bFGF、IGF-Ⅰ及TGF-β1对人髁突软骨细胞增殖的影响
作者：焦岩涛 王大章 韩文利 胡静
单位：焦岩涛(北京医科大学口腔医学院放射科，100081)；王大章(成都，华西医科大学口腔医学院口腔颌面外科610041)；韩文利(卫生部口腔医疗保健网蓝钻石口腔门诊)；胡静(成都，华西医科大学口腔医学院口腔颌面外科610041)
关键词：下颌骨髁状突；生长物质；软骨细胞
中华口腔医学杂志000508 【摘要】 目的 研究胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor Ⅰ, IGF-Ⅰ)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)单独及联合应用，对人髁突软骨细胞增殖的剂量-效应及时间-效应。方法 采用体外细胞培养技术及噻唑蓝比色法，对3种生长因子对软骨细胞增殖的调节作用进行观察。结果 在培养基中含0.4%血清条件下，TGF-β1、IGF-Ⅰ的作用不显著，bFGF有一定促增殖作用。在含10%血清条件下，3种生长因子均能显著促进细胞增殖，以bFGF最为突出(增加65%)，生长因子在各自一定浓度范围内呈量效关系。联合应用作用效果累加。生长因子促增殖效应可持续1周。结论 提示探索最佳生长因子组合可有效促进软骨细胞增殖及基质合成，可为关节软骨损伤性疾患的治疗提供一种有效的途径。
, 百拇医药
Effects of various growth factors on human mandibular condylar cartilage cell proliferation
JIAO Yantao
(Department of Radiology，School of Stomagology，Beijing Medical University，Beijing 100081，China)
WANG Dazhang, HAN Wen Li, et al.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of transforming growth factor-β1(TGF-β1)、insulin-like growth factor Ⅰ (IGF-Ⅰ) and basic fibroblast growth factor(bFGF) on human mandibular condylar cartilage(MCC) cell proliferation.Methods Isolated human MCC cells were cultured in DMEM supplemented with 10% newborn calf serum(NCS).The second passages were used in order to avoid chondrocyte dedifferentiation .Cells were seeded at 2×104/well on 96-well plate. After synchronization, medium was replaced by DMEM containing 0.4%NCS or 10%NCS with various growth factors，concentrations and combinations. Dose-response and time-course were studied by MTT colorimetric method. Results In 0.4% serum containing medium, bFGF stimulated the proliferation moderately, whereas TGF-β1 and IGF-Ⅰ had less effect. In 10% NCS condition, all three growth factors had mitogenic effect and acted dose-dependently. The effects were significant after three days. Among them, bFGF was a potent mitogen(increased by 65%), IGF-Ⅰ the next(24%). The effect of TGF-β1(13%) might be mediated by some other factors in the serum. The synergetic effects were achieved when they were used in combination. Conclusion It is suggested that optimal combination of growth factors can promote the proliferation of MCC cells significantly, this might be an ideal way in dealing with cartilage damage during pathogenesis.
, 百拇医药
【Key words】 Mandibular condyle； Growth substances； Chondrocytes
关节软骨对维持关节的正常功能起着重要的作用，但由于其特殊的解剖特点，关节软骨自身修复能力较差。常见的关节软骨损伤性疾患，如骨关节病、风湿性关节炎、关节挫伤等，多遗留关节软骨的永久性缺损，妨碍了关节的正常功能。目前尚无有效的促进关节软骨损伤后再生修复的方法。生长因子包括胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor Ⅰ, IGF-Ⅰ)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)等，可调节软骨细胞增殖、分化及代谢功能，并参与了关节软骨的生理及病理过程，有望单独或联合应用于关节软骨损伤的修复治疗[1]。以往多局限于对单一生长因子作用的研究，且研究对象多为低等动物软骨细胞。我们采用体外细胞培养技术及噻唑蓝(MTT)比色法，对3种生长因子单独及联合应用对人髁突软骨细胞增殖的影响进行了研究。
, 百拇医药
材料与方法
一、材料和试剂
Ⅱ型胶原酶，MTT(Sigma, USA)， bFGF、TGF-β1、IGF-Ⅰ及DMEM培养基(Gibco, USA)，小牛血清(NCS,华西医科大学分子生物学实验室产品)，二甲基亚砜(DMSO),其他试剂均为国产分析纯。
二、人胚髁突软骨细胞分离培养及鉴定
参照文献方法[2]，将经过机械分离及2.5 g/L胰蛋白酶、2 g/L胶原酶联合消化，获得的高成活率、均一的软骨细胞，接种于DMEM培养基中，内含10%小牛血清，青霉素105U/L，链霉素100 mg/L，于37℃、5%CO2孵育箱内饱和湿度下培养。培养细胞经细胞形态学观察及Ⅱ型胶原的免疫组织化学染色鉴定证实为软骨细胞(图1，2)。
, 百拇医药
三、bFGF、TGF-β1及IGF-Ⅰ对人髁突软骨细胞增殖的影响
取处于对数生长期的第2代人髁突软骨细胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，用DMEM培养基调整细胞浓度为1×108/L，定量接种于96孔板。待24 h细胞贴壁后，更换不含血清的DMEM培养基培养24 h，使细胞相对同步化。
1.生长因子对人髁突软骨细胞增殖的剂量-效应：取2张接种有细胞的96孔板，吸出无血清培养基，分别加入由含0.4%小牛血清或10%小牛血清DMEM配制的各种浓度的生长因子(0.1、0.5、 1.0、5.0、10.0、50.0及100.0 μg/L)，对照组不加生长因子，每个样本设4个复孔。继续培养72 h，终止实验前4 h，每孔加入20 μl MTT，再培养4 h，弃去培养液，每孔加入150 μl DMSO，振荡溶解10 min，于Bio-Tek El312E(USA)酶标光度仪595 nm波长下测定各孔的吸光度值(A值)。
, 百拇医药
2.生长因子对人髁突软骨细胞增殖的时间-效应：取4张接种有同步化人髁突软骨细胞的96孔培养板，分别加入含有最佳效应浓度(由剂量-效应实验获得)的3种生长因子的DMEM培养基，内含10%小牛血清。实验分组为：5.0 μg/L的TGF-β1、50.0 μg/L的IGF-Ⅰ及10 μg/L的bFGF。每组有4个平行孔，并设空白对照组，分别于培养后1、3、5、7 d随机取1张培养板，按上述方法测定A值。
3.生长因子交互作用对人髁突软骨细胞增殖的调节：3种生长因子分别选用各自的最佳效应浓度单独或联合应用，培养基含10%小牛血清。于培养第7天，按上述方法测定各样本的A值。
4.生长因子对人髁突软骨细胞形态的影响：在整个实验周期内，定期对各组细胞进行相差显微镜观察。
结果
一、 生长因子促增殖的剂量-效应
, 百拇医药
1. 0.4%血清条件下，TGF-β1及IGF-Ⅰ作用不显著，bFGF有明显的促增殖作用(图3)。
图1 培养人髁突软骨细胞为多角形及部分圆形(×100)
图2 培养人髁突软骨细胞Ⅱ型胶原的免疫组织化学染色呈阳性(免疫组化染色 ×100)
图3 生长因子促增殖作用的剂量-效应关系(0.4% NCS)
2. 10%血清条件下，3种生长因子均能促进软骨细胞增殖，且在各自相应浓度范围内bFGF(0.1～50.0 μg/L)、TGF-β1(0.1～5.0 μg/L)、IGF-Ⅰ(0.1～50.0 μg/L)呈剂量-效应关系，在最大效应剂量时，促增殖效应分别为bFGF 65%、 IGF-Ⅰ 24% 、TGF-β1 13%。超过最佳效应浓度后，作用下降(图4)。
, 百拇医药
图4 生长因子促增殖作用的剂量-效应关系(10% NCS)
二、生长因子促增殖的时间-效应
3种因子作用的第1天，促增殖效应均不显著，第3、5天后出现差异，IGF-Ⅰ、bFGF分别显示出一定的促增殖活性，第7天3种因子均显示出不同的促增殖效应(图5)。
图5 生长因子促增殖作用的时间-效应关系
图6 最佳效应浓度生长因子单独及交互作用对细胞增殖的影响
图7 IGF-Ⅰ作用组髁突软骨细胞，形态变化不显著(×100)
, 百拇医药
图8 bFGF及TGF-β1作用组，长梭形样细胞增多，密度增大，细胞重叠生长(×100)
三、生长因子交互作用对细胞增殖的影响
3种生长因子联合作用时，有协同作用，生长因子TGF-β1+IGF-Ⅰ促增殖作用约为57%，TGF-β1+bFGF为65%, IGF-Ⅰ+bFGF为66%， IGF-Ⅰ+bFGF+ TGF-β1为68%(图6)。
四、生长因子对软骨细胞形态的影响
正常培养的关节软骨细胞为不规则多角形，不能完全长满培养板(图1)。IGF-Ⅰ与对照组相比，形态变化不显著，但培养后期，细胞密度增大时，细胞极易脱落(图7)。加入bFGF或TGF-β1后，细胞形态发生变化，长梭形细胞增多，细胞密度明显增大，细胞重叠生长(图8)。TGF-β1与bFGF交互组，有明显的细胞集落形成，细胞重叠生长，失去接触抑制。
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讨论
关节软骨细胞的分化、增殖及基质合成能力直接影响了关节软骨功能状态及损伤后的修复。研究不同生长因子对人关节软骨细胞分化增殖的影响，对探讨生长因子的作用机理及寻找有效的生长因子及组合治疗软骨损伤具有重要的理论及现实意义。
血清中含多种已知和未知的激素及生长因子，为了避免血清对实验的影响，最初我们选用不含血清的DMEM进行培养，但无血清培养条件下细胞生长不能超过24 h，因此选用了在低浓度及高浓度血清条件下检测生长因子对人髁突软骨细胞的影响。
大多数组织细胞包括软骨细胞均能合成IGF-Ⅰ，以往研究显示IGF-Ⅰ是软骨分化、代谢的重要调节因子。IGF-Ⅰ对人及动物的大关节生长板软骨细胞具有促进增殖及基质合成的作用[3,4]。但对人下颌髁突软骨细胞的增殖、分化的研究，目前尚未见报道。我们的研究证实，IGF-Ⅰ在10%血清条件下能促进人髁突软骨细胞的增殖。且在0.1～50.0 μg/L浓度下呈剂量依赖性，最大效应下，较对照组增加了24%，超过50.0 μg/L其作用降低，这可能与细胞表面受体结合状态有关。但在培养基中含0.4%血清时，其作用不显著，提示IGF-Ⅰ促增殖作用有赖于血清中其他成分的介导。bFGF对起源于中胚层及神经外胚层的细胞均具有强的有丝分裂活性，除促进细胞增殖外，bFGF还具有调节细胞分化及代谢的功能。以往研究证实，关节软骨细胞具有bFGF的高、低亲合力受体，软骨细胞自身能够合成bFGF。体外研究显示，bFGF 可促进生长板软骨细胞增殖，并稳定其软骨表型[5,6]。动物实验表明，bFGF可促进关节软骨损伤的修复，我们研究发现，在0.4%及10% NCS条件下，bFGF均能够显著促进人髁突软骨细胞增殖，在3种生长因子中其作用最为突出。生长因子交互作用中，bFGF为主要的效应因子。鉴于其在髁突软骨细胞增殖及代谢中的特殊作用，可预测bFGF在软骨损伤修复中具有广阔的应用前景。TGF-β1是一种具有双向调节作用的生长因子，体外研究差异较大。我们研究表明，在低浓度血清条件下TGF-β1在1.0 μg/L浓度以下，有抑制增殖的作用。在10% NCS浓度条件下可促进软骨细胞的增殖。TGF-β1对关节软骨细胞的抑制作用可能是由于TGF-β1作用下，细胞大部分被阻断于S后期，只有在血清存在，在其他因子的调节下，使阻断于S后期的细胞释放，才出现一个促增殖效应。有研究表明，TGF-β1的作用可能依赖于表皮生长因子的调节[7] 。本研究与以往研究结果的差异可能由以下因素造成如：细胞来源、细胞分化程度、培养条件、培养基中血清浓度等。
, http://www.100md.com
体内软骨细胞往往是受多种生长因子的共同调节。已证实软骨细胞具有多种生长因子的受体。不同的生长因子可能作用于不同的生长周期，一种生长因子可以调节其他生长因子的表达和活性。基于此原理，作者等对生长因子联合应用对细胞的增殖作用进行了观察。结果表明联合应用可增强效果，促增殖作用超过任何单一因子的作用，但基本效应因子仍是bFGF。
通常认为，圆形、多角形软骨细胞体外保持了合成软骨特异性Ⅱ型胶原及蛋白多糖的功能，我们实验中观察到，IGF-Ⅰ作用组与对照组细胞形态无明显差别，而TGF-β1及bFGF作用组细胞形态发生显著改变，可见梭形成纤维细胞样细胞的出现，细胞重叠生长，伴有集落形成，而这种变化以往被认为是软骨细胞的“去分化”(dedifferentiation)表现，但这种形态发生改变的细胞是否发生了由合成Ⅱ型胶原到Ⅰ型胶原的转化，有待于进一步深入研究。在生理及病理条件下，生长因子作用是极其复杂的，是多种因子共同作用的结果，生长因子含量、相应受体数量以及细胞对其反应性的动态变化构成生长因子调控的复杂性。本研究探讨了3种生长因子对体外培养人髁突软骨细胞增殖的影响，但体外研究有其相对性，有关体内环境下生长因子作用的确切机理有待于更深入的研究。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39500164)
参考文献
1，Trippel SB, Coutts RD, Einhorn TA, et al. Growth factors as therapeutic agents. J Bone Joint Surg Am, 1996, 78:1 272-1 286.
2，焦岩涛，王大章，田卫东, 等. 人胚颞颌关节软骨细胞培养及生物学特性研究. 华西口腔医学杂志 , 1997, 15：187-189.
3，Trippel SB, Wroblewski J, Makower AM, et al. Regulation of growth-plate chondrocytes by insulin-like growth-factor I and basic fibroblast growth factor. J Bone Joint Surg Am, 1993, 75: 177-189.
, 百拇医药
4，Kato Y, Hiraki Y, Inoue H, et al. Differential and synergistic actioins of somatomedin-like growth factors, fibroblast gorwth factor and epidermal growth factor in rabbit costal chondrocytes. Eur J Biochem , 1983, 129:685-690.
5，Kato Y, Iwamoto M, Koike T, et al. Fibroblast growth factor stimulates colony formation of differentiated chondrocytes in soft agar. J Cell Physiol, 1987, 133: 491-498.
6，Jones KL, Addison J. Pituitary fibroblast growth factor as a stimulator of growth in cultured rabbit articular chondrocytes. Endocrinology , 1975, 97:359-365.
7，Skantze KA, Brinckerhot CE, Collier JP. Use of agarose culture to measure the effect of transforming growth factor beta and epidermal growth factor on rabbit articular chondrocytes. Cancer Res，1984，45: 4 416-4 421.
(收稿日期：1999-03-19), 百拇医药
单位：焦岩涛(北京医科大学口腔医学院放射科，100081)；王大章(成都，华西医科大学口腔医学院口腔颌面外科610041)；韩文利(卫生部口腔医疗保健网蓝钻石口腔门诊)；胡静(成都，华西医科大学口腔医学院口腔颌面外科610041)
关键词：下颌骨髁状突；生长物质；软骨细胞
中华口腔医学杂志000508 【摘要】 目的 研究胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor Ⅰ, IGF-Ⅰ)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)单独及联合应用，对人髁突软骨细胞增殖的剂量-效应及时间-效应。方法 采用体外细胞培养技术及噻唑蓝比色法，对3种生长因子对软骨细胞增殖的调节作用进行观察。结果 在培养基中含0.4%血清条件下，TGF-β1、IGF-Ⅰ的作用不显著，bFGF有一定促增殖作用。在含10%血清条件下，3种生长因子均能显著促进细胞增殖，以bFGF最为突出(增加65%)，生长因子在各自一定浓度范围内呈量效关系。联合应用作用效果累加。生长因子促增殖效应可持续1周。结论 提示探索最佳生长因子组合可有效促进软骨细胞增殖及基质合成，可为关节软骨损伤性疾患的治疗提供一种有效的途径。
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Effects of various growth factors on human mandibular condylar cartilage cell proliferation
JIAO Yantao
(Department of Radiology，School of Stomagology，Beijing Medical University，Beijing 100081，China)
WANG Dazhang, HAN Wen Li, et al.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of transforming growth factor-β1(TGF-β1)、insulin-like growth factor Ⅰ (IGF-Ⅰ) and basic fibroblast growth factor(bFGF) on human mandibular condylar cartilage(MCC) cell proliferation.Methods Isolated human MCC cells were cultured in DMEM supplemented with 10% newborn calf serum(NCS).The second passages were used in order to avoid chondrocyte dedifferentiation .Cells were seeded at 2×104/well on 96-well plate. After synchronization, medium was replaced by DMEM containing 0.4%NCS or 10%NCS with various growth factors，concentrations and combinations. Dose-response and time-course were studied by MTT colorimetric method. Results In 0.4% serum containing medium, bFGF stimulated the proliferation moderately, whereas TGF-β1 and IGF-Ⅰ had less effect. In 10% NCS condition, all three growth factors had mitogenic effect and acted dose-dependently. The effects were significant after three days. Among them, bFGF was a potent mitogen(increased by 65%), IGF-Ⅰ the next(24%). The effect of TGF-β1(13%) might be mediated by some other factors in the serum. The synergetic effects were achieved when they were used in combination. Conclusion It is suggested that optimal combination of growth factors can promote the proliferation of MCC cells significantly, this might be an ideal way in dealing with cartilage damage during pathogenesis.
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【Key words】 Mandibular condyle； Growth substances； Chondrocytes
关节软骨对维持关节的正常功能起着重要的作用，但由于其特殊的解剖特点，关节软骨自身修复能力较差。常见的关节软骨损伤性疾患，如骨关节病、风湿性关节炎、关节挫伤等，多遗留关节软骨的永久性缺损，妨碍了关节的正常功能。目前尚无有效的促进关节软骨损伤后再生修复的方法。生长因子包括胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor Ⅰ, IGF-Ⅰ)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)等，可调节软骨细胞增殖、分化及代谢功能，并参与了关节软骨的生理及病理过程，有望单独或联合应用于关节软骨损伤的修复治疗[1]。以往多局限于对单一生长因子作用的研究，且研究对象多为低等动物软骨细胞。我们采用体外细胞培养技术及噻唑蓝(MTT)比色法，对3种生长因子单独及联合应用对人髁突软骨细胞增殖的影响进行了研究。
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材料与方法
一、材料和试剂
Ⅱ型胶原酶，MTT(Sigma, USA)， bFGF、TGF-β1、IGF-Ⅰ及DMEM培养基(Gibco, USA)，小牛血清(NCS,华西医科大学分子生物学实验室产品)，二甲基亚砜(DMSO),其他试剂均为国产分析纯。
二、人胚髁突软骨细胞分离培养及鉴定
参照文献方法[2]，将经过机械分离及2.5 g/L胰蛋白酶、2 g/L胶原酶联合消化，获得的高成活率、均一的软骨细胞，接种于DMEM培养基中，内含10%小牛血清，青霉素105U/L，链霉素100 mg/L，于37℃、5%CO2孵育箱内饱和湿度下培养。培养细胞经细胞形态学观察及Ⅱ型胶原的免疫组织化学染色鉴定证实为软骨细胞(图1，2)。
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三、bFGF、TGF-β1及IGF-Ⅰ对人髁突软骨细胞增殖的影响
取处于对数生长期的第2代人髁突软骨细胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，用DMEM培养基调整细胞浓度为1×108/L，定量接种于96孔板。待24 h细胞贴壁后，更换不含血清的DMEM培养基培养24 h，使细胞相对同步化。
1.生长因子对人髁突软骨细胞增殖的剂量-效应：取2张接种有细胞的96孔板，吸出无血清培养基，分别加入由含0.4%小牛血清或10%小牛血清DMEM配制的各种浓度的生长因子(0.1、0.5、 1.0、5.0、10.0、50.0及100.0 μg/L)，对照组不加生长因子，每个样本设4个复孔。继续培养72 h，终止实验前4 h，每孔加入20 μl MTT，再培养4 h，弃去培养液，每孔加入150 μl DMSO，振荡溶解10 min，于Bio-Tek El312E(USA)酶标光度仪595 nm波长下测定各孔的吸光度值(A值)。
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2.生长因子对人髁突软骨细胞增殖的时间-效应：取4张接种有同步化人髁突软骨细胞的96孔培养板，分别加入含有最佳效应浓度(由剂量-效应实验获得)的3种生长因子的DMEM培养基，内含10%小牛血清。实验分组为：5.0 μg/L的TGF-β1、50.0 μg/L的IGF-Ⅰ及10 μg/L的bFGF。每组有4个平行孔，并设空白对照组，分别于培养后1、3、5、7 d随机取1张培养板，按上述方法测定A值。
3.生长因子交互作用对人髁突软骨细胞增殖的调节：3种生长因子分别选用各自的最佳效应浓度单独或联合应用，培养基含10%小牛血清。于培养第7天，按上述方法测定各样本的A值。
4.生长因子对人髁突软骨细胞形态的影响：在整个实验周期内，定期对各组细胞进行相差显微镜观察。
结果
一、 生长因子促增殖的剂量-效应
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1. 0.4%血清条件下，TGF-β1及IGF-Ⅰ作用不显著，bFGF有明显的促增殖作用(图3)。
图1 培养人髁突软骨细胞为多角形及部分圆形(×100)
图2 培养人髁突软骨细胞Ⅱ型胶原的免疫组织化学染色呈阳性(免疫组化染色 ×100)
图3 生长因子促增殖作用的剂量-效应关系(0.4% NCS)
2. 10%血清条件下，3种生长因子均能促进软骨细胞增殖，且在各自相应浓度范围内bFGF(0.1～50.0 μg/L)、TGF-β1(0.1～5.0 μg/L)、IGF-Ⅰ(0.1～50.0 μg/L)呈剂量-效应关系，在最大效应剂量时，促增殖效应分别为bFGF 65%、 IGF-Ⅰ 24% 、TGF-β1 13%。超过最佳效应浓度后，作用下降(图4)。
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图4 生长因子促增殖作用的剂量-效应关系(10% NCS)
二、生长因子促增殖的时间-效应
3种因子作用的第1天，促增殖效应均不显著，第3、5天后出现差异，IGF-Ⅰ、bFGF分别显示出一定的促增殖活性，第7天3种因子均显示出不同的促增殖效应(图5)。
图5 生长因子促增殖作用的时间-效应关系
图6 最佳效应浓度生长因子单独及交互作用对细胞增殖的影响
图7 IGF-Ⅰ作用组髁突软骨细胞，形态变化不显著(×100)
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图8 bFGF及TGF-β1作用组，长梭形样细胞增多，密度增大，细胞重叠生长(×100)
三、生长因子交互作用对细胞增殖的影响
3种生长因子联合作用时，有协同作用，生长因子TGF-β1+IGF-Ⅰ促增殖作用约为57%，TGF-β1+bFGF为65%, IGF-Ⅰ+bFGF为66%， IGF-Ⅰ+bFGF+ TGF-β1为68%(图6)。
四、生长因子对软骨细胞形态的影响
正常培养的关节软骨细胞为不规则多角形，不能完全长满培养板(图1)。IGF-Ⅰ与对照组相比，形态变化不显著，但培养后期，细胞密度增大时，细胞极易脱落(图7)。加入bFGF或TGF-β1后，细胞形态发生变化，长梭形细胞增多，细胞密度明显增大，细胞重叠生长(图8)。TGF-β1与bFGF交互组，有明显的细胞集落形成，细胞重叠生长，失去接触抑制。
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讨论
关节软骨细胞的分化、增殖及基质合成能力直接影响了关节软骨功能状态及损伤后的修复。研究不同生长因子对人关节软骨细胞分化增殖的影响，对探讨生长因子的作用机理及寻找有效的生长因子及组合治疗软骨损伤具有重要的理论及现实意义。
血清中含多种已知和未知的激素及生长因子，为了避免血清对实验的影响，最初我们选用不含血清的DMEM进行培养，但无血清培养条件下细胞生长不能超过24 h，因此选用了在低浓度及高浓度血清条件下检测生长因子对人髁突软骨细胞的影响。
大多数组织细胞包括软骨细胞均能合成IGF-Ⅰ，以往研究显示IGF-Ⅰ是软骨分化、代谢的重要调节因子。IGF-Ⅰ对人及动物的大关节生长板软骨细胞具有促进增殖及基质合成的作用[3,4]。但对人下颌髁突软骨细胞的增殖、分化的研究，目前尚未见报道。我们的研究证实，IGF-Ⅰ在10%血清条件下能促进人髁突软骨细胞的增殖。且在0.1～50.0 μg/L浓度下呈剂量依赖性，最大效应下，较对照组增加了24%，超过50.0 μg/L其作用降低，这可能与细胞表面受体结合状态有关。但在培养基中含0.4%血清时，其作用不显著，提示IGF-Ⅰ促增殖作用有赖于血清中其他成分的介导。bFGF对起源于中胚层及神经外胚层的细胞均具有强的有丝分裂活性，除促进细胞增殖外，bFGF还具有调节细胞分化及代谢的功能。以往研究证实，关节软骨细胞具有bFGF的高、低亲合力受体，软骨细胞自身能够合成bFGF。体外研究显示，bFGF 可促进生长板软骨细胞增殖，并稳定其软骨表型[5,6]。动物实验表明，bFGF可促进关节软骨损伤的修复，我们研究发现，在0.4%及10% NCS条件下，bFGF均能够显著促进人髁突软骨细胞增殖，在3种生长因子中其作用最为突出。生长因子交互作用中，bFGF为主要的效应因子。鉴于其在髁突软骨细胞增殖及代谢中的特殊作用，可预测bFGF在软骨损伤修复中具有广阔的应用前景。TGF-β1是一种具有双向调节作用的生长因子，体外研究差异较大。我们研究表明，在低浓度血清条件下TGF-β1在1.0 μg/L浓度以下，有抑制增殖的作用。在10% NCS浓度条件下可促进软骨细胞的增殖。TGF-β1对关节软骨细胞的抑制作用可能是由于TGF-β1作用下，细胞大部分被阻断于S后期，只有在血清存在，在其他因子的调节下，使阻断于S后期的细胞释放，才出现一个促增殖效应。有研究表明，TGF-β1的作用可能依赖于表皮生长因子的调节[7] 。本研究与以往研究结果的差异可能由以下因素造成如：细胞来源、细胞分化程度、培养条件、培养基中血清浓度等。
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体内软骨细胞往往是受多种生长因子的共同调节。已证实软骨细胞具有多种生长因子的受体。不同的生长因子可能作用于不同的生长周期，一种生长因子可以调节其他生长因子的表达和活性。基于此原理，作者等对生长因子联合应用对细胞的增殖作用进行了观察。结果表明联合应用可增强效果，促增殖作用超过任何单一因子的作用，但基本效应因子仍是bFGF。
通常认为，圆形、多角形软骨细胞体外保持了合成软骨特异性Ⅱ型胶原及蛋白多糖的功能，我们实验中观察到，IGF-Ⅰ作用组与对照组细胞形态无明显差别，而TGF-β1及bFGF作用组细胞形态发生显著改变，可见梭形成纤维细胞样细胞的出现，细胞重叠生长，伴有集落形成，而这种变化以往被认为是软骨细胞的“去分化”(dedifferentiation)表现，但这种形态发生改变的细胞是否发生了由合成Ⅱ型胶原到Ⅰ型胶原的转化，有待于进一步深入研究。在生理及病理条件下，生长因子作用是极其复杂的，是多种因子共同作用的结果，生长因子含量、相应受体数量以及细胞对其反应性的动态变化构成生长因子调控的复杂性。本研究探讨了3种生长因子对体外培养人髁突软骨细胞增殖的影响，但体外研究有其相对性，有关体内环境下生长因子作用的确切机理有待于更深入的研究。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39500164)
参考文献
1，Trippel SB, Coutts RD, Einhorn TA, et al. Growth factors as therapeutic agents. J Bone Joint Surg Am, 1996, 78:1 272-1 286.
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(收稿日期：1999-03-19), 百拇医药