广东地区GBV-C/HGV 5′NCR区序列变异的研究
作者：付涌水 曹开源 吕凌
单位：付涌水(广东省广州血液中心 510095)；曹开源 吕凌(中山医科大学分子医学研究中心 510080)
关键词：克隆，分子；序列分析，DNA；肝炎病毒组，庚型；聚合酶链反应
广东医学000510 【摘要】 目的 了解广东地区GBV-C/HGV 5′NCR区的序列变异情况。方法 以GBV-C和HGV的5′NCR区完全同源的序列设计合成引物用于套式RT-PCR。从广东地区的10例GBV-C/HGV感染者血中扩增了10个序列，分别克隆至pUC19或pT-Adv载体。以35 S标记的双脱氧链末端终止法对这10个序列分别进行正反两个方向的序列测定。结果 10株序列相互间同源性最大为100%，最小为84.4%。与Genbank所载3个标准株的相应序列比较，其同源性最大为89.4%，最小为83.9%。与国内周育森报道的相应序列比较，两者之间的同源性最大为96.1%，最小为85.0%。比较还发现，这10株序列的起始处有一段38 nt的区域与上述标准序列相比变异比较大，其与标准序列的同源性最高只有79.0%，最低为60.5%。其中9株相互间的这一38 nt序列的同源性则高达92%～100%。结论 广东地区流行的庚型肝炎病毒大多带有HGV的特殊点。少数为GBV-C。
, 百拇医药
Study on the GBV-C/HGV heterogeneity in guangdong
Fu Yongshui Cao Kaiyuan Lü Ling
(Guangzhou Blood Center, Guangzhou 510095)
【Abstract】 Objective To study the GBV-C/HGV heterogeneity in Guangdong. Methods The completely homologous sequences of the 5′NCR region between HGV and GBV-C were used to design and synthesize two pairs of primers, which were applied in a RT-PCR test to amplify 10 sequences in sera from 10 patients with GBV-C/HGV infection. The PCR products were cloned into pUC19 vectors or PT-Adv vectors. By using the method of dideoxy-mediated chain-termination, the HGV sequences inserted in the pUC19 and PT-Adv vectors were sequenced. Results The highest degree of nucleotide homology of these 10 HGV isolates is 100% and the lowest is 84.4%. When compared to the three standard sequences of U44402, U45966 and U36380, the highest and lowest homology is 89.4% and 83.9%. When compared to the sequence reported by Zhou Yushen, The highest and lowest homology is 96.1% and 85.0%. Furthermore, a 38nt highly mutant region was found at the beginning of these 10 HGV sequences, with the highest and lowest homology of 79.0% and 60.5% compared to three standard sequences.In the 38nt region, 9 of 10 isolated strains have an homology of 92%～100%. Conclusion 9 isolate strains carry the characteristic of “Guangdong subtype HGV”, the left one strain seems to be like GBV-C.
, 百拇医药
【Key words】 Molecular cloning Sequence analysis, DNA Hepatitis G virus Polymerase chain reaction
庚型肝炎病毒(HGV)与丙型肝炎病毒(HCV)同属黄病毒科(Flaviviridae)，基因组大小相近，结构类似，都可分为5′与3′非编码区(NCR)与中间的结构与非结构蛋白编码区[1]。HCV的5′NCR区高度保守，对HCV的复制和致病性有重要意义[2]。有关HGV 5′NCR区的保守性，目前资料不多，本文对此进行了初步探讨。
1 材料与方法
1.1 标本来源 血清标本分别来自深圳市东湖医院，佛山市第一人民医院传染科和广州医学院第二附属医院传染科的门诊和住院患者。
1.2 引物 为Genbank所载U44402，U45966和U36380[1，3]的完全同源序列。在U44402中的记位：G1为112-126，G2为452-476，G3为161-185， G4为376-397。G1/G2作外引物，G3/G4作内引物。
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1.3 RT-PCR 以QIAamp Viral RNA Kit提取血清总RNA， 以Random Primers加AMV逆转录酶(boehringer)逆转录为cDNA,加入引物以PCR Core Kit(boehringer)进行套式扩增。条件均为94℃,57℃和72℃各1 min，循环30周。
1.4 PCR产物克隆 对阳性的190 bp的PCR-2产物进行克隆。克隆方法参照《分子克隆》和Clontech公司的试剂盒说明书进行。
1.5 DNA序列测定 以35 S标记的双脱氧链末端终止法对阳性克隆分别进行正反两个方向的序列测定。测序结果用DNASIS软件分析。
2 结果
共对10株HGV的5′NCR序列进行了克隆测序。图1是10株序列的同源性比较及与其他报道的比较。可见所测10株序列其相互间同源性最大为100%(pTAG3, pTAG4和pATG5序列完全相同)，最小84.4%(pUG4与pUG2比较有28nt不同)。与Genbank所载3个标准株的相应序列比较，其同源性最大为89.4%(pUG2与U36380比较有19 nt不同)，最小为83.9%(pUG2与U44402比较有29 nt不同)。与国内周育森报道的相应序列比较，两者之间的同源性最大为96.1%(pUG4与军科比较有7nt不同)，最小为85.0%(pUG2与军科比较有27 nt不同)。由图1可见所测序列起始处有一段与标准序列及周育森序列相比变异比较大的区域，其记位为U44402的187-244的38个核苷酸(nt)。另外还可见有6个变异热点。详细分析则列入讨论之中。
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图1 10株HGV 5′NCR部分序列测定结果的相互比较
#：基因记位以U44402序列为准， *：pTAG4和pTAG5序列与之完全相同
3 讨论
近年来寻找非甲-戊型肝炎病原的研究进展迅速。GBV-C是Simons等于1995年6月报道的从西非的肝炎易感者血中找到的一种新型肝炎病毒[3，4]。HGV是Linnen等于1996年1月报道的从慢性肝炎患者血中克隆出来的庚型肝炎病毒[1]。GBV-C与HGV的同源性在核苷酸水平为85%，在氨基酸水平为95%，目前多认为两者是同型病毒，与HCV一同划归为黄病毒科。黄病毒科病毒的基因组都可划分为5′与3′非编码区与中间的结构与非结构蛋白编码区。世界各地分离到的不同基因型的HCV，其5′NCR区序列都高度保守[2]。但从本文来看，HGV的5′NCR序列其保守性则要差一些。
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由图1可见所测序列起始处有一段与标准序列相比变异比较大的区域，记位为U44402的187～224的38个核苷酸(nt)。以这38个nt为区段来分析同源性可见，属HGV的U44402与U45966两者同源性为100%，与属GBV-C的U36380相比同源性只有60.5%(15/38 nt变异)。pUG2是所测序列中异质性最大的，与U36380的同源性为78.95%(8/38 nt变异)，与U44402和U45966的同源性也只有60.5%(15/38 nt变异)，与其余9个所测序列的同源性为73.7%(10/38 nt变异)。因此，pUG2与其说是HGV还不如说是GBV-C，这从其下游序列的变异更能得到反映。其余的9个序列该区段相应间同源性非常高，高达92%～100%(0～3/38 nt变异)，明显高于同U36380，U44402和U45966的同源性(11～14/38 nt变异，同源性为63%～71%)，似乎这一区段序列具有“广东亚型”HGV的特点。
pUG2记位为268～284的区域与所测的其他9个序列相比，尽管17 nt中有6个nt变异，但却是变得与U36380序列几乎一致，提示其属于GBV-C。由图1还可见在记位207，258，300，319，247和374处，有6个变异热点。周育森序列与3个标准序列在这6个位点上的核苷酸是完全一致的，拟为GBV-C序列的pUG2有4个位点上核苷酸与它们也是一致的。而9个拟为HGV的序列则有6个序列在这6个位点上全部被相同的核苷酸替代，另外3个序列则各在其中5个位点被相同的核苷酸替代上发生变异。
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HCV的5′NCR区含病毒复制和表达调控的关键序列，因此必须高度保守以维持其致病性。有关HGV的致病性，目前还有争论，但从5′NCR序列的变异情况来推测，不同毒株致病性有差异的原因或可能在此。上述“广东亚型”的致病性如何，我们还在进一步研究中。
参考文献
1，Linnen J, Wages J, Zhang-Keck ZY, et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a transfusion transmissible agent. Science, 1996, 271: 505
2，Han JH, Shyamala M, Richaman KH, et al. Characterization of the terminal regions of hepatitis C virus RNA: identification of concerved sequence in the 5′untranslated region and poly(A) tails at the 3′end. Proc Natl Acad Sci, 1991, 88:1711
, 百拇医药
3，Leary TP, Muerhoff AS, Simmons JN, et al. Sequence and genomic organization of GBV-C: a novel member of the flaviviridae associated with human non-AE hepatitis. J Med Virol, 1996, 48: 60
4，Simons JN, Leary TP, Dawson GJ, et al. Isolation of novel virus-like sequences associated with human hepatitis. Nature Medicine, 1995, 1(6):19
收稿日期：1999-12-02, http://www.100md.com
单位：付涌水(广东省广州血液中心 510095)；曹开源 吕凌(中山医科大学分子医学研究中心 510080)
关键词：克隆，分子；序列分析，DNA；肝炎病毒组，庚型；聚合酶链反应
广东医学000510 【摘要】 目的 了解广东地区GBV-C/HGV 5′NCR区的序列变异情况。方法 以GBV-C和HGV的5′NCR区完全同源的序列设计合成引物用于套式RT-PCR。从广东地区的10例GBV-C/HGV感染者血中扩增了10个序列，分别克隆至pUC19或pT-Adv载体。以35 S标记的双脱氧链末端终止法对这10个序列分别进行正反两个方向的序列测定。结果 10株序列相互间同源性最大为100%，最小为84.4%。与Genbank所载3个标准株的相应序列比较，其同源性最大为89.4%，最小为83.9%。与国内周育森报道的相应序列比较，两者之间的同源性最大为96.1%，最小为85.0%。比较还发现，这10株序列的起始处有一段38 nt的区域与上述标准序列相比变异比较大，其与标准序列的同源性最高只有79.0%，最低为60.5%。其中9株相互间的这一38 nt序列的同源性则高达92%～100%。结论 广东地区流行的庚型肝炎病毒大多带有HGV的特殊点。少数为GBV-C。
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Fu Yongshui Cao Kaiyuan Lü Ling
(Guangzhou Blood Center, Guangzhou 510095)
【Abstract】 Objective To study the GBV-C/HGV heterogeneity in Guangdong. Methods The completely homologous sequences of the 5′NCR region between HGV and GBV-C were used to design and synthesize two pairs of primers, which were applied in a RT-PCR test to amplify 10 sequences in sera from 10 patients with GBV-C/HGV infection. The PCR products were cloned into pUC19 vectors or PT-Adv vectors. By using the method of dideoxy-mediated chain-termination, the HGV sequences inserted in the pUC19 and PT-Adv vectors were sequenced. Results The highest degree of nucleotide homology of these 10 HGV isolates is 100% and the lowest is 84.4%. When compared to the three standard sequences of U44402, U45966 and U36380, the highest and lowest homology is 89.4% and 83.9%. When compared to the sequence reported by Zhou Yushen, The highest and lowest homology is 96.1% and 85.0%. Furthermore, a 38nt highly mutant region was found at the beginning of these 10 HGV sequences, with the highest and lowest homology of 79.0% and 60.5% compared to three standard sequences.In the 38nt region, 9 of 10 isolated strains have an homology of 92%～100%. Conclusion 9 isolate strains carry the characteristic of “Guangdong subtype HGV”, the left one strain seems to be like GBV-C.
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【Key words】 Molecular cloning Sequence analysis, DNA Hepatitis G virus Polymerase chain reaction
庚型肝炎病毒(HGV)与丙型肝炎病毒(HCV)同属黄病毒科(Flaviviridae)，基因组大小相近，结构类似，都可分为5′与3′非编码区(NCR)与中间的结构与非结构蛋白编码区[1]。HCV的5′NCR区高度保守，对HCV的复制和致病性有重要意义[2]。有关HGV 5′NCR区的保守性，目前资料不多，本文对此进行了初步探讨。
1 材料与方法
1.1 标本来源 血清标本分别来自深圳市东湖医院，佛山市第一人民医院传染科和广州医学院第二附属医院传染科的门诊和住院患者。
1.2 引物 为Genbank所载U44402，U45966和U36380[1，3]的完全同源序列。在U44402中的记位：G1为112-126，G2为452-476，G3为161-185， G4为376-397。G1/G2作外引物，G3/G4作内引物。
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1.3 RT-PCR 以QIAamp Viral RNA Kit提取血清总RNA， 以Random Primers加AMV逆转录酶(boehringer)逆转录为cDNA,加入引物以PCR Core Kit(boehringer)进行套式扩增。条件均为94℃,57℃和72℃各1 min，循环30周。
1.4 PCR产物克隆 对阳性的190 bp的PCR-2产物进行克隆。克隆方法参照《分子克隆》和Clontech公司的试剂盒说明书进行。
1.5 DNA序列测定 以35 S标记的双脱氧链末端终止法对阳性克隆分别进行正反两个方向的序列测定。测序结果用DNASIS软件分析。
2 结果
共对10株HGV的5′NCR序列进行了克隆测序。图1是10株序列的同源性比较及与其他报道的比较。可见所测10株序列其相互间同源性最大为100%(pTAG3, pTAG4和pATG5序列完全相同)，最小84.4%(pUG4与pUG2比较有28nt不同)。与Genbank所载3个标准株的相应序列比较，其同源性最大为89.4%(pUG2与U36380比较有19 nt不同)，最小为83.9%(pUG2与U44402比较有29 nt不同)。与国内周育森报道的相应序列比较，两者之间的同源性最大为96.1%(pUG4与军科比较有7nt不同)，最小为85.0%(pUG2与军科比较有27 nt不同)。由图1可见所测序列起始处有一段与标准序列及周育森序列相比变异比较大的区域，其记位为U44402的187-244的38个核苷酸(nt)。另外还可见有6个变异热点。详细分析则列入讨论之中。
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图1 10株HGV 5′NCR部分序列测定结果的相互比较
#：基因记位以U44402序列为准， *：pTAG4和pTAG5序列与之完全相同
3 讨论
近年来寻找非甲-戊型肝炎病原的研究进展迅速。GBV-C是Simons等于1995年6月报道的从西非的肝炎易感者血中找到的一种新型肝炎病毒[3，4]。HGV是Linnen等于1996年1月报道的从慢性肝炎患者血中克隆出来的庚型肝炎病毒[1]。GBV-C与HGV的同源性在核苷酸水平为85%，在氨基酸水平为95%，目前多认为两者是同型病毒，与HCV一同划归为黄病毒科。黄病毒科病毒的基因组都可划分为5′与3′非编码区与中间的结构与非结构蛋白编码区。世界各地分离到的不同基因型的HCV，其5′NCR区序列都高度保守[2]。但从本文来看，HGV的5′NCR序列其保守性则要差一些。
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由图1可见所测序列起始处有一段与标准序列相比变异比较大的区域，记位为U44402的187～224的38个核苷酸(nt)。以这38个nt为区段来分析同源性可见，属HGV的U44402与U45966两者同源性为100%，与属GBV-C的U36380相比同源性只有60.5%(15/38 nt变异)。pUG2是所测序列中异质性最大的，与U36380的同源性为78.95%(8/38 nt变异)，与U44402和U45966的同源性也只有60.5%(15/38 nt变异)，与其余9个所测序列的同源性为73.7%(10/38 nt变异)。因此，pUG2与其说是HGV还不如说是GBV-C，这从其下游序列的变异更能得到反映。其余的9个序列该区段相应间同源性非常高，高达92%～100%(0～3/38 nt变异)，明显高于同U36380，U44402和U45966的同源性(11～14/38 nt变异，同源性为63%～71%)，似乎这一区段序列具有“广东亚型”HGV的特点。
pUG2记位为268～284的区域与所测的其他9个序列相比，尽管17 nt中有6个nt变异，但却是变得与U36380序列几乎一致，提示其属于GBV-C。由图1还可见在记位207，258，300，319，247和374处，有6个变异热点。周育森序列与3个标准序列在这6个位点上的核苷酸是完全一致的，拟为GBV-C序列的pUG2有4个位点上核苷酸与它们也是一致的。而9个拟为HGV的序列则有6个序列在这6个位点上全部被相同的核苷酸替代，另外3个序列则各在其中5个位点被相同的核苷酸替代上发生变异。
, 百拇医药
HCV的5′NCR区含病毒复制和表达调控的关键序列，因此必须高度保守以维持其致病性。有关HGV的致病性，目前还有争论，但从5′NCR序列的变异情况来推测，不同毒株致病性有差异的原因或可能在此。上述“广东亚型”的致病性如何，我们还在进一步研究中。
参考文献
1，Linnen J, Wages J, Zhang-Keck ZY, et al. Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus: a transfusion transmissible agent. Science, 1996, 271: 505
2，Han JH, Shyamala M, Richaman KH, et al. Characterization of the terminal regions of hepatitis C virus RNA: identification of concerved sequence in the 5′untranslated region and poly(A) tails at the 3′end. Proc Natl Acad Sci, 1991, 88:1711
, 百拇医药
3，Leary TP, Muerhoff AS, Simmons JN, et al. Sequence and genomic organization of GBV-C: a novel member of the flaviviridae associated with human non-AE hepatitis. J Med Virol, 1996, 48: 60
4，Simons JN, Leary TP, Dawson GJ, et al. Isolation of novel virus-like sequences associated with human hepatitis. Nature Medicine, 1995, 1(6):19
收稿日期：1999-12-02, http://www.100md.com