略有下降。这和赵丽[3]用IL-2和CD3单克隆抗体制备脐血LAK细胞在培养的d 3～4增殖率最高的情况下略有不同，其增殖高峰出现较早是否CD3单克隆抗体作用，有待进一步讨论。
从表2可以看出，单纯IL-2作用下，脐血LAK细胞的杀伤活性d 2达30%，d 4达40%。但本研究的脐血LAK细胞的杀伤活性高峰在培养的d 11，其杀伤活性达72.2%(IL-2组)。而在IL-2+IFNα共同作用的脐血LAK细胞的杀伤活性又进一步提高到96.1%。
结果表明：①脐血单个核细胞在IL-2的作用下有较强的增殖能力和明显的杀癌细胞的生物活性；②在IL-2+IFNα共同作用下其增殖能力和生物活性会更进一步提高。
, 百拇医药
所以我们认为，脐血来源丰富，体外增殖速度快，容易达到治疗数量，抗肿瘤活性强，临床效果会更明显，是一种很有潜力的LAK细胞的前体细胞。用脐血制备LAK细胞进行规范的肿瘤生物治疗是一种可行的方法。
参考文献
1，杜 平. 生物治疗法的地位. 见：曹广文，杜 平，主编. 现代癌症生物治疗学. 北京：人民军医出版社，1995.6
2，王新江. 用MTT比色法检测人NK细胞活性. 中华实验和临床病毒学杂志， 1992， 6(1)：69
3，赵 丽. 脐血LAK细胞和CD3AK细胞的制备及杀伤活性的研究. 第五届全国血液学学术会论文摘要汇编， 1996. 228
收稿日期：1999-10-25, 百拇医药