急性白血病LRP、mdr1、MRP基因表达的预后意义
作者：任金海 董作仁 郭晓楠 徐世荣 王福旭 杜行严
单位：任金海 董作仁 郭晓楠 徐世荣 王福旭 杜行严(河北医科大学附属第二医院 石家庄 050000)
关键词：白血病；药物耐受性；基因表达；聚合酶链反应；预后
肿瘤000513 摘要：目的 研究急性白血病(AL)患者肺耐药蛋白(LRP)基因、多药耐药基因mdr1及多药耐药相关蛋白(MRP)基因表达的预后意义。方法 急性白血病61例。正常对照15例。采外周血或骨髓液，肝素抗凝，分离单个核细胞及分离总RNA。逆转录酶合成cDNA。设计扩增LRP、mdr1及MRP基因的引物进行PCR扩增。结果 正常对照及长期生存组三种耐药基因表达的阳性率均很低；初治组表达的阳性率较高；且初治组耐药基因表达阳性者，其完全缓解率(CR)显著低于表达阴性者；复发难治组表达水平显著高于前三组(P<0.05)；耐药基因的表达与FAB分型有关。结论 AL患者LRP、mdr1和MRP基因的表达具有重要的预后判断意义。
, 百拇医药
中图分类号：R733.71 文献标识码：A
文章编号：1000-7431(2000)05-0352-03
THE PROGNOSTIC SIGNIFICANCE OF LRP,MDR1，MRP GENE EXPRESSION IN PATIENTS WITH ACUTE LEUKEMIA
REN Jin-hai，DONG Zuo-ren,GUO Xiao-nan, et al.
(Department of Haematology, the Second Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000,P.R.China)
Abstract：Objective To study the prognostic significance of LRP, mdr1，MRP gene expression in patients with acute leukemia.Methods Heparinized blood or bone marrow samples were obtained from 61 cases of acute leukemia and 15 normal controls. Monouclear cells were separated by the acid-guanidium-phenol-chloroform method. The cDNA was synthesized using reverse transcriptase. The four pairs of primers chosen from the sequences of LRP, mdr1,MRP and β2 were used for the PCR. Results The positive percentrage of LRP. mdr1 and MRP gene expression in relapsed-refractory group were significantly higher than those in untreated, long-term survival and normal control group (P<0.05)。The 1st complete remisson (CR1) rate of LRP mdr, MRP negative patients were obviously higher than positive ones in the untreated group. These multidrug resistance gene expressions were correlated with FAB classification. Conclusion High expression of LRP, mdr1 and MRP gene is related to clinical multidrug resistance. Therefore, it may be regarded as an important factor of prognosis of patients with acute leukemia.
, 百拇医药
Key words：Leukemia; Drug resistance; Gene expression; Polymerase chain reaction; Prognosis
急性白血病(AL)患者的多药耐药(MDR)是导致化疗失败的主要原因。文献报道中多药耐药基因mdr1及多药耐药相关蛋白(MRP)基因的表达均与AL患者的临床耐药密切相关，肺耐药蛋白(LRP)基因是1993年发现的又一多药耐药基因。List等[1]研究发现LRP高表达在急性髓系白血病有重要的预后意义。作者采用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)的方法，以β2微球蛋白(β2M)作内对照，分别检测了初治、复发难治及长期生存AL患者的LRP、mdr1及MRP基因的表达，分析了三种多药耐药基因的表达与患者预后的关系。
材料与方法
, 百拇医药
一、临床病例 61例AL患者均符合FAB诊断标准，其中初治组37例，复发难治组17例，长期生存组(完全缓解3～8年)7例。中位年龄36岁(14～67岁)。男36例，女25例。FAB分型：急性淋巴细胞白血病(ALL)8例；急性髓细胞白血病(AML)53例(M1 1例，M2 16例，M3 11例，M4 10例，M5 12例，M6 2例，CML-BP 1例)。15例健康献血员为正常对照。
二、细胞分离及总RNA的提取 取静脉血5 ml或骨髓液2 ml，肝素抗凝，Ficoll淋巴细胞分离液4 ml，2000 r/min离心16 min，分离单个核细胞。采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法[2]提取细胞总RNA。
三、PCR引物 引物设计参考文献[3～5]，由美国CyberSyn公司合成(见表1)。
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四、cDNA合成及PCR扩增 逆转录反应体系15.5 μl，包括细胞总RNA 1 μg， 3′端引物100 ng，RNasin 20U，5x逆转录反应缓冲液4 μl，反转录酶1.6 U，42 ℃反应30 min，95 ℃ 5 min终止反应。PCR反应体系为40 μl，包括逆转录产物10 μl寡聚核苷酸引物各为150 pmol，dNTP浓度为200 μmol/L，10 × buffer 4 μl，Tag DNA 聚合酶 1.5 U。扩增条件为：94 ℃变性40 s，LRP 60 ℃，mdr1、MRP及β2 M 55 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s,在PCR扩增仪(美国PE公司)上扩增30个循环。取15 μl扩增产物，2 %琼脂糖凝胶电泳(75 V，50 min)，EB染色，紫外灯下观察结果。
五、统计 采用χ2检验。
表1 LRP、mdr1、MRP及β2M PCR引物 扩增基因
, 百拇医药
序列
退火
温度
片段
长度
LRP
正义
AGTCAGAAGCCGAGAAAG
60℃
340 bp
反义
CCCAGCCACAGCAAGGT
mdr1
, 百拇医药
正义
CCCATCATTGCAATAGCAGG
55℃
157 bp
反义
GTTCAAACTTCTGCTCCTCA
MRP
正义
GGACCTGGACTTCGTTCTCA
55℃
292 bp
反义
, 百拇医药
CGTCCAGACTTCTTCATCCG
β2M
正义
ACCCCCACTGAAAAAGATGA
55℃
115 bp
反义
ATCTTCAAACCTCCATCGATG
结 果
一、正常对照及各临床分组LRP、mdr1、MRP表达的阳性率 正常对照组及长期生存组三者表达的阳性率均很低；初治组中三者表达的阳性率分别为32.4 %、37.8 %和32.4 %；而复发难治组中三者表达的阳性率最高，分别为70.6%、58.8 %和64.7%，与前三组相比有显著差异(P<0.05)(见表2)。
, 百拇医药
表2 各组LRP、mdr1、MRP基因表达的阳性率 组 别
例数
阳性率(%)
LRP
mdr1
MRP
正常对照组
15
6.7
13.3
6.7
长期生存期
, 百拇医药
7
14.3
14.3
0
初 治 组
37
32.4
37.8
32.4
复发难治组
17
70.6
58.8
, 百拇医药
64.7
二、初治组AL患者三种基因表达与首次完全缓解(CR1)率之间的关系 初治组37例，LRP阳性12例，LRP阳性与LRP阴性的CR1率分别为33.3 %和84.0 % (P<0.005)。mdr1阳性14例，mdr1阳性与mdr1阴性的CR1率分别为42.9 %和82.6 % (P<0.05)。MRP阳性12例，MRP阳性与MRP阴性的CR1率分别为58.3 %和72.0 %(P>0.05)。
三、三种耐药基因的表达与FAB分型的关系 三种耐药基因在ALL表达的阳性率均显著高于在AML的表达；在AML各亚型中均以M5表达的阳性率最高，而M3表达的阳性率最低(见表3)。表3 三种多药耐药基因的表达与FAB分型的关系 FAB分型
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例数
阳性率(%)
LRP
mdr1
MRP
ALL
8
75.0
75.0
62.5
AML
53
35.8
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35.8
33.9
M2
16
31.3
37.5
31.3
M3
11
18.2
27.3
27.3
M4
, 百拇医药
10
50.0
40.0
40.0
M5
12
58.3
50.0
50.0
四、三种耐药基因联合表达对AL患者预后的影响 长期生存组中无联合表达：初治组中7例呈联合表达，分别为LRP+/mdr1+ 3例，LRP+/MRP+ 2例，mdr1+/MRP+ 2例，7例联合表达者仅1例获得CR，但于半年内复发；复发难治组中12例呈联合表达，分别为LRP+/mdr+1 5例，LRP+/MRP+ 2例，mdr+/MRP+ 1例，LRP+/mdr+1/MRP+4例，12例联合表达者无1例获得CR。
, 百拇医药
讨 论
多药耐药基因mdr1的蛋白产物P糖蛋白和MRP均是位于细胞膜上的能量依赖的溢出泵，能够将进入白血病细胞内的多种化疗药物泵出细胞外，导致多药耐药(MDR)产生。LRP是1993年发现的又一种新的与MDR有关的蛋白质，它是一种非糖蛋白，与P糖蛋白和MRP的作用机制不同，主要通过核靶点屏蔽机制引起MDR[6]。
本研究结果显示，三种多药耐药基因的表达均与AL患者的临床耐药密切相关，是AL患者极为不利的预后因素。分析其对预后的影响，发现复发难治组中联合表达的患者明显高于初治组，耐药基因联合表达的AL患者预后极差。说明AL患者的复发及难治不是单一因素作用，而是多种不同作用机制的耐药基因共同作用的结果。
本研究应用RT-PCR技术，同时检测了LRP、mdr1和MRP三种多药耐药基因在AL患者的表达，对AL患者具有重要的预后判断价值，值得临床推广。
, 百拇医药
作者简介：任金海，男，硕士，主治医师。
参考文献
[1]List AF, Spier CS, Grogan TM, et al. Overexpression of major vault transporter protein lung resistance protein predicts treatment outcome in actue myeloid leukemia〔J〕. Blood,1996,87:2464
[2]Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acidguanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extration〔J〕. Anal Biochem,1987,162:156
, 百拇医药
[3]Scheffer GL, Wijngaard PLG, Flens MJ, et al. The drug resistance-related protein LRP is the vault protein〔J〕. Nature Med,1995,1:578
[4]Noonan KE, Beck C, Holzmayer TA, et al. Quantitative analysis of MDR1 (multidrug resistance) gene expression in human tumors by polymerase chain reaction〔J〕. Proc Natl Acid Sci USA, 1990,87:7160
[5]Abbaszadegan MR, Futscher BW, Klimechi WT, et al. Analysis of multidrug resistance-associated protein (MRP), messenger RNA in normal and malignant hematopoietic cells〔J〕. Cancer Res, 1994,54:4676
[6]马仲才，胥 彬.引起肿瘤多药耐药的新蛋白肺耐瘤药蛋白〔J〕.肿瘤，1997，17：235
(收稿日期：1998-12-31；修回日期：1999-03-22), 百拇医药
单位：任金海 董作仁 郭晓楠 徐世荣 王福旭 杜行严(河北医科大学附属第二医院 石家庄 050000)
关键词：白血病；药物耐受性；基因表达；聚合酶链反应；预后
肿瘤000513 摘要：目的 研究急性白血病(AL)患者肺耐药蛋白(LRP)基因、多药耐药基因mdr1及多药耐药相关蛋白(MRP)基因表达的预后意义。方法 急性白血病61例。正常对照15例。采外周血或骨髓液，肝素抗凝，分离单个核细胞及分离总RNA。逆转录酶合成cDNA。设计扩增LRP、mdr1及MRP基因的引物进行PCR扩增。结果 正常对照及长期生存组三种耐药基因表达的阳性率均很低；初治组表达的阳性率较高；且初治组耐药基因表达阳性者，其完全缓解率(CR)显著低于表达阴性者；复发难治组表达水平显著高于前三组(P<0.05)；耐药基因的表达与FAB分型有关。结论 AL患者LRP、mdr1和MRP基因的表达具有重要的预后判断意义。
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中图分类号：R733.71 文献标识码：A
文章编号：1000-7431(2000)05-0352-03
THE PROGNOSTIC SIGNIFICANCE OF LRP,MDR1，MRP GENE EXPRESSION IN PATIENTS WITH ACUTE LEUKEMIA
REN Jin-hai，DONG Zuo-ren,GUO Xiao-nan, et al.
(Department of Haematology, the Second Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000,P.R.China)
Abstract：Objective To study the prognostic significance of LRP, mdr1，MRP gene expression in patients with acute leukemia.Methods Heparinized blood or bone marrow samples were obtained from 61 cases of acute leukemia and 15 normal controls. Monouclear cells were separated by the acid-guanidium-phenol-chloroform method. The cDNA was synthesized using reverse transcriptase. The four pairs of primers chosen from the sequences of LRP, mdr1,MRP and β2 were used for the PCR. Results The positive percentrage of LRP. mdr1 and MRP gene expression in relapsed-refractory group were significantly higher than those in untreated, long-term survival and normal control group (P<0.05)。The 1st complete remisson (CR1) rate of LRP mdr, MRP negative patients were obviously higher than positive ones in the untreated group. These multidrug resistance gene expressions were correlated with FAB classification. Conclusion High expression of LRP, mdr1 and MRP gene is related to clinical multidrug resistance. Therefore, it may be regarded as an important factor of prognosis of patients with acute leukemia.
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Key words：Leukemia; Drug resistance; Gene expression; Polymerase chain reaction; Prognosis
急性白血病(AL)患者的多药耐药(MDR)是导致化疗失败的主要原因。文献报道中多药耐药基因mdr1及多药耐药相关蛋白(MRP)基因的表达均与AL患者的临床耐药密切相关，肺耐药蛋白(LRP)基因是1993年发现的又一多药耐药基因。List等[1]研究发现LRP高表达在急性髓系白血病有重要的预后意义。作者采用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)的方法，以β2微球蛋白(β2M)作内对照，分别检测了初治、复发难治及长期生存AL患者的LRP、mdr1及MRP基因的表达，分析了三种多药耐药基因的表达与患者预后的关系。
材料与方法
, 百拇医药
一、临床病例 61例AL患者均符合FAB诊断标准，其中初治组37例，复发难治组17例，长期生存组(完全缓解3～8年)7例。中位年龄36岁(14～67岁)。男36例，女25例。FAB分型：急性淋巴细胞白血病(ALL)8例；急性髓细胞白血病(AML)53例(M1 1例，M2 16例，M3 11例，M4 10例，M5 12例，M6 2例，CML-BP 1例)。15例健康献血员为正常对照。
二、细胞分离及总RNA的提取 取静脉血5 ml或骨髓液2 ml，肝素抗凝，Ficoll淋巴细胞分离液4 ml，2000 r/min离心16 min，分离单个核细胞。采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法[2]提取细胞总RNA。
三、PCR引物 引物设计参考文献[3～5]，由美国CyberSyn公司合成(见表1)。
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四、cDNA合成及PCR扩增 逆转录反应体系15.5 μl，包括细胞总RNA 1 μg， 3′端引物100 ng，RNasin 20U，5x逆转录反应缓冲液4 μl，反转录酶1.6 U，42 ℃反应30 min，95 ℃ 5 min终止反应。PCR反应体系为40 μl，包括逆转录产物10 μl寡聚核苷酸引物各为150 pmol，dNTP浓度为200 μmol/L，10 × buffer 4 μl，Tag DNA 聚合酶 1.5 U。扩增条件为：94 ℃变性40 s，LRP 60 ℃，mdr1、MRP及β2 M 55 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s,在PCR扩增仪(美国PE公司)上扩增30个循环。取15 μl扩增产物，2 %琼脂糖凝胶电泳(75 V，50 min)，EB染色，紫外灯下观察结果。
五、统计 采用χ2检验。
表1 LRP、mdr1、MRP及β2M PCR引物 扩增基因
, 百拇医药
序列
退火
温度
片段
长度
LRP
正义
AGTCAGAAGCCGAGAAAG
60℃
340 bp
反义
CCCAGCCACAGCAAGGT
mdr1
, 百拇医药
正义
CCCATCATTGCAATAGCAGG
55℃
157 bp
反义
GTTCAAACTTCTGCTCCTCA
MRP
正义
GGACCTGGACTTCGTTCTCA
55℃
292 bp
反义
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CGTCCAGACTTCTTCATCCG
β2M
正义
ACCCCCACTGAAAAAGATGA
55℃
115 bp
反义
ATCTTCAAACCTCCATCGATG
结 果
一、正常对照及各临床分组LRP、mdr1、MRP表达的阳性率 正常对照组及长期生存组三者表达的阳性率均很低；初治组中三者表达的阳性率分别为32.4 %、37.8 %和32.4 %；而复发难治组中三者表达的阳性率最高，分别为70.6%、58.8 %和64.7%，与前三组相比有显著差异(P<0.05)(见表2)。
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表2 各组LRP、mdr1、MRP基因表达的阳性率 组 别
例数
阳性率(%)
LRP
mdr1
MRP
正常对照组
15
6.7
13.3
6.7
长期生存期
, 百拇医药
7
14.3
14.3
0
初 治 组
37
32.4
37.8
32.4
复发难治组
17
70.6
58.8
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64.7
二、初治组AL患者三种基因表达与首次完全缓解(CR1)率之间的关系 初治组37例，LRP阳性12例，LRP阳性与LRP阴性的CR1率分别为33.3 %和84.0 % (P<0.005)。mdr1阳性14例，mdr1阳性与mdr1阴性的CR1率分别为42.9 %和82.6 % (P<0.05)。MRP阳性12例，MRP阳性与MRP阴性的CR1率分别为58.3 %和72.0 %(P>0.05)。
三、三种耐药基因的表达与FAB分型的关系 三种耐药基因在ALL表达的阳性率均显著高于在AML的表达；在AML各亚型中均以M5表达的阳性率最高，而M3表达的阳性率最低(见表3)。表3 三种多药耐药基因的表达与FAB分型的关系 FAB分型
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例数
阳性率(%)
LRP
mdr1
MRP
ALL
8
75.0
75.0
62.5
AML
53
35.8
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35.8
33.9
M2
16
31.3
37.5
31.3
M3
11
18.2
27.3
27.3
M4
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10
50.0
40.0
40.0
M5
12
58.3
50.0
50.0
四、三种耐药基因联合表达对AL患者预后的影响 长期生存组中无联合表达：初治组中7例呈联合表达，分别为LRP+/mdr1+ 3例，LRP+/MRP+ 2例，mdr1+/MRP+ 2例，7例联合表达者仅1例获得CR，但于半年内复发；复发难治组中12例呈联合表达，分别为LRP+/mdr+1 5例，LRP+/MRP+ 2例，mdr+/MRP+ 1例，LRP+/mdr+1/MRP+4例，12例联合表达者无1例获得CR。
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多药耐药基因mdr1的蛋白产物P糖蛋白和MRP均是位于细胞膜上的能量依赖的溢出泵，能够将进入白血病细胞内的多种化疗药物泵出细胞外，导致多药耐药(MDR)产生。LRP是1993年发现的又一种新的与MDR有关的蛋白质，它是一种非糖蛋白，与P糖蛋白和MRP的作用机制不同，主要通过核靶点屏蔽机制引起MDR[6]。
本研究结果显示，三种多药耐药基因的表达均与AL患者的临床耐药密切相关，是AL患者极为不利的预后因素。分析其对预后的影响，发现复发难治组中联合表达的患者明显高于初治组，耐药基因联合表达的AL患者预后极差。说明AL患者的复发及难治不是单一因素作用，而是多种不同作用机制的耐药基因共同作用的结果。
本研究应用RT-PCR技术，同时检测了LRP、mdr1和MRP三种多药耐药基因在AL患者的表达，对AL患者具有重要的预后判断价值，值得临床推广。
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作者简介：任金海，男，硕士，主治医师。
参考文献
[1]List AF, Spier CS, Grogan TM, et al. Overexpression of major vault transporter protein lung resistance protein predicts treatment outcome in actue myeloid leukemia〔J〕. Blood,1996,87:2464
[2]Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acidguanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extration〔J〕. Anal Biochem,1987,162:156
, 百拇医药
[3]Scheffer GL, Wijngaard PLG, Flens MJ, et al. The drug resistance-related protein LRP is the vault protein〔J〕. Nature Med,1995,1:578
[4]Noonan KE, Beck C, Holzmayer TA, et al. Quantitative analysis of MDR1 (multidrug resistance) gene expression in human tumors by polymerase chain reaction〔J〕. Proc Natl Acid Sci USA, 1990,87:7160
[5]Abbaszadegan MR, Futscher BW, Klimechi WT, et al. Analysis of multidrug resistance-associated protein (MRP), messenger RNA in normal and malignant hematopoietic cells〔J〕. Cancer Res, 1994,54:4676
[6]马仲才，胥 彬.引起肿瘤多药耐药的新蛋白肺耐瘤药蛋白〔J〕.肿瘤，1997，17：235
(收稿日期：1998-12-31；修回日期：1999-03-22), 百拇医药