荧光原位杂交技术检测慢性B-CLL第12号染色体三体畸变
作者：周俊 石为 翁立红 胡晓彤 徐伟珍 顾文祥 张颜明
单位：周俊 石为 翁立红 胡晓彤 徐伟珍 顾文祥 张颜明(浙江大学湖滨校区组胚教研室/形态中心 杭州 310006)
关键词：荧光原位杂交；白血病；染色体；三体畸变
肿瘤000512 摘要：目的 检测20例慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)中第12号染色体三体畸变。方法 运用荧光原位杂交技术(FISH)。结果 6例(30%)患者有12号染色体三体(+12)，其中5例经染色体核型分析发现的+12均得到证实。在1例B-CLL中，染色体分析未发现任何分裂相，而FISH检测发现了+12克隆。在另1例B-CLL中，FISH不仅证实了染色体核型检查发现的存在于扁桃体的+12，同时还发现了染色体分析未发现的在外周血中的+12克隆。结论 本实验结果表明FISH在检测染色体畸变中比细胞遗传学核型分析方法敏感。
, 百拇医药
中图分类号：R730.43 文献标识码：A
文章编号：1000-7431(2000)05-0349-03
DETECTION OF TRISOMY 12 IN CHRONIC B LYMPHOCYTIC LEUKEMIA (B-CLL) BY FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION
ZHOU Jun, SHI Wei, WENG Li-hong, et al.
(Histology & Embryology Department and Morphology Center,Hubing College of Zhejiang University Zhejiang Hang-zhou 310006, P.R.China)
, 百拇医药
Abstract：Objective To detect trisomy 12 in 20 patients with B-CLL.Methods Using fluorescence in situ hybridization (FISH) technique with a centromeric probe for chromosome 12. Results Trisomy 12 was detected in 6 (30%) of 20 B-CLL, and in 5/6 cases trisomy 12 revealed by chromosome karyotyping was confirmed by FISH study; in another case, chromosome analysis found no mitosis, while FISH identified a trisomy 12 clone still in another B-CLL, cytogenetic study found +12 only in tonsil, while FISH not only proved +12 in tonsil but also in peripheral blood cells. Conclusion The study showed that FISH was more sensitive than traditional cytogenetics in detection of chromosome aberrations.
, 百拇医药
Key words：Fluorescence in stiu hybridization; Leukemia; Chromosome； Trisomy
慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)是淋巴细胞的恶性增殖性疾病，常见于男性中老年人。染色体核型分析发现第12号染色体三体(+12)，14q+，t/del(13q)和del(6q)是B-CLL中最为常见的染色体畸变。其中+12约占1/3[1]。检测+12不仅有助于B-CLL的诊断，而且有利于患者预后的判断。含有+12的B-CLL患者被认为预后较差[2]。荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization ,FISH) 是一种利用非放射性物质标记的核酸探针，检测细胞及染色体上特定DNA序列数目和结构等改变的方法，即可检测分裂相，也可检测间期细胞，具有快速、准确、敏感等优点[3]，利用FISH技术，本实验检测了20例B-CLL中+12畸变，并将结果与细胞遗传学检查进行比较。
, 百拇医药
材料与方法
一、病例 20例B-CLL中男性11例，女性9例，年龄39～76岁。受检标本包括淋巴结12例，扁桃体1例，5例淋巴结和1例扁桃体同时检查外周血细胞。7例仅检查外周血。所有病例均经过染色体核型分析，5例发现+12的克隆。经染色体核型分析剩余的细胞悬液滴于玻片上，室温晾干后供FISH检查。
二、对照 5例健康人的外周血淋巴细胞
三、荧光原位杂交 FISH方法参照Dohner等[4]方法，探针采用异硫氰酸盐荧光素(FITC)标记的第12号染色体着丝粒特异性DNA探针(D12Z1，Oncor，美国)，杂交液含1 ng/μl DNA探针，60%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖及1×SSC。
取1 μl～2 μl杂交液滴于细胞富含区，加盖玻片并用胶封闭，75 ℃～80 ℃变性8 min，37 ℃杂交过夜。杂交后玻片在60℃的0.1×SSC(pH8.0)中冲洗3次，每次2 min。随后依次在鼠抗FITC血清(DAKO，德国)和FITC标记的猴抗鼠抗体(Vector,德国)中分别温育20 min(抗体用磷酸缓冲液(pH 7.0)以1∶100稀释)。每次温育后用磷酸缓冲液冲洗3次，每次2 min。经两次循环放大后，玻片用含碘化丙碇(0.5 μg/ml)甘油封片，置Zeiss荧光显微镜下分析。每份材料至少分析200个细胞。
, 百拇医药
图7 FISH检测例6中的+12。两个细胞均显示三个D12Z1的杂交信号，说明有+12克隆。
结 果
对照组中超过98%的细胞显示致密、强荧光的黄绿色细小杂交信号。其中97%细胞有二个清晰的杂交点，代表一对正常的12号染色体；3%细胞仅有一个杂交信号，可能为二个杂交点重叠之故。未见含有三个杂交点的细胞。玻片背景清晰，无非特异性杂交。依据本实验对照组结果以及有关文献报道[4]，FISH检测+12的阳性标准设定为2%，即若材料有2%以上细胞有三个D12Z1的杂交点，即判定该材料细胞有+12。
20例受检的B-CLL中，FISH在6例(30%)中检测发现有+12克隆(见插页第Ⅱ页图7)，含有+12的畸变细胞率为2.4～34.0(附表)。其中5例细胞遗传学检查发现的+12均得到FISH证实。例2未能找到任何分裂相，因此无法诊断，而FISH却发现5%的细胞显示3个杂交信号，故有+12克隆。例1细胞遗传学仅在扁桃体中发现+12，外周血显示正常核型。而FISH发现两者均存在+12。
, 百拇医药
附表 6例B-CLL患者用FISH检测的+12结果 例号
性别
年龄(岁)
材料
染色体核型
FISH
总细胞数(个)
含不同杂交信号的细胞(%)
1
2
3
1
, 百拇医药 女
63
PB
46，XX[4]
610
2.0
95.4
2.6
Tonsil
47,XX,+12[4]
305
2.3
91.1
, 百拇医药
6.6
2
男
51
LN
No mitoses
200
3.0
92.0
5.0
3
女
72
, 百拇医药 PB
47，XX，+12[25]
200
4.0
73.0
23.0
4
男
58
PB
46，X，-Y，+12[19]
179
2.2
, http://www.100md.com
69.8
28.0
5
女
76
PB
46，XX[4]
634
2.2
95.4
2.4
6
男
, 百拇医药
68
PB
47，XY，+12[9]
200
2.5
63.5
34.0
PB：外周血 LN：淋巴结 Tonsil:扁桃体
讨 论
B-CLL的恶性细胞在体外不易生长，常致染色体分析失败或仅见正常核型。本实验用FISH检测了20例B-CLL的+12情况，标本分别包括外周血、淋巴结或扁桃体。
本实验结果发现6例B-CLL有+12，检出率为30.0%，而细胞遗传学检查发现5例有+12，检出率25.0%，证实+12是B-CLL常见的染色体畸变。在例2虽未能找到任何分裂相，但FISH却发现存在+12克隆。例1经细胞遗传学检查仅在其扁桃体标本中检测到+12，其外周血只发现正常核型，而FISH在两者均检测到+12，扁桃体的畸变细胞率为6.6%，外周血的畸变细胞率为2.6%。上述结果显示FISH在检测染色体畸变方面比常规的染色体核型分析敏感。
, 百拇医药
含有+12的畸变细胞率在各例间相差较大(2.4%～34.0%)，与文献报道类似[5]。有实验证明，在B-CLL中+12克隆仅局限于B淋巴细胞中[6]。本研究结果也支持+12可能是B-CLL的一个继发性的，而非原发性的染色体畸变[5]。
因为FISH能对大量间期细胞进行分析，所以比较适用于检测含有少量肿瘤细胞的标本。本实验结果也反映出B-CLL中肿瘤细胞对淋巴结的浸润和在外周血的出现有所不同，其对淋巴结的浸润更多，这也与临床B-CLL，以淋巴结肿大最为常见相一致。众多研究还表明，FISH不仅检测三体现象，且能检测易位等多种染色体的异常；因而优于传统的细胞遗传学方法。诚然，传统的细胞遗传学方法仍可作为一种较廉价的初筛手段。若两者相辅相成，那末就可以既经济又灵敏的对可疑对象进行查验。
基金项目：浙江省教委资助项目，编号961063
, 百拇医药
作者简介：周俊，女，硕士，讲师。
参考文献
[1]Heim S, Mitelman F. Cancer cytogenetics〔M〕.New Yrok:Alan R Liss,1987:1752
[2]Juliusson G, Ganhrton G. Chromosome aberrations in B-CLL〔J〕. Cancer Cytogenetics,1990,45:143
[3]Gray JW, Pinkel D. Molecular cytogenetics in human cancer diagnosis〔J〕. Cancer,1992,69:1536
[4]Dohner H,Pohl S, Bulgay M, et al. Trisomy 12 in chronic lymphocytic leukemia:a metaphase and interphase cytogenetics analysis〔J〕. Leukemia,1993,7:516
, http://www.100md.com
[5]Raghoebier S, Kibbelaar RE, Kleiverda JK, et al. Mosaicism of trisomy 12 in chronic lymphocytic leukemia detected by nonradioactive in situ hybridization〔J〕. Leukemia,1992,6:1220
[6]Knuutila S, Elonen E, Teerenhori L, et al. Trisomy 12 in B cells of patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia〔J〕. N Engl J Med,1996,314:865
(收稿日期：1999-03-30), 百拇医药
单位：周俊 石为 翁立红 胡晓彤 徐伟珍 顾文祥 张颜明(浙江大学湖滨校区组胚教研室/形态中心 杭州 310006)
关键词：荧光原位杂交；白血病；染色体；三体畸变
肿瘤000512 摘要：目的 检测20例慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)中第12号染色体三体畸变。方法 运用荧光原位杂交技术(FISH)。结果 6例(30%)患者有12号染色体三体(+12)，其中5例经染色体核型分析发现的+12均得到证实。在1例B-CLL中，染色体分析未发现任何分裂相，而FISH检测发现了+12克隆。在另1例B-CLL中，FISH不仅证实了染色体核型检查发现的存在于扁桃体的+12，同时还发现了染色体分析未发现的在外周血中的+12克隆。结论 本实验结果表明FISH在检测染色体畸变中比细胞遗传学核型分析方法敏感。
, 百拇医药
中图分类号：R730.43 文献标识码：A
文章编号：1000-7431(2000)05-0349-03
DETECTION OF TRISOMY 12 IN CHRONIC B LYMPHOCYTIC LEUKEMIA (B-CLL) BY FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION
ZHOU Jun, SHI Wei, WENG Li-hong, et al.
(Histology & Embryology Department and Morphology Center,Hubing College of Zhejiang University Zhejiang Hang-zhou 310006, P.R.China)
, 百拇医药
Abstract：Objective To detect trisomy 12 in 20 patients with B-CLL.Methods Using fluorescence in situ hybridization (FISH) technique with a centromeric probe for chromosome 12. Results Trisomy 12 was detected in 6 (30%) of 20 B-CLL, and in 5/6 cases trisomy 12 revealed by chromosome karyotyping was confirmed by FISH study; in another case, chromosome analysis found no mitosis, while FISH identified a trisomy 12 clone still in another B-CLL, cytogenetic study found +12 only in tonsil, while FISH not only proved +12 in tonsil but also in peripheral blood cells. Conclusion The study showed that FISH was more sensitive than traditional cytogenetics in detection of chromosome aberrations.
, 百拇医药
Key words：Fluorescence in stiu hybridization; Leukemia; Chromosome； Trisomy
慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)是淋巴细胞的恶性增殖性疾病，常见于男性中老年人。染色体核型分析发现第12号染色体三体(+12)，14q+，t/del(13q)和del(6q)是B-CLL中最为常见的染色体畸变。其中+12约占1/3[1]。检测+12不仅有助于B-CLL的诊断，而且有利于患者预后的判断。含有+12的B-CLL患者被认为预后较差[2]。荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization ,FISH) 是一种利用非放射性物质标记的核酸探针，检测细胞及染色体上特定DNA序列数目和结构等改变的方法，即可检测分裂相，也可检测间期细胞，具有快速、准确、敏感等优点[3]，利用FISH技术，本实验检测了20例B-CLL中+12畸变，并将结果与细胞遗传学检查进行比较。
, 百拇医药
材料与方法
一、病例 20例B-CLL中男性11例，女性9例，年龄39～76岁。受检标本包括淋巴结12例，扁桃体1例，5例淋巴结和1例扁桃体同时检查外周血细胞。7例仅检查外周血。所有病例均经过染色体核型分析，5例发现+12的克隆。经染色体核型分析剩余的细胞悬液滴于玻片上，室温晾干后供FISH检查。
二、对照 5例健康人的外周血淋巴细胞
三、荧光原位杂交 FISH方法参照Dohner等[4]方法，探针采用异硫氰酸盐荧光素(FITC)标记的第12号染色体着丝粒特异性DNA探针(D12Z1，Oncor，美国)，杂交液含1 ng/μl DNA探针，60%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖及1×SSC。
取1 μl～2 μl杂交液滴于细胞富含区，加盖玻片并用胶封闭，75 ℃～80 ℃变性8 min，37 ℃杂交过夜。杂交后玻片在60℃的0.1×SSC(pH8.0)中冲洗3次，每次2 min。随后依次在鼠抗FITC血清(DAKO，德国)和FITC标记的猴抗鼠抗体(Vector,德国)中分别温育20 min(抗体用磷酸缓冲液(pH 7.0)以1∶100稀释)。每次温育后用磷酸缓冲液冲洗3次，每次2 min。经两次循环放大后，玻片用含碘化丙碇(0.5 μg/ml)甘油封片，置Zeiss荧光显微镜下分析。每份材料至少分析200个细胞。
, 百拇医药
图7 FISH检测例6中的+12。两个细胞均显示三个D12Z1的杂交信号，说明有+12克隆。
结 果
对照组中超过98%的细胞显示致密、强荧光的黄绿色细小杂交信号。其中97%细胞有二个清晰的杂交点，代表一对正常的12号染色体；3%细胞仅有一个杂交信号，可能为二个杂交点重叠之故。未见含有三个杂交点的细胞。玻片背景清晰，无非特异性杂交。依据本实验对照组结果以及有关文献报道[4]，FISH检测+12的阳性标准设定为2%，即若材料有2%以上细胞有三个D12Z1的杂交点，即判定该材料细胞有+12。
20例受检的B-CLL中，FISH在6例(30%)中检测发现有+12克隆(见插页第Ⅱ页图7)，含有+12的畸变细胞率为2.4～34.0(附表)。其中5例细胞遗传学检查发现的+12均得到FISH证实。例2未能找到任何分裂相，因此无法诊断，而FISH却发现5%的细胞显示3个杂交信号，故有+12克隆。例1细胞遗传学仅在扁桃体中发现+12，外周血显示正常核型。而FISH发现两者均存在+12。
, 百拇医药
附表 6例B-CLL患者用FISH检测的+12结果 例号
性别
年龄(岁)
材料
染色体核型
FISH
总细胞数(个)
含不同杂交信号的细胞(%)
1
2
3
1
, 百拇医药 女
63
PB
46，XX[4]
610
2.0
95.4
2.6
Tonsil
47,XX,+12[4]
305
2.3
91.1
, 百拇医药
6.6
2
男
51
LN
No mitoses
200
3.0
92.0
5.0
3
女
72
, 百拇医药 PB
47，XX，+12[25]
200
4.0
73.0
23.0
4
男
58
PB
46，X，-Y，+12[19]
179
2.2
, http://www.100md.com
69.8
28.0
5
女
76
PB
46，XX[4]
634
2.2
95.4
2.4
6
男
, 百拇医药
68
PB
47，XY，+12[9]
200
2.5
63.5
34.0
PB：外周血 LN：淋巴结 Tonsil:扁桃体
讨 论
B-CLL的恶性细胞在体外不易生长，常致染色体分析失败或仅见正常核型。本实验用FISH检测了20例B-CLL的+12情况，标本分别包括外周血、淋巴结或扁桃体。
本实验结果发现6例B-CLL有+12，检出率为30.0%，而细胞遗传学检查发现5例有+12，检出率25.0%，证实+12是B-CLL常见的染色体畸变。在例2虽未能找到任何分裂相，但FISH却发现存在+12克隆。例1经细胞遗传学检查仅在其扁桃体标本中检测到+12，其外周血只发现正常核型，而FISH在两者均检测到+12，扁桃体的畸变细胞率为6.6%，外周血的畸变细胞率为2.6%。上述结果显示FISH在检测染色体畸变方面比常规的染色体核型分析敏感。
, 百拇医药
含有+12的畸变细胞率在各例间相差较大(2.4%～34.0%)，与文献报道类似[5]。有实验证明，在B-CLL中+12克隆仅局限于B淋巴细胞中[6]。本研究结果也支持+12可能是B-CLL的一个继发性的，而非原发性的染色体畸变[5]。
因为FISH能对大量间期细胞进行分析，所以比较适用于检测含有少量肿瘤细胞的标本。本实验结果也反映出B-CLL中肿瘤细胞对淋巴结的浸润和在外周血的出现有所不同，其对淋巴结的浸润更多，这也与临床B-CLL，以淋巴结肿大最为常见相一致。众多研究还表明，FISH不仅检测三体现象，且能检测易位等多种染色体的异常；因而优于传统的细胞遗传学方法。诚然，传统的细胞遗传学方法仍可作为一种较廉价的初筛手段。若两者相辅相成，那末就可以既经济又灵敏的对可疑对象进行查验。
基金项目：浙江省教委资助项目，编号961063
, 百拇医药
作者简介：周俊，女，硕士，讲师。
参考文献
[1]Heim S, Mitelman F. Cancer cytogenetics〔M〕.New Yrok:Alan R Liss,1987:1752
[2]Juliusson G, Ganhrton G. Chromosome aberrations in B-CLL〔J〕. Cancer Cytogenetics,1990,45:143
[3]Gray JW, Pinkel D. Molecular cytogenetics in human cancer diagnosis〔J〕. Cancer,1992,69:1536
[4]Dohner H,Pohl S, Bulgay M, et al. Trisomy 12 in chronic lymphocytic leukemia:a metaphase and interphase cytogenetics analysis〔J〕. Leukemia,1993,7:516
, http://www.100md.com
[5]Raghoebier S, Kibbelaar RE, Kleiverda JK, et al. Mosaicism of trisomy 12 in chronic lymphocytic leukemia detected by nonradioactive in situ hybridization〔J〕. Leukemia,1992,6:1220
[6]Knuutila S, Elonen E, Teerenhori L, et al. Trisomy 12 in B cells of patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia〔J〕. N Engl J Med,1996,314:865
(收稿日期：1999-03-30), 百拇医药