海鞘活性成分(HQS-V)对免疫受抑小鼠免疫机能的影响
作者：魏振满 张苏刚 刘东平 程云 崔燕 刘明旭 张新全 蔡光明
单位：魏振满 张苏刚 刘东平 程云 崔燕 刘明旭 张新全 蔡光明(北京302医院药理研究室，北京 100039)
关键词：海鞘活性成分，淋巴细胞增殖，巨噬细胞吞噬功能
中国海洋药物000510 摘 要 采用液-液分配色谱等方法对海洋生物——被囊类动物进行萃取分离，得到不同组分的活性提取物(以下称HQS)，主要观察HQS中一种组分(简称HQS-V)对免疫低下小鼠部分免疫功能指标的影响。通过环磷酰胺造成小鼠免疫功能低下，HQS-V按每日100、200、400mg.kg-1分成3组。结果显示100mg.kg-1及200mg.kg-1两组对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能影响更明显(模型组A值为0.070±0.015,100mg.kg-1组0.417±0.184,200mg.kg-1组0.348±0.145,400mg.kg-1组0.168±.0120)，而对脾T淋巴细胞增殖功能的促进作用方面显示：200mg.kg-1及400mg.kg-1两组的作用较100mg.kg-1组更明显(模型组A值为0.026±0.015,200mg.kg-1组0.082±0.015,400mg.kg-1组0.104±0.025)，在统计学上有显著性意义。研究提示渤、黄海海域内被囊类动物具有良好地抗肿瘤和免疫调节作用，这将为新一代抗肿瘤、抗病毒海洋生物新药研制奠定良好的理论物质基础。
, http://www.100md.com
THE EFFECT OF ALLOPELAGIC ACTIVE COMPONENT (HQS-V) ON IMMUNE FUNCTION IN MICE
Wei zhenman Zhang sugang Liu Dongping Cheng Yun Cui Yan
(Department of Pharmacology,302 Hospital， Beijing 100039)
ABSTRACT Active Component of Ascidian Styela clava (HQS-V) on lymphocyte and macrophages function was investigated by MTT, neutral red. The results showed that HQS-V (100,200mg.kg-1) could stimulate peritoneal macrophages production in mice, HQS-V (200,400mg.kg-1) could enhance the function of conA-activated T lymphocyte. Didemnins in Bohai Huanghai Sea have antitumor and immunomodulation fuctions according to our reseach.
, 百拇医药
KEY WORDS Active Component of Ascidian Styela clava (HQS-V), Dedemnins, Tunicate, T-Lymphocyte, Macrophagocyte
当前海洋生化药物业已成为现代医药保健品开发研究的热点，由海洋生物活性物质中寻找抗肿瘤、抗病毒、抗真菌等生物活性物质，已成为国内外科学家研究的方向。我们采用液-液分配色谱等方法对海洋生物——被囊类动物海鞘进行萃取分离，得到不同组分的活性提取物，实验重点观察HQS-V对免疫低下小鼠部分免疫功能指标的影响。
1 实验材料
1.1 海洋生物活性成分HQS-V 由本室制备，柄海鞘(Styela Clava Herdman)，1997年9月采集于烟台附近海域，由北京医科大学林文翰教授及其研究有关人员鉴定。小鼠按每日100、200、400mg.kg-1分成3组，每组8只。
, 百拇医药
1.2 环磷酰胺 上海华联制药公司生产(批号 961028)，用生理盐水将其配制成10g.L-1,备用。
1.3 RPMI 1640完全培养液，含RPMI 1640(美国GIBCO公司生产)、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、10%新生小牛血清、硫化乙醇酸钠，北京邦定生物医学公司提供。
1.4 刀豆蛋白(sigma公司产品)，配成浓度(10mg.L-1)。
1.5 动物 BALB/C雌性小鼠，体重18～22g，由北京军事医学科学院动物中心提供。
2 方法与结果
2.1 HQS对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
取小鼠40只，随机分为5组，分别为：
, 百拇医药
I组：每天用蒸馏水灌胃，每只0.5mL，连续8d，作为正常对照组。
以下各组均每日皮下注射环磷酰胺(CTX)溶液，每只0.2mL，连续3d，使小鼠免疫功能受抑。并分别加用蒸馏水及3组剂量的HQS-V。
II组：每日注射CTX的同时加用蒸馏水灌胃(每只0.5mL)。3d后，单独使用蒸馏水灌胃，连续5d。
III组：每日注射CTX的同时灌胃100mg.kg-1组HQS-V 溶液，每只0.1mL，连续3d，3d后单独灌胃HQS-V，连续5d。
IV组：每日注射CTX的同时灌胃200mg.kg-1组HQS-V溶液，每只0.2mL，连续3d，3d后单独灌胃HQS-V，连续5d。
V组：每日注射CTX的同时灌胃400mg.kg-1组HQS-V溶液，每只0.4mL，连续3d，3d后单独灌胃HQS-V，连续5d。
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于给药第5天时各组动物均腹腔注射10%硫代乙醇酸钠每只0.5mL，待给药结束后，脱颈处死，腹腔注入含肝素的Hanks液8mL，然后剪开腹腔吸取所注入的Hanks液，移入试管，离心5min(1500rpm)。洗涤1次，弃去上清液，收集细胞，打匀，加入RPMI 1640完全培养液。用台盼兰染色，计数细胞数0.5×109/L-1，注入至96孔板，每孔100μL，每只鼠3个复孔。置于5%CO2培养箱，37℃下孵育2h,弃去上清液，用温Hanks液洗2次。每孔加0.5%中性红200μL，置于5%CO2培养箱，37℃下孵育30min，各孔上清弃去，用温Hanks液洗2次除去未吞噬的中性红，甩干。每孔加入细胞溶解液200μL，置于冰箱4℃过夜。然后用酶标仪测定其A值(波长490nm)。结果见表1
表1 HQS对免疫受抑小鼠腹腔ψ吞噬功能的影响 组别
动物数(只)
, http://www.100md.com
A值
I
II
III
IV
V
8
8
8
8
8
0.155±0.036
0.070±0.015
, 百拇医药
0.417±0.184
0.348±0.145
0.168±0.120
注： P<0.05 vs 模型组，P<0.01 vs
模型组(即造成免疫功能低下模型成功；给予不同剂量HQS-V均有提高T淋巴细胞增殖作用，以中小剂量明显)。
2.2 HQS-V 对小鼠脾T淋巴细胞增殖影响
取小鼠50只，随机分为5组，分组同上。
按常规方法〔1〕无菌制备各组小鼠脾细胞悬液(0.5×109/L-1)，滴入96孔板，每孔100μL，同时加入1g.L-1的conA 100μL，每只鼠3个复孔。置5%CO2、37℃培养72h。轻吸弃上清100μL，加入MTT溶液(MTT液浓度为1g.L-1)50μL(每孔50μg)，于振荡器上振荡1min。放置37℃，5%CO2孵箱内反应3h。取出后离心5min，吸弃上清，每孔加入酸化异丙醇120μL，振荡30s。在酶标光度计560nm处测取A值。结果见表2
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表2 HQS 对免疫受抑小鼠脾T淋巴细胞增殖的影响 组别
动物(只)
A值
I
II
III
IV
V
8
8
8
8
8
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0.058±0.019
0.026±0.015
0.020±0.010
0.082±0.015
0.104±0.025
注： P<0.05 vs 模型组，P<0.01 vs 模型组 即造成免疫功能低下模型成功；给予中、大剂量HQS-V均有提高T淋巴细胞增殖作用。
3 讨论
海鞘属于脊椎动物种属亲近的原索动物。它是一群以单体或群体生活的海栖生物，从1979年发现Didemin类化合物开始，已从被囊类动物中找到多种抗肿瘤、抗病毒活性物质，最近几年又有几类新化合物被发现，它们都显示了良好地抗肿瘤和免疫调节作用[2，3]。我们采用不同方法对渤、黄海海域内采集到的柄海鞘进行了分离和提取，发现较纯的一组化合物，对其进行了免疫药理方面的研究，结果显示小剂量(100mg*kg-1)及中剂量(200mg*kg-1)对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能影响更明显，剂量加大作用可能减弱；这种现象在中药研究中经常出现[4]。而对脾T淋巴细胞增殖功能的促进作用方面显示：中、大剂量(400mg*kg-1)的作用较小剂量更明显。从以上结果看在实际应用时尚需对剂量进行最佳选择。另外对该药在抗肿瘤方面也作了一些探索，得到了同样可喜的效果。
, 百拇医药
根据文献[5]报道，世界海洋中有被囊类动物2000余种，我国海域辽阔，生存的被囊类动物众多，对有天然的抗病毒、抗肿瘤生物活性物质的进一步提取、研究，将为新一代抗肿瘤、抗病毒海洋生物新药研制奠定良好的理论物质基础。
参考文献
1，陈敏珠，魏伟，张泓，等.徐叔云，卞如濂，陈修主编.药理实验方法学.第二版，北京，人民卫生出版社，1991：1212
2，Montgomery DW, Shen GK, Ulrich ED, et al. Immunomodulation by didemnins. Invertebrate marine natural products. Ann N Y Acad Sci,1994,15(712):301
3，Cheson BD. New chemotherapeutic agents for the treatment of low-grade non-Hodgkin's lymphomas. Semin Oncol，1993,20(5 Suppl 5):96
4，李仪奎.中药药理实验方法学.第一版，上海科学技术出版社，上海，1991：154
5，Urdiales JL, Morata P, Nunez De Castro I, et al. Antiproliferative effect of dehydrodidemnin B (DDB), A depsipeptide isolated from Mediterranean tunicates. Cancer Lett， 1996,102(1-2):31, 百拇医药
单位：魏振满 张苏刚 刘东平 程云 崔燕 刘明旭 张新全 蔡光明(北京302医院药理研究室，北京 100039)
关键词：海鞘活性成分，淋巴细胞增殖，巨噬细胞吞噬功能
中国海洋药物000510 摘 要 采用液-液分配色谱等方法对海洋生物——被囊类动物进行萃取分离，得到不同组分的活性提取物(以下称HQS)，主要观察HQS中一种组分(简称HQS-V)对免疫低下小鼠部分免疫功能指标的影响。通过环磷酰胺造成小鼠免疫功能低下，HQS-V按每日100、200、400mg.kg-1分成3组。结果显示100mg.kg-1及200mg.kg-1两组对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能影响更明显(模型组A值为0.070±0.015,100mg.kg-1组0.417±0.184,200mg.kg-1组0.348±0.145,400mg.kg-1组0.168±.0120)，而对脾T淋巴细胞增殖功能的促进作用方面显示：200mg.kg-1及400mg.kg-1两组的作用较100mg.kg-1组更明显(模型组A值为0.026±0.015,200mg.kg-1组0.082±0.015,400mg.kg-1组0.104±0.025)，在统计学上有显著性意义。研究提示渤、黄海海域内被囊类动物具有良好地抗肿瘤和免疫调节作用，这将为新一代抗肿瘤、抗病毒海洋生物新药研制奠定良好的理论物质基础。
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THE EFFECT OF ALLOPELAGIC ACTIVE COMPONENT (HQS-V) ON IMMUNE FUNCTION IN MICE
Wei zhenman Zhang sugang Liu Dongping Cheng Yun Cui Yan
(Department of Pharmacology,302 Hospital， Beijing 100039)
ABSTRACT Active Component of Ascidian Styela clava (HQS-V) on lymphocyte and macrophages function was investigated by MTT, neutral red. The results showed that HQS-V (100,200mg.kg-1) could stimulate peritoneal macrophages production in mice, HQS-V (200,400mg.kg-1) could enhance the function of conA-activated T lymphocyte. Didemnins in Bohai Huanghai Sea have antitumor and immunomodulation fuctions according to our reseach.
, 百拇医药
KEY WORDS Active Component of Ascidian Styela clava (HQS-V), Dedemnins, Tunicate, T-Lymphocyte, Macrophagocyte
当前海洋生化药物业已成为现代医药保健品开发研究的热点，由海洋生物活性物质中寻找抗肿瘤、抗病毒、抗真菌等生物活性物质，已成为国内外科学家研究的方向。我们采用液-液分配色谱等方法对海洋生物——被囊类动物海鞘进行萃取分离，得到不同组分的活性提取物，实验重点观察HQS-V对免疫低下小鼠部分免疫功能指标的影响。
1 实验材料
1.1 海洋生物活性成分HQS-V 由本室制备，柄海鞘(Styela Clava Herdman)，1997年9月采集于烟台附近海域，由北京医科大学林文翰教授及其研究有关人员鉴定。小鼠按每日100、200、400mg.kg-1分成3组，每组8只。
, 百拇医药
1.2 环磷酰胺 上海华联制药公司生产(批号 961028)，用生理盐水将其配制成10g.L-1,备用。
1.3 RPMI 1640完全培养液，含RPMI 1640(美国GIBCO公司生产)、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、10%新生小牛血清、硫化乙醇酸钠，北京邦定生物医学公司提供。
1.4 刀豆蛋白(sigma公司产品)，配成浓度(10mg.L-1)。
1.5 动物 BALB/C雌性小鼠，体重18～22g，由北京军事医学科学院动物中心提供。
2 方法与结果
2.1 HQS对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
取小鼠40只，随机分为5组，分别为：
, 百拇医药
I组：每天用蒸馏水灌胃，每只0.5mL，连续8d，作为正常对照组。
以下各组均每日皮下注射环磷酰胺(CTX)溶液，每只0.2mL，连续3d，使小鼠免疫功能受抑。并分别加用蒸馏水及3组剂量的HQS-V。
II组：每日注射CTX的同时加用蒸馏水灌胃(每只0.5mL)。3d后，单独使用蒸馏水灌胃，连续5d。
III组：每日注射CTX的同时灌胃100mg.kg-1组HQS-V 溶液，每只0.1mL，连续3d，3d后单独灌胃HQS-V，连续5d。
IV组：每日注射CTX的同时灌胃200mg.kg-1组HQS-V溶液，每只0.2mL，连续3d，3d后单独灌胃HQS-V，连续5d。
V组：每日注射CTX的同时灌胃400mg.kg-1组HQS-V溶液，每只0.4mL，连续3d，3d后单独灌胃HQS-V，连续5d。
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于给药第5天时各组动物均腹腔注射10%硫代乙醇酸钠每只0.5mL，待给药结束后，脱颈处死，腹腔注入含肝素的Hanks液8mL，然后剪开腹腔吸取所注入的Hanks液，移入试管，离心5min(1500rpm)。洗涤1次，弃去上清液，收集细胞，打匀，加入RPMI 1640完全培养液。用台盼兰染色，计数细胞数0.5×109/L-1，注入至96孔板，每孔100μL，每只鼠3个复孔。置于5%CO2培养箱，37℃下孵育2h,弃去上清液，用温Hanks液洗2次。每孔加0.5%中性红200μL，置于5%CO2培养箱，37℃下孵育30min，各孔上清弃去，用温Hanks液洗2次除去未吞噬的中性红，甩干。每孔加入细胞溶解液200μL，置于冰箱4℃过夜。然后用酶标仪测定其A值(波长490nm)。结果见表1
表1 HQS对免疫受抑小鼠腹腔ψ吞噬功能的影响 组别
动物数(只)
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A值
I
II
III
IV
V
8
8
8
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8
0.155±0.036
0.070±0.015
, 百拇医药
0.417±0.184
0.348±0.145
0.168±0.120
注： P<0.05 vs 模型组，P<0.01 vs
模型组(即造成免疫功能低下模型成功；给予不同剂量HQS-V均有提高T淋巴细胞增殖作用，以中小剂量明显)。
2.2 HQS-V 对小鼠脾T淋巴细胞增殖影响
取小鼠50只，随机分为5组，分组同上。
按常规方法〔1〕无菌制备各组小鼠脾细胞悬液(0.5×109/L-1)，滴入96孔板，每孔100μL，同时加入1g.L-1的conA 100μL，每只鼠3个复孔。置5%CO2、37℃培养72h。轻吸弃上清100μL，加入MTT溶液(MTT液浓度为1g.L-1)50μL(每孔50μg)，于振荡器上振荡1min。放置37℃，5%CO2孵箱内反应3h。取出后离心5min，吸弃上清，每孔加入酸化异丙醇120μL，振荡30s。在酶标光度计560nm处测取A值。结果见表2
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表2 HQS 对免疫受抑小鼠脾T淋巴细胞增殖的影响 组别
动物(只)
A值
I
II
III
IV
V
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0.058±0.019
0.026±0.015
0.020±0.010
0.082±0.015
0.104±0.025
注： P<0.05 vs 模型组，P<0.01 vs 模型组 即造成免疫功能低下模型成功；给予中、大剂量HQS-V均有提高T淋巴细胞增殖作用。
3 讨论
海鞘属于脊椎动物种属亲近的原索动物。它是一群以单体或群体生活的海栖生物，从1979年发现Didemin类化合物开始，已从被囊类动物中找到多种抗肿瘤、抗病毒活性物质，最近几年又有几类新化合物被发现，它们都显示了良好地抗肿瘤和免疫调节作用[2，3]。我们采用不同方法对渤、黄海海域内采集到的柄海鞘进行了分离和提取，发现较纯的一组化合物，对其进行了免疫药理方面的研究，结果显示小剂量(100mg*kg-1)及中剂量(200mg*kg-1)对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能影响更明显，剂量加大作用可能减弱；这种现象在中药研究中经常出现[4]。而对脾T淋巴细胞增殖功能的促进作用方面显示：中、大剂量(400mg*kg-1)的作用较小剂量更明显。从以上结果看在实际应用时尚需对剂量进行最佳选择。另外对该药在抗肿瘤方面也作了一些探索，得到了同样可喜的效果。
, 百拇医药
根据文献[5]报道，世界海洋中有被囊类动物2000余种，我国海域辽阔，生存的被囊类动物众多，对有天然的抗病毒、抗肿瘤生物活性物质的进一步提取、研究，将为新一代抗肿瘤、抗病毒海洋生物新药研制奠定良好的理论物质基础。
参考文献
1，陈敏珠，魏伟，张泓，等.徐叔云，卞如濂，陈修主编.药理实验方法学.第二版，北京，人民卫生出版社，1991：1212
2，Montgomery DW, Shen GK, Ulrich ED, et al. Immunomodulation by didemnins. Invertebrate marine natural products. Ann N Y Acad Sci,1994,15(712):301
3，Cheson BD. New chemotherapeutic agents for the treatment of low-grade non-Hodgkin's lymphomas. Semin Oncol，1993,20(5 Suppl 5):96
4，李仪奎.中药药理实验方法学.第一版，上海科学技术出版社，上海，1991：154
5，Urdiales JL, Morata P, Nunez De Castro I, et al. Antiproliferative effect of dehydrodidemnin B (DDB), A depsipeptide isolated from Mediterranean tunicates. Cancer Lett， 1996,102(1-2):31, 百拇医药