咬合力丧失对大鼠磨牙牙周膜bFGF表达的影响
作者：赵云凤 刘飞 李明哲 李甘地
单位：赵云凤(成都，华西医科大学口腔医学院修复科)；刘飞(成都，华西医科大学口腔医学院修复科)；李明哲(成都，华西医科大学口腔医学院修复科)；李甘地(华西医科大学第一附属医院病理科)
关键词：碱性成纤维细胞生长因子；咬合力；牙周膜
中华口腔医学杂志000510 【摘要】 目的 研究咬合力丧失后大鼠磨牙牙周膜(periodontal ligament, PDL)内碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)表达的动态变化，结合其他实验结果初步探讨了bFGF与Ⅰ型胶原mRNA表达的关系。方法 采用拔牙法建立咬合力丧失的动物模型,应用免疫组织化学法研究其磨牙牙周膜内bFGF表达的动态变化。结果 在1天、2天、3天、1周与2周，咬合力丧失组与正常咬合力组相比，牙周膜内bFGF表达差异有显著性(P<0.05)，3周后差异无显著性。结论 咬合力丧失时PDL内的bFGF表达增强。
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Effect of lost bite force on the expression of bFGF in rat molar periodontal ligament
ZHAO Yunfeng, LIU Fei, LI Mingzhe, et al.
(Department of Prosthodontics, College of Stomatology, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041, China)
【Abstract】 Objective To observe the dynamic change of the expression of basic fibroblast growth factor(bFGF) in rat molar periodontal ligament(PDL), combined with other experiments to probe into the relation of the expression between bFGF and typeⅠcollagen mRNA. Methods Animal model was established by extracting the left maxillary molars. Immunohistochemistry was applied.Results The expression of bFGF obviously increased from the first day to the second week (P<0.05), Came back to that of normal bite force group at the third week. There were strong negative relative relationship between the expression of bFGF and that of type Ⅰcollagen mRNA.Conclusion The expression of bFGF increased under lost bite force in rat molar PDL. The effect of bite force on the expression of PDL typeⅠcollagen mRNA is closely related to the expression of bFGF.
, 百拇医药
【Key words】 Fibroblast growth factor, basic； Bite force； Periodontal ligament
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)属于肝素结合生长因子家族，相对分子质量约为16 000，其氨基酸残基数为146个，等电点为9.5。bFGF是促细胞生长作用很强的多肽因子，能在低浓度(1 μg/L)下起作用。它具有广泛的生物学作用，能影响多种细胞的生长、分化及功能[1]。在牙周再生中也可能有一定作用。已有研究表明，bFGF能以一种剂量依赖方式增强牙周膜(periodontal ligament, PDL)细胞的增生反应，减弱Ⅰ型胶原mRNA的表达，而对Ⅲ型胶原mRNA及成纤维结合蛋白mRNA的表达则无影响[2]。bFGF还能抑制其他类型细胞的胶原及其mRNA的表达，如成骨细胞系MC 3T3-E1细胞[3]。我们在以往的实验中曾发现咬合力丧失后Ⅰ型胶原mRNA的表达受到抑制，而bFGF对Ⅰ型胶原mRAN的表达有负调控作用。这自然就引出一个问题，即咬合力丧失后Ⅰ型胶原mRAN表达的降低是否通过bFGF途径加以调控，或与其有关。本项研究采用免疫组织化学法研究了咬合力丧失后大鼠磨牙牙周膜内bFGF表达的动态变化，结合其他实验结果初步探讨了bFGF与Ⅰ型胶原mRNA表达的关系。
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材料与方法
1.咬合力丧失动物模型的建立：选用80只雄性体重为(250±20) g的Wistar成年大鼠，随机等量分为实验组和健康对照组，再根据动物处死时间，将两组各分为8组，每组5只。麻醉下拔除实验组动物左上颌全部磨牙，其左下颌磨牙因丧失对颌牙，咬合力亦丧失，咀嚼功能完全由右侧磨牙完成，左下颌磨牙构成咬合力丧失动物模型。未处理的健康对照组为正常咬合力模型。本项研究的建模主要是以文献及作者多年临床经验为依据。
2.标本制备：用4%多聚甲醛进行左心室灌注固定，解剖出含3颗磨牙的下颌骨骨段，再以4%多聚甲醛中后固定6小时，在脱钙液(含0.7 g/L EDTA，8 mg/L酒石酸钠钾，0.14 g/L酒石酸钠，99.2 ml/L HCl)中4℃浸泡2周。洗净脱钙液，行梯度乙醇脱水，石蜡包埋。每个下颌骨标本均制作3张组织切片，切片的厚度均控制为5μm，固定于经硅化处理的玻片上。
3.免疫组织化学染色程序(LSAB法)： 二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水；3%H2O2室温避光浸泡15 min；蒸馏水冲洗，磷酸盐缓冲液(PBS)洗5 min；滴加复合消化液，置于37℃下20 min；蒸馏水冲洗2 min×3次；10%正常羊血清室温下封闭10 min；倾去血清，滴加抗bFGF抗体，于37℃湿盒中孵育30 min，然后放置于4℃下过夜(14h)；PBS冲洗5 min×3次；加入生物素化羊抗兔IgG(1∶150)，于37℃湿盒中孵育30 min；PBS冲洗3 min×3次；加入辣根酶标记的链酶卵白素(1∶150)，于37℃湿盒中孵育30 min；PBS再冲洗3 min×3次；用新鲜配制的DAB显色液(按25 g/L DAB 20μl，1×PBS 1 ml, 3% H2O2 3μl配制)显色。以自来水冲洗中止反应；苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，加拿大胶封片。为防止假阳性，设置阴性对照实验，为用封闭血清代替一抗。
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4.结果处理： 采用四川大学图形图像研究所研制的Mias-2000型图像分析仪，对各组PDL染色强度进行测量。每只动物选用一张切片进行分析，测定第一磨牙双侧PDL平均灰度值，该值等于实际测量值减去同批阴性对照组相应的PDL灰度值。对测得的结果进行t检验。
结果
1.阴性对照实验：得到了阴性结果(图1)。
2. bFGF的表达(表1)：
(1)正常咬合力组：整个PDL细胞胞浆着色很浅，上下内外均匀一致(图2)。
(2)咬合力丧失组： 在1天组，PDL细胞胞浆着色明显增强(图3)；2天至2周各组的PDL细胞胞浆着色强度均与1天组相近，也是均匀一致；3周时PDL整体着色强度下降很多，与正常咬合力组相当(图4)；4周时的着色强度、方式与3周相当。
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图1 阴性对照结果(封闭血清代替一抗)，A 牙槽骨，D 牙本质，P 牙周膜，图2～4同
图2 大鼠磨牙牙周膜bFGF表达：正常咬合力组(×60)
图3 大鼠磨牙牙周膜bFGF表达：咬合力丧失1天组(×145)
图4 大鼠磨牙牙周膜bFGF表达：咬合力丧失3周组(×80)
讨论
作者在另外的实验中，用相同的动物模型已测得咬合力丧失后大鼠磨牙牙周膜Ⅰ型胶原mRNA的表达出现先减弱后回升的情况,与bFGF的表达变化相反(表1)。本项实验的结果表明，bFGF在 PDL中的表达水平与Ⅰ型胶原mRNA水平的高低有很强的相关性(相关系数γ=-0.84, P<0.01)。这与以往关于bFGF抑制Ⅰ型胶原mRNA表达的研究结果相吻合。Kennedy等[4](1995)发现bFGF可抑制人平滑肌细胞Ⅰ型胶原及其mRNA的表达。Tan等[5](1993)则发现bFGF可抑制Keloid成纤维细胞中Ⅰ型胶原及其mRNA的表达。Hurley等[3](1993)发现bFGF可以抑制成骨细胞系MC3T3-E1细胞中Ⅰ型胶原mRNA的表达。bFGF究竟是通过何种途径实现调节Ⅰ型胶原及其mRNA表达的机制，目前尚不明确。本项实验结果虽表明bFGF的表达水平同Ⅰ型胶原mRNA的表达有很强的相关关系，但二者间并非简单的因果关系。在6 h组，尽管Ⅰ型胶原mRNA的表达已下降，但bFGF的表达仍未上升，且二者变化的量化指标亦非完全一致。这说明PDL对Ⅰ型胶原mRNA表达的调控机制复杂，不是单一因素起作用，可能是通过多途径、多因子的相互调节。
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bFGF对成纤维细胞有促进有丝分裂的作用并可增强其分化功能。Deporter等[6](1982)用电镜法测得在咬合力增强与丧失时，大鼠PDL内的细胞密度增大。Beertsen[7](1987)的电镜分析也发现在咬合力不足时，小鼠磨牙PDL内的细胞密度增大。上述结果说明在这两种状态下，PDL内细胞有丝分裂活动增强。本项实验的结果与其相似，即咬合力增强与减弱时PDL内的bFGF表达均增强。bFGF可可以刺激成纤维细胞的有丝分裂，故PDL内的细胞表现为密度增大。
表1 两组标本bFGF的表达强度(平均灰度值，
±s) 组别
6h
1d
2d
, 百拇医药
3d
1W
2W
3W
4W
咬合力正常组
6.1±1.5
6.5±1.8
5.0±1.6
6.5±1.7
5.9±1.5
6.4±1.5
6.0±1.5
, 百拇医药
6.6±1.7
咬合力丧失组
7.8±2.7
18.9±5.9*
15.4±4.2*
11.3±2.8*
15.8±4.4*
13.5±3.4*
6.7±1.6
5.1±1.2
注：*与咬合力正常组相应值比较，差异有显著性(P<0.05) 基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970799)
, 百拇医药
参考文献
1，Wrana JL, Overall CM, Sodek J. Regulation of the expression of a secreted acidic protein rich in cysteine (SPARC) in human fibroblasts by transforming growth factor β. Eur J Biochem, 1991,197:519-528.
2，Takayama S, Murakami S, Miki Y. Effects of basic fibroblast growth factor on human periodontal ligament cells. J Periodont Res, 1997,32:667-675.
3，Hurley MM, Abren C, Harrison JR. Basic fibroblast growth factor inhibits type I collagen gene expression in osteoblastic MC3T3-E1 cells. J Biol Chem, 1993, 268:5588-5593.
, 百拇医药
4，Kennedy SH, Qin HP, Lin L . Basic fibroblast growth factor regulates type Ⅰcollagen and collagenase gene expression in human smooth muscle cells. Am J Pathol, 1995,146:764-771.
5，Tan EML, Rouda S, Greenbaum SE. Acidic and basic fibroblast growth factors down-regulate collagen gene expression in keloid fibroblasts. Am J Pathol， 1993,142:463-470.
6，Deporter DA， Svoboda ELA, Motruk W. A stereologic analysis of collagen phagocytosis by periodontal ligament fibroblasts during occlusal hypofunction in the rat. Archs oral Biology, 1982,27:1021-1025.
7，Beertsen W. Collagen phagocytosis by fibroblasts in the periodontal ligament of the mouse molar during the initial phase of hypofunction. J Dent Res， 1987,66:1708-1712.
(收稿日期：1999-11-25), 百拇医药
单位：赵云凤(成都，华西医科大学口腔医学院修复科)；刘飞(成都，华西医科大学口腔医学院修复科)；李明哲(成都，华西医科大学口腔医学院修复科)；李甘地(华西医科大学第一附属医院病理科)
关键词：碱性成纤维细胞生长因子；咬合力；牙周膜
中华口腔医学杂志000510 【摘要】 目的 研究咬合力丧失后大鼠磨牙牙周膜(periodontal ligament, PDL)内碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)表达的动态变化，结合其他实验结果初步探讨了bFGF与Ⅰ型胶原mRNA表达的关系。方法 采用拔牙法建立咬合力丧失的动物模型,应用免疫组织化学法研究其磨牙牙周膜内bFGF表达的动态变化。结果 在1天、2天、3天、1周与2周，咬合力丧失组与正常咬合力组相比，牙周膜内bFGF表达差异有显著性(P<0.05)，3周后差异无显著性。结论 咬合力丧失时PDL内的bFGF表达增强。
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Effect of lost bite force on the expression of bFGF in rat molar periodontal ligament
ZHAO Yunfeng, LIU Fei, LI Mingzhe, et al.
(Department of Prosthodontics, College of Stomatology, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041, China)
【Abstract】 Objective To observe the dynamic change of the expression of basic fibroblast growth factor(bFGF) in rat molar periodontal ligament(PDL), combined with other experiments to probe into the relation of the expression between bFGF and typeⅠcollagen mRNA. Methods Animal model was established by extracting the left maxillary molars. Immunohistochemistry was applied.Results The expression of bFGF obviously increased from the first day to the second week (P<0.05), Came back to that of normal bite force group at the third week. There were strong negative relative relationship between the expression of bFGF and that of type Ⅰcollagen mRNA.Conclusion The expression of bFGF increased under lost bite force in rat molar PDL. The effect of bite force on the expression of PDL typeⅠcollagen mRNA is closely related to the expression of bFGF.
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【Key words】 Fibroblast growth factor, basic； Bite force； Periodontal ligament
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)属于肝素结合生长因子家族，相对分子质量约为16 000，其氨基酸残基数为146个，等电点为9.5。bFGF是促细胞生长作用很强的多肽因子，能在低浓度(1 μg/L)下起作用。它具有广泛的生物学作用，能影响多种细胞的生长、分化及功能[1]。在牙周再生中也可能有一定作用。已有研究表明，bFGF能以一种剂量依赖方式增强牙周膜(periodontal ligament, PDL)细胞的增生反应，减弱Ⅰ型胶原mRNA的表达，而对Ⅲ型胶原mRNA及成纤维结合蛋白mRNA的表达则无影响[2]。bFGF还能抑制其他类型细胞的胶原及其mRNA的表达，如成骨细胞系MC 3T3-E1细胞[3]。我们在以往的实验中曾发现咬合力丧失后Ⅰ型胶原mRNA的表达受到抑制，而bFGF对Ⅰ型胶原mRAN的表达有负调控作用。这自然就引出一个问题，即咬合力丧失后Ⅰ型胶原mRAN表达的降低是否通过bFGF途径加以调控，或与其有关。本项研究采用免疫组织化学法研究了咬合力丧失后大鼠磨牙牙周膜内bFGF表达的动态变化，结合其他实验结果初步探讨了bFGF与Ⅰ型胶原mRNA表达的关系。
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材料与方法
1.咬合力丧失动物模型的建立：选用80只雄性体重为(250±20) g的Wistar成年大鼠，随机等量分为实验组和健康对照组，再根据动物处死时间，将两组各分为8组，每组5只。麻醉下拔除实验组动物左上颌全部磨牙，其左下颌磨牙因丧失对颌牙，咬合力亦丧失，咀嚼功能完全由右侧磨牙完成，左下颌磨牙构成咬合力丧失动物模型。未处理的健康对照组为正常咬合力模型。本项研究的建模主要是以文献及作者多年临床经验为依据。
2.标本制备：用4%多聚甲醛进行左心室灌注固定，解剖出含3颗磨牙的下颌骨骨段，再以4%多聚甲醛中后固定6小时，在脱钙液(含0.7 g/L EDTA，8 mg/L酒石酸钠钾，0.14 g/L酒石酸钠，99.2 ml/L HCl)中4℃浸泡2周。洗净脱钙液，行梯度乙醇脱水，石蜡包埋。每个下颌骨标本均制作3张组织切片，切片的厚度均控制为5μm，固定于经硅化处理的玻片上。
3.免疫组织化学染色程序(LSAB法)： 二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水；3%H2O2室温避光浸泡15 min；蒸馏水冲洗，磷酸盐缓冲液(PBS)洗5 min；滴加复合消化液，置于37℃下20 min；蒸馏水冲洗2 min×3次；10%正常羊血清室温下封闭10 min；倾去血清，滴加抗bFGF抗体，于37℃湿盒中孵育30 min，然后放置于4℃下过夜(14h)；PBS冲洗5 min×3次；加入生物素化羊抗兔IgG(1∶150)，于37℃湿盒中孵育30 min；PBS冲洗3 min×3次；加入辣根酶标记的链酶卵白素(1∶150)，于37℃湿盒中孵育30 min；PBS再冲洗3 min×3次；用新鲜配制的DAB显色液(按25 g/L DAB 20μl，1×PBS 1 ml, 3% H2O2 3μl配制)显色。以自来水冲洗中止反应；苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，加拿大胶封片。为防止假阳性，设置阴性对照实验，为用封闭血清代替一抗。
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4.结果处理： 采用四川大学图形图像研究所研制的Mias-2000型图像分析仪，对各组PDL染色强度进行测量。每只动物选用一张切片进行分析，测定第一磨牙双侧PDL平均灰度值，该值等于实际测量值减去同批阴性对照组相应的PDL灰度值。对测得的结果进行t检验。
结果
1.阴性对照实验：得到了阴性结果(图1)。
2. bFGF的表达(表1)：
(1)正常咬合力组：整个PDL细胞胞浆着色很浅，上下内外均匀一致(图2)。
(2)咬合力丧失组： 在1天组，PDL细胞胞浆着色明显增强(图3)；2天至2周各组的PDL细胞胞浆着色强度均与1天组相近，也是均匀一致；3周时PDL整体着色强度下降很多，与正常咬合力组相当(图4)；4周时的着色强度、方式与3周相当。
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图1 阴性对照结果(封闭血清代替一抗)，A 牙槽骨，D 牙本质，P 牙周膜，图2～4同
图2 大鼠磨牙牙周膜bFGF表达：正常咬合力组(×60)
图3 大鼠磨牙牙周膜bFGF表达：咬合力丧失1天组(×145)
图4 大鼠磨牙牙周膜bFGF表达：咬合力丧失3周组(×80)
讨论
作者在另外的实验中，用相同的动物模型已测得咬合力丧失后大鼠磨牙牙周膜Ⅰ型胶原mRNA的表达出现先减弱后回升的情况,与bFGF的表达变化相反(表1)。本项实验的结果表明，bFGF在 PDL中的表达水平与Ⅰ型胶原mRNA水平的高低有很强的相关性(相关系数γ=-0.84, P<0.01)。这与以往关于bFGF抑制Ⅰ型胶原mRNA表达的研究结果相吻合。Kennedy等[4](1995)发现bFGF可抑制人平滑肌细胞Ⅰ型胶原及其mRNA的表达。Tan等[5](1993)则发现bFGF可抑制Keloid成纤维细胞中Ⅰ型胶原及其mRNA的表达。Hurley等[3](1993)发现bFGF可以抑制成骨细胞系MC3T3-E1细胞中Ⅰ型胶原mRNA的表达。bFGF究竟是通过何种途径实现调节Ⅰ型胶原及其mRNA表达的机制，目前尚不明确。本项实验结果虽表明bFGF的表达水平同Ⅰ型胶原mRNA的表达有很强的相关关系，但二者间并非简单的因果关系。在6 h组，尽管Ⅰ型胶原mRNA的表达已下降，但bFGF的表达仍未上升，且二者变化的量化指标亦非完全一致。这说明PDL对Ⅰ型胶原mRNA表达的调控机制复杂，不是单一因素起作用，可能是通过多途径、多因子的相互调节。
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bFGF对成纤维细胞有促进有丝分裂的作用并可增强其分化功能。Deporter等[6](1982)用电镜法测得在咬合力增强与丧失时，大鼠PDL内的细胞密度增大。Beertsen[7](1987)的电镜分析也发现在咬合力不足时，小鼠磨牙PDL内的细胞密度增大。上述结果说明在这两种状态下，PDL内细胞有丝分裂活动增强。本项实验的结果与其相似，即咬合力增强与减弱时PDL内的bFGF表达均增强。bFGF可可以刺激成纤维细胞的有丝分裂，故PDL内的细胞表现为密度增大。
表1 两组标本bFGF的表达强度(平均灰度值，
±s) 组别6h
1d
2d
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3d
1W
2W
3W
4W
咬合力正常组
6.1±1.5
6.5±1.8
5.0±1.6
6.5±1.7
5.9±1.5
6.4±1.5
6.0±1.5
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6.6±1.7
咬合力丧失组
7.8±2.7
18.9±5.9*
15.4±4.2*
11.3±2.8*
15.8±4.4*
13.5±3.4*
6.7±1.6
5.1±1.2
注：*与咬合力正常组相应值比较，差异有显著性(P<0.05) 基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970799)
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参考文献
1，Wrana JL, Overall CM, Sodek J. Regulation of the expression of a secreted acidic protein rich in cysteine (SPARC) in human fibroblasts by transforming growth factor β. Eur J Biochem, 1991,197:519-528.
2，Takayama S, Murakami S, Miki Y. Effects of basic fibroblast growth factor on human periodontal ligament cells. J Periodont Res, 1997,32:667-675.
3，Hurley MM, Abren C, Harrison JR. Basic fibroblast growth factor inhibits type I collagen gene expression in osteoblastic MC3T3-E1 cells. J Biol Chem, 1993, 268:5588-5593.
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4，Kennedy SH, Qin HP, Lin L . Basic fibroblast growth factor regulates type Ⅰcollagen and collagenase gene expression in human smooth muscle cells. Am J Pathol, 1995,146:764-771.
5，Tan EML, Rouda S, Greenbaum SE. Acidic and basic fibroblast growth factors down-regulate collagen gene expression in keloid fibroblasts. Am J Pathol， 1993,142:463-470.
6，Deporter DA， Svoboda ELA, Motruk W. A stereologic analysis of collagen phagocytosis by periodontal ligament fibroblasts during occlusal hypofunction in the rat. Archs oral Biology, 1982,27:1021-1025.
7，Beertsen W. Collagen phagocytosis by fibroblasts in the periodontal ligament of the mouse molar during the initial phase of hypofunction. J Dent Res， 1987,66:1708-1712.
(收稿日期：1999-11-25), 百拇医药