王氏管精子优选法的应用及效果
作者：韦相才 田佩玲 陈平乐 杨卫 朱嘉铭
单位：(广东省计划生育科学技术研究所 510600)
关键词：精子优选；上游法；王氏管法
广东医学000511 【摘要】 目的 探讨王氏管精子优选法在精子优选的应用，并与传统的精子上游法进行比较。方法 随机选择57份精液，采用两种方法进行配对处理，比较两种方法分离前后、两者间精子活动率、形态以及精子顶体形态和精子染色质等参数的变化。结果 两种方法处理后的精子活动率、精子形态差异有显著性(P<0.01)，王氏管法处理后精子顶体完整率、正常染色质率亦显示出显著的差异(P<0.01)。结论 王氏管精子优选法和精子上游法在精子处理中获得较好的精子质量，而王氏管精子优选法则获得更优质的精子，且具有方便操作实用的特点。
Effects analysis of Wang tube sperm separating system in practice
, 百拇医药
Wei Xiangcai Tian Peiling Chen Pingle et al
(Family Planning Research Institute of Guangdong, Guangzhou, 510600)
【Abstract】 Objective To study and compare swim-up and Wang tube techniques in sperm separation. Methods 57 samples of semen were treated by two methods. Several characteristics of semen including sperm count, motility, morphology, acrosin morphology and normal chromatin were analyzed. Results There was significant difference between pre-treatment and post-treatment in both methods in terms of sperm motility and morphology. There was also significant difference on acrosin morphology and normal chromatin chromatin in Wang tube method, but not in swim-up method. Conclusion Both Wang tube and swim-up methods improve sperm quality, but Wang tube is superior to swim-up, especially in recovery rate of arcosin morphology and normal-chromatin sperm. It is a promising method in sperm separation for use in insemination and in vitro fertilization to improve birth health quality.
, 百拇医药
【Key words】 Wang tube Swim-up Sperm separation
获得优质的精子是进行人工授精、试管婴儿等辅助生殖技术的重要环节，也是优生学的重要内容之一。传统的精子分离方法有精子上游法、密度梯度离心分离法及玻璃纤维过滤法等[1]。由于精子的分离技术各有特点，尚难尽人意。近年来，许多学者亦在不断探讨新的分离方法。王氏管精子纯化方法[2]是台湾学者王福南博士发明的一种精子分离纯化系统，因在精子分离中获得理想的效果而获多项专利。本文试通过57例精液的分析并与精子上游法进行配对比较研究，探讨王氏管的使用效果。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料 57份精液来自本所男性科的患者，按WHO法分类，其中36份为弱精子症，21份为正常精液。精子分离用培养基BWW液自行配制。康氏管、吸管为本室自备；王氏管由皖南医学院生殖医学研究所陆仁康教授提供。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 精子上游法 取液化的精液约0.5～1.0 ml分别放入盛有2.0 ml预热的BWW液的两支康氏试管中，用吸管轻轻吸打，300 g离心5 min，弃上清，下沉的精子丸团与等体积BWW液混匀(约0.3 ml)制成混悬液。取其中一支放置另一盛有2 ml的预热后的康氏管的底部，放37℃ 5%的CO2培养箱孵育80～90 min。取上清用于精子各项指
标的分析。
1.2.2 王氏管法[2] 取预热的BWW液置王氏管的A～D点，固定硅胶球。吸取另一支离心制好的精子丸团混悬液置王氏管的P点处，同样置放37℃ 5%的CO2培养箱孵育80～90 min。完毕，折断王氏管的C点，挤压硅胶球，收集C～D的精子用于分析。
1.2.3 精子质量分析 在精液处理前后均按WHO法进行常规和形态分析。精子顶体形态学分析采用瑞-姬染色法[3]。计算含完整精子顶体的百分率。精子染色质的分析参考文献[3]用亚啶橙染色方法分析精子核单链和双链DNA，通过荧光显微镜WIG激发，观察红绿色精子数的比例，计算双链DNA的百分率。
, 百拇医药
1.2.4 统计和分析 把以上分析的数据列成表格，输入计算机，采用SPSS 9.0统计软件包进行统计学处理。
2 结果
实验检测结果按WHO的分类分两组，即正常精液组和弱精少精组，两种方法分离两组不同精液的结果如表1。
在分析精子顶体完整性时，可看出，两组精子的顶体完整率在分离前差异无显著性(P<0.05)，在用上游分离后精子顶体形态的完整率未见显著改变(P>0.05)；而用王氏管法分离后可看到精子顶体形态完整率明显提高(P<0.01)。
表1 两组精液采用不同方法分离前后的主要精液参数比较总表
正常组(21例)
弱精少精组(36例)
, 百拇医药
处理前
上游法
王氏管法
处理前
上游法
王氏管法
精子数(×106/ml)
56±22.1
23±5.7
29±6.2
21±14.3
13±9.5
, http://www.100md.com
19±3.4
活动率(%)
52±11.2
63±12.1*
86±11.5*△
34±10.2
55±11.0*
86±10.1*△
正常形态率(%)
39±23.4
55±22.1
, 百拇医药
92±2.5
24±12.5
56±21.1*
95±3.2*
顶体完整率(%)
65±17.2
77±15.4
89±6.7
45±13.2
58±7.4
91±6.9
正常染色质率(%)
, 百拇医药
66±34.6
70±22.8
93±7.8
48±31.9
57±12.7
86±12.7
在观察精子质量的另一指标中，两组精子的双链DNA率在分离前差异无显著性(P>0.05)，在用上游法分离后精子双链DNA率未见显著改变(P>0.05)；而用王氏管法分离后可看到精子双链DNA率明显提高(P<0.01)。
3 讨论
传统的精子分离常根据优质精子的某一特性有别于精液中其他成分而有效地分开，各种方法虽有各自特点，但往往获得的精子质量难尽如意[4]。王氏管是一项基于生物学、流体力学、化学、数学和精子运动电脑轨迹图学等多学科原理设计而成的精子分离纯化装置[3]，因此在精子分离纯化方面取得了较为理想的效果[5]，在国外许多国家得以广泛应用。在我国也有采用王氏管的研究报道[5]。本文应用王氏管通过57例两组不同质量的精液分析，并与上游法进行比较研究，证实了该方法的分离效果。从实验结果看，两种方法处理后的精液，精子数量虽有下降，但在精子的活动率，正常形态精子率均有明显提高，P<0.01，表明了两种方法在精子分离上的可行性。
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同时，从进一步的指标分析看，两种方法在精子顶体的分离中表现出质的差别。分离前两组精子顶体完整率差异虽无显著性，用上游法分离精子顶体的完整率虽有提高，但统计学上无显著意义。而采用王氏管法则分离后精子顶体完整率有明显提高，表明了王氏管法能有效地分离顶体不完整的精子，为临床判断分离后精子的质量提供了又一观察指标。
判断精子质量的另一指标是测定精子核DNA的成熟度。成熟精子含双链DNA，哑啶橙染成绿色；而未成熟精子含单链DNA，哑啶橙染成红色。本文用两种方法对两组精液进行分析，上游法所获得的绿色精子的百分率无明显差别，而王氏管法处理后所获得绿色精子率明显提高，王氏法在处理精液除去未成熟DNA精子获得良好的效果，是一种很有价值的精子优选技术[6]。
从本实验结果分析，王氏管法综合了诸多精子分离方法的特点，科学地设计了分离精子的纯化装置，王氏管具有结构精巧，实用及较好分离效果的特点。但由于所用试管成本较高，且不能重复使用，使它在临床上应用受到了一定的限制。探讨一种最大限度地降低成本的改良方法有望使王氏管方法得以广泛的使用。
, http://www.100md.com
本课题为广东省科委重点攻关项目(编号：9622050-03)
参考文献
1，张秀成，编著.精子检测和分离. 北京：科学技术出版社，1993.183～193
2，陆仁康， 彭守静. 实时精子分离系统(王氏管系统). 男性学杂志，1994， 8(2)：123
3，黄宇峰，主编.实用精液细胞学彩色图谱.南京：东南大学出版社，1994.23～25
4，夏长所，朱桂金，罗丽兰.人类精子优选技术. 国外医学计划生育分册，1997， 16(1)：15
5，Wang FN, Lin CT, Hong CY, et al. Modification of the Wang tube to improve in vitro semen manipulation. Archive Andrology, 1992, 29(3): 267
6，Wang FN, Hong CY, Chou TS, et al. Techniques for selection of normal chromatin sperm preparations. Archive Andrology, 1991, 27(1): 87
收稿日期：1999-01-24, http://www.100md.com
单位：(广东省计划生育科学技术研究所 510600)
关键词：精子优选；上游法；王氏管法
广东医学000511 【摘要】 目的 探讨王氏管精子优选法在精子优选的应用，并与传统的精子上游法进行比较。方法 随机选择57份精液，采用两种方法进行配对处理，比较两种方法分离前后、两者间精子活动率、形态以及精子顶体形态和精子染色质等参数的变化。结果 两种方法处理后的精子活动率、精子形态差异有显著性(P<0.01)，王氏管法处理后精子顶体完整率、正常染色质率亦显示出显著的差异(P<0.01)。结论 王氏管精子优选法和精子上游法在精子处理中获得较好的精子质量，而王氏管精子优选法则获得更优质的精子，且具有方便操作实用的特点。
Effects analysis of Wang tube sperm separating system in practice
, 百拇医药
Wei Xiangcai Tian Peiling Chen Pingle et al
(Family Planning Research Institute of Guangdong, Guangzhou, 510600)
【Abstract】 Objective To study and compare swim-up and Wang tube techniques in sperm separation. Methods 57 samples of semen were treated by two methods. Several characteristics of semen including sperm count, motility, morphology, acrosin morphology and normal chromatin were analyzed. Results There was significant difference between pre-treatment and post-treatment in both methods in terms of sperm motility and morphology. There was also significant difference on acrosin morphology and normal chromatin chromatin in Wang tube method, but not in swim-up method. Conclusion Both Wang tube and swim-up methods improve sperm quality, but Wang tube is superior to swim-up, especially in recovery rate of arcosin morphology and normal-chromatin sperm. It is a promising method in sperm separation for use in insemination and in vitro fertilization to improve birth health quality.
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【Key words】 Wang tube Swim-up Sperm separation
获得优质的精子是进行人工授精、试管婴儿等辅助生殖技术的重要环节，也是优生学的重要内容之一。传统的精子分离方法有精子上游法、密度梯度离心分离法及玻璃纤维过滤法等[1]。由于精子的分离技术各有特点，尚难尽人意。近年来，许多学者亦在不断探讨新的分离方法。王氏管精子纯化方法[2]是台湾学者王福南博士发明的一种精子分离纯化系统，因在精子分离中获得理想的效果而获多项专利。本文试通过57例精液的分析并与精子上游法进行配对比较研究，探讨王氏管的使用效果。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料 57份精液来自本所男性科的患者，按WHO法分类，其中36份为弱精子症，21份为正常精液。精子分离用培养基BWW液自行配制。康氏管、吸管为本室自备；王氏管由皖南医学院生殖医学研究所陆仁康教授提供。
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1.2 方法
1.2.1 精子上游法 取液化的精液约0.5～1.0 ml分别放入盛有2.0 ml预热的BWW液的两支康氏试管中，用吸管轻轻吸打，300 g离心5 min，弃上清，下沉的精子丸团与等体积BWW液混匀(约0.3 ml)制成混悬液。取其中一支放置另一盛有2 ml的预热后的康氏管的底部，放37℃ 5%的CO2培养箱孵育80～90 min。取上清用于精子各项指
标的分析。
1.2.2 王氏管法[2] 取预热的BWW液置王氏管的A～D点，固定硅胶球。吸取另一支离心制好的精子丸团混悬液置王氏管的P点处，同样置放37℃ 5%的CO2培养箱孵育80～90 min。完毕，折断王氏管的C点，挤压硅胶球，收集C～D的精子用于分析。
1.2.3 精子质量分析 在精液处理前后均按WHO法进行常规和形态分析。精子顶体形态学分析采用瑞-姬染色法[3]。计算含完整精子顶体的百分率。精子染色质的分析参考文献[3]用亚啶橙染色方法分析精子核单链和双链DNA，通过荧光显微镜WIG激发，观察红绿色精子数的比例，计算双链DNA的百分率。
, 百拇医药
1.2.4 统计和分析 把以上分析的数据列成表格，输入计算机，采用SPSS 9.0统计软件包进行统计学处理。
2 结果
实验检测结果按WHO的分类分两组，即正常精液组和弱精少精组，两种方法分离两组不同精液的结果如表1。
在分析精子顶体完整性时，可看出，两组精子的顶体完整率在分离前差异无显著性(P<0.05)，在用上游分离后精子顶体形态的完整率未见显著改变(P>0.05)；而用王氏管法分离后可看到精子顶体形态完整率明显提高(P<0.01)。
表1 两组精液采用不同方法分离前后的主要精液参数比较总表
正常组(21例)
弱精少精组(36例)
, 百拇医药
处理前
上游法
王氏管法
处理前
上游法
王氏管法
精子数(×106/ml)
56±22.1
23±5.7
29±6.2
21±14.3
13±9.5
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19±3.4
活动率(%)
52±11.2
63±12.1*
86±11.5*△
34±10.2
55±11.0*
86±10.1*△
正常形态率(%)
39±23.4
55±22.1
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92±2.5
24±12.5
56±21.1*
95±3.2*
顶体完整率(%)
65±17.2
77±15.4
89±6.7
45±13.2
58±7.4
91±6.9
正常染色质率(%)
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66±34.6
70±22.8
93±7.8
48±31.9
57±12.7
86±12.7
在观察精子质量的另一指标中，两组精子的双链DNA率在分离前差异无显著性(P>0.05)，在用上游法分离后精子双链DNA率未见显著改变(P>0.05)；而用王氏管法分离后可看到精子双链DNA率明显提高(P<0.01)。
3 讨论
传统的精子分离常根据优质精子的某一特性有别于精液中其他成分而有效地分开，各种方法虽有各自特点，但往往获得的精子质量难尽如意[4]。王氏管是一项基于生物学、流体力学、化学、数学和精子运动电脑轨迹图学等多学科原理设计而成的精子分离纯化装置[3]，因此在精子分离纯化方面取得了较为理想的效果[5]，在国外许多国家得以广泛应用。在我国也有采用王氏管的研究报道[5]。本文应用王氏管通过57例两组不同质量的精液分析，并与上游法进行比较研究，证实了该方法的分离效果。从实验结果看，两种方法处理后的精液，精子数量虽有下降，但在精子的活动率，正常形态精子率均有明显提高，P<0.01，表明了两种方法在精子分离上的可行性。
, http://www.100md.com
同时，从进一步的指标分析看，两种方法在精子顶体的分离中表现出质的差别。分离前两组精子顶体完整率差异虽无显著性，用上游法分离精子顶体的完整率虽有提高，但统计学上无显著意义。而采用王氏管法则分离后精子顶体完整率有明显提高，表明了王氏管法能有效地分离顶体不完整的精子，为临床判断分离后精子的质量提供了又一观察指标。
判断精子质量的另一指标是测定精子核DNA的成熟度。成熟精子含双链DNA，哑啶橙染成绿色；而未成熟精子含单链DNA，哑啶橙染成红色。本文用两种方法对两组精液进行分析，上游法所获得的绿色精子的百分率无明显差别，而王氏管法处理后所获得绿色精子率明显提高，王氏法在处理精液除去未成熟DNA精子获得良好的效果，是一种很有价值的精子优选技术[6]。
从本实验结果分析，王氏管法综合了诸多精子分离方法的特点，科学地设计了分离精子的纯化装置，王氏管具有结构精巧，实用及较好分离效果的特点。但由于所用试管成本较高，且不能重复使用，使它在临床上应用受到了一定的限制。探讨一种最大限度地降低成本的改良方法有望使王氏管方法得以广泛的使用。
, http://www.100md.com
本课题为广东省科委重点攻关项目(编号：9622050-03)
参考文献
1，张秀成，编著.精子检测和分离. 北京：科学技术出版社，1993.183～193
2，陆仁康， 彭守静. 实时精子分离系统(王氏管系统). 男性学杂志，1994， 8(2)：123
3，黄宇峰，主编.实用精液细胞学彩色图谱.南京：东南大学出版社，1994.23～25
4，夏长所，朱桂金，罗丽兰.人类精子优选技术. 国外医学计划生育分册，1997， 16(1)：15
5，Wang FN, Lin CT, Hong CY, et al. Modification of the Wang tube to improve in vitro semen manipulation. Archive Andrology, 1992, 29(3): 267
6，Wang FN, Hong CY, Chou TS, et al. Techniques for selection of normal chromatin sperm preparations. Archive Andrology, 1991, 27(1): 87
收稿日期：1999-01-24, http://www.100md.com