急性淋巴细胞白血病患儿红细胞内硫鸟嘌呤核苷酸测定在药物治疗监测中的应用
作者：叶启东 顾龙君 李方 陈静 唐跃年 赵金彩 叶裕春
单位：200092 上海第二医科大学附属新华医院、上海儿童医学中心
关键词：
中华血液学杂志000517 为探讨服用抗嘌呤代谢药物期间测定红细胞内硫鸟嘌呤核苷酸(TGN)浓度对实现抗嘌呤代谢药物剂量个体化的作用，我们在急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿服用6-巯基嘌呤(6-MP)期间，用高效液相色谱仪测定红细胞内硫鸟嘌呤核苷酸的浓度，现报道如下。
对象和方法
1 观察对象 红细胞采自3～12岁ALL患儿[10例为甲氨蝶呤(MTX)+6-MP维持治疗，6例为CAM(环磷酰胺、阿糖胞苷、6-MP)巩固治疗]的外周静脉血，采血前1个月未输注红细胞。除4例患儿6-MP服用剂量为30～50mg/m2(因不能耐受75mg/m2的剂量)，其余患儿6-MP服用剂量为75mg/m2。
, 百拇医药
2 方法[1]
2.1 血样预处理：全血离心(1350r/min离心10min，4℃)后弃血浆和白细胞，以2倍体积的Hanks液洗涤，同上离心、洗涤，再次离心(2200r/min离心10min，4℃)后弃上清，加入等体积Hanks液，取少量作红细胞计数，其余于-20℃存放。
2.2 水解：在200μl红细胞溶解液中依次加入0.5ml水，0.3ml DL-二巯苏糖醇(10mol/L),0.5ml硫酸(1.5mol/L)，100℃加热1h。标准品为6-硫鸟嘌呤(6-TG，Sigma公司)，在加样前加入健康者红细胞溶解液中。
2.3 萃取：冷却后加入0.5ml NaOH(5mol/L),8ml甲苯(含有170mmol/L戊醇，1.3mmol/L醋酸苯汞)，振荡5min后离心(2400r/min离心5min,10℃)；吸取6ml有机相，加入0.2ml盐酸(0.1mol/L)，振荡1min后同上离心；弃有机相，水相用于HPLC检测。
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2.4 HPLC测定：HPLC为美国惠普公司产品(Series 1100)，分析柱为C18反相柱(粒径10μm，4.6mm×250mm)。检测器为紫外检测器(G1314A)，波长342nm，出峰时间2.0min。流动相中甲醇与水的体积比为10∶90(含100mmol/L三乙胺和0.5mol/L DL-二巯苏糖醇，以正磷酸调pH值到3.2)。
2.5 患者治疗前以同位素标记方法测定红细胞内6-MP代谢酶巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)的活性[2]。
3 统计学处理 以Statistica 5.0软件包处理数据。
结果
1 标准曲线 本实验采用外标法，在健康志愿者红细胞中加入不同量的6-TG后，与患儿红细胞同样处理，其浓度与HPLC测定所得峰面积的标准曲线呈线性(Y=0.187+0.0267X，r=0.9995)。标准曲线经6次验证，重复性良好。
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2 TGN在红细胞内的蓄积 对处于维持治疗的患儿，分别测定其服用6-MP后第4，7，14，21，28天红细胞内TGN浓度，其蓄积情况见图1。10例患儿在第7～第14天达到稳态浓度，其范围为230～520pmol/8×108红细胞，红细胞内TGN浓度未见明显升高。
图1 服用6-MP后红细胞内TGN的蓄积
3 TGN浓度与TPMT活性 比较ALL患儿治疗前红细胞内TPMT活性与服用6-MP第7天时红细胞内TGN浓度，当去除1例明显不符合的患儿后，两者在统计学上呈负相关(rs=-0.77,t=-4.29,P<0.001),即TPMT活性升高，则红细胞内TGN浓度降低。
4 TGN浓度与白细胞计数 比较TGN浓度与其测定后第14天的外周血白细胞计数，两者之间在统计学上呈负相关(rs=-0.60,t=-5.49,P<0.0001)。
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讨论
抗嘌呤代谢类药物的抗肿瘤活性成分为其代谢产物TGN[3]，其使用过程中的剂量个体化问题一直未得到解决，一部分患儿容易出现过强的不良反应而致用药中断，另一部分患儿则由于剂量过少而无法产生满意的疗效。国外已有研究者通过测定此类药物的关键代谢酶TPMT和代谢产物TGN来作剂量个体化的尝试，并发现ALL患儿在维持化疗期间的粒细胞缺乏、复发风险与TGN浓度有一定关系。
我们已通过测定TPMT活性来评估服6-MP前患儿对药物可能的反应强度。我们的实验结果证实6-MP代谢酶TPMT活性与其代谢产物TGN浓度存在负相关性，但仍有1例患者虽有较高的TPMT活性，却表现出很强的不良反应，即使在服用50mg/m2的6-MP时，其红细胞内蓄积的TGN稳态浓度仍为313pmol/8×108红细胞，高于国外认为的TGN稳态浓度中位数(275pmol/8×108红细胞)，可能是此类患者体内的另一嘌呤类药物代谢酶黄嘌呤氧化酶(XO)活性较低，其确切原因有待进一步研究证实。所以，测定TGN浓度能使我们及时发现这部分患者，及时调整剂量，保持6-MP化疗的连续性。
, 百拇医药
国外研究发现，当患者TGN稳态浓度范围为275～1000pmol/8×108红细胞时，患者将有较好的预后并且不易出现严重的不良反应，美国St Jude儿童研究医院认为，当TGN浓度>1000pmol/8×108红细胞时，可调整6-MP剂量为标准剂量的70%；我们临床观察的这些患儿均未出现严重不良反应，其结果与国外较一致，同时，对本研究中TGN浓度低于275pmol/8×108红细胞的ALL患儿可能要增加其6-MP剂量(预后有待今后随访)。研究对象中，根据巩固治疗阶段经验，在本研究前1例患儿6-MP剂量调整至300mg/m2，3例调整至50mg/m2后，白细胞低下的症状得到缓解，此4例患者服用75mg/m2时，曾产生严重的白细胞低下且并发感染。若测定这类患儿予6-MP治疗第4天的红细胞内TGN浓度，可初步判断其对6-MP的敏感性，而测定第7～第14天的TGN浓度则将会比目前更早地发现其对6-MP的敏感性和耐受性。
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实验发现TGN浓度与测定后第14天的白细胞计数呈负相关，由于ALL患儿在维持治疗阶段的MTX使用剂量较稳定，6-MP剂量为影响白细胞计数的主要因素，提示我们以TGN浓度作为ALL患儿对6-MP敏感性的指标，将能更早地预防不良反应的发生。今后，对初发的ALL患儿实行在TGN监测下的6-MP给药，将会增强ALL化疗剂量个体化的科学性。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770781)、上海科学技术发展基金资助项目(984119010)
参考文献
1，Lennard L. Assay of 6-thioinosinic acid and 6-thioguanine nucleotides, active metabolites of 6-mercaptopurine, in human red blood cells. J Chromatogr, 1987, 423:169-178.
2，Mcleod HL, Lin JS, Scott EP, et al. Thiopurine methyltransferase activity in American white subjects and black subjects. Clin Pharmacol Ther, 1994, 55:15-20.
3，Lennard L. The clinical pharmacology of 6-mercaptopurine. Eur J Clin Pharmacol, 1992, 43:329-339.
(收稿日期：1999-10-18), http://www.100md.com
单位：200092 上海第二医科大学附属新华医院、上海儿童医学中心
关键词：
中华血液学杂志000517 为探讨服用抗嘌呤代谢药物期间测定红细胞内硫鸟嘌呤核苷酸(TGN)浓度对实现抗嘌呤代谢药物剂量个体化的作用，我们在急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿服用6-巯基嘌呤(6-MP)期间，用高效液相色谱仪测定红细胞内硫鸟嘌呤核苷酸的浓度，现报道如下。
对象和方法
1 观察对象 红细胞采自3～12岁ALL患儿[10例为甲氨蝶呤(MTX)+6-MP维持治疗，6例为CAM(环磷酰胺、阿糖胞苷、6-MP)巩固治疗]的外周静脉血，采血前1个月未输注红细胞。除4例患儿6-MP服用剂量为30～50mg/m2(因不能耐受75mg/m2的剂量)，其余患儿6-MP服用剂量为75mg/m2。
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2 方法[1]
2.1 血样预处理：全血离心(1350r/min离心10min，4℃)后弃血浆和白细胞，以2倍体积的Hanks液洗涤，同上离心、洗涤，再次离心(2200r/min离心10min，4℃)后弃上清，加入等体积Hanks液，取少量作红细胞计数，其余于-20℃存放。
2.2 水解：在200μl红细胞溶解液中依次加入0.5ml水，0.3ml DL-二巯苏糖醇(10mol/L),0.5ml硫酸(1.5mol/L)，100℃加热1h。标准品为6-硫鸟嘌呤(6-TG，Sigma公司)，在加样前加入健康者红细胞溶解液中。
2.3 萃取：冷却后加入0.5ml NaOH(5mol/L),8ml甲苯(含有170mmol/L戊醇，1.3mmol/L醋酸苯汞)，振荡5min后离心(2400r/min离心5min,10℃)；吸取6ml有机相，加入0.2ml盐酸(0.1mol/L)，振荡1min后同上离心；弃有机相，水相用于HPLC检测。
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2.4 HPLC测定：HPLC为美国惠普公司产品(Series 1100)，分析柱为C18反相柱(粒径10μm，4.6mm×250mm)。检测器为紫外检测器(G1314A)，波长342nm，出峰时间2.0min。流动相中甲醇与水的体积比为10∶90(含100mmol/L三乙胺和0.5mol/L DL-二巯苏糖醇，以正磷酸调pH值到3.2)。
2.5 患者治疗前以同位素标记方法测定红细胞内6-MP代谢酶巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)的活性[2]。
3 统计学处理 以Statistica 5.0软件包处理数据。
结果
1 标准曲线 本实验采用外标法，在健康志愿者红细胞中加入不同量的6-TG后，与患儿红细胞同样处理，其浓度与HPLC测定所得峰面积的标准曲线呈线性(Y=0.187+0.0267X，r=0.9995)。标准曲线经6次验证，重复性良好。
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2 TGN在红细胞内的蓄积 对处于维持治疗的患儿，分别测定其服用6-MP后第4，7，14，21，28天红细胞内TGN浓度，其蓄积情况见图1。10例患儿在第7～第14天达到稳态浓度，其范围为230～520pmol/8×108红细胞，红细胞内TGN浓度未见明显升高。
图1 服用6-MP后红细胞内TGN的蓄积
3 TGN浓度与TPMT活性 比较ALL患儿治疗前红细胞内TPMT活性与服用6-MP第7天时红细胞内TGN浓度，当去除1例明显不符合的患儿后，两者在统计学上呈负相关(rs=-0.77,t=-4.29,P<0.001),即TPMT活性升高，则红细胞内TGN浓度降低。
4 TGN浓度与白细胞计数 比较TGN浓度与其测定后第14天的外周血白细胞计数，两者之间在统计学上呈负相关(rs=-0.60,t=-5.49,P<0.0001)。
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讨论
抗嘌呤代谢类药物的抗肿瘤活性成分为其代谢产物TGN[3]，其使用过程中的剂量个体化问题一直未得到解决，一部分患儿容易出现过强的不良反应而致用药中断，另一部分患儿则由于剂量过少而无法产生满意的疗效。国外已有研究者通过测定此类药物的关键代谢酶TPMT和代谢产物TGN来作剂量个体化的尝试，并发现ALL患儿在维持化疗期间的粒细胞缺乏、复发风险与TGN浓度有一定关系。
我们已通过测定TPMT活性来评估服6-MP前患儿对药物可能的反应强度。我们的实验结果证实6-MP代谢酶TPMT活性与其代谢产物TGN浓度存在负相关性，但仍有1例患者虽有较高的TPMT活性，却表现出很强的不良反应，即使在服用50mg/m2的6-MP时，其红细胞内蓄积的TGN稳态浓度仍为313pmol/8×108红细胞，高于国外认为的TGN稳态浓度中位数(275pmol/8×108红细胞)，可能是此类患者体内的另一嘌呤类药物代谢酶黄嘌呤氧化酶(XO)活性较低，其确切原因有待进一步研究证实。所以，测定TGN浓度能使我们及时发现这部分患者，及时调整剂量，保持6-MP化疗的连续性。
, 百拇医药
国外研究发现，当患者TGN稳态浓度范围为275～1000pmol/8×108红细胞时，患者将有较好的预后并且不易出现严重的不良反应，美国St Jude儿童研究医院认为，当TGN浓度>1000pmol/8×108红细胞时，可调整6-MP剂量为标准剂量的70%；我们临床观察的这些患儿均未出现严重不良反应，其结果与国外较一致，同时，对本研究中TGN浓度低于275pmol/8×108红细胞的ALL患儿可能要增加其6-MP剂量(预后有待今后随访)。研究对象中，根据巩固治疗阶段经验，在本研究前1例患儿6-MP剂量调整至300mg/m2，3例调整至50mg/m2后，白细胞低下的症状得到缓解，此4例患者服用75mg/m2时，曾产生严重的白细胞低下且并发感染。若测定这类患儿予6-MP治疗第4天的红细胞内TGN浓度，可初步判断其对6-MP的敏感性，而测定第7～第14天的TGN浓度则将会比目前更早地发现其对6-MP的敏感性和耐受性。
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实验发现TGN浓度与测定后第14天的白细胞计数呈负相关，由于ALL患儿在维持治疗阶段的MTX使用剂量较稳定，6-MP剂量为影响白细胞计数的主要因素，提示我们以TGN浓度作为ALL患儿对6-MP敏感性的指标，将能更早地预防不良反应的发生。今后，对初发的ALL患儿实行在TGN监测下的6-MP给药，将会增强ALL化疗剂量个体化的科学性。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770781)、上海科学技术发展基金资助项目(984119010)
参考文献
1，Lennard L. Assay of 6-thioinosinic acid and 6-thioguanine nucleotides, active metabolites of 6-mercaptopurine, in human red blood cells. J Chromatogr, 1987, 423:169-178.
2，Mcleod HL, Lin JS, Scott EP, et al. Thiopurine methyltransferase activity in American white subjects and black subjects. Clin Pharmacol Ther, 1994, 55:15-20.
3，Lennard L. The clinical pharmacology of 6-mercaptopurine. Eur J Clin Pharmacol, 1992, 43:329-339.
(收稿日期：1999-10-18), http://www.100md.com