高三尖杉酯碱诱导急性白血病原代细胞凋亡的观察
作者：李颢 徐健 闵捷 张福东 彭翠兰 徐功立
单位：李颢(山东医科大学研究生 济南 250012)；徐健 闵捷 张福东 彭翠兰 徐功立(山东省立医院)
关键词：高三尖杉酯碱；急性白血病；凋亡
肿瘤000506 摘要：目的 观察高三尖杉酯碱(HHar)诱导急性白血病(AL)原代细胞凋亡的形态、生化特征，并分析量效关系，以指导临床治疗。方法 经HHar作用后的AL原代细胞由光镜、电镜观察形态特征，DNA凝胶电泳、二苯胺法测定生化特征，SSPS软件分析量效关系。结果 HHar作用后AL原代细胞形态、生化特征均符合典型的细胞凋亡改变；其DNA片段化率随HHar作用时间的延长，浓度的增高而增加，具有时间——效应及剂量——效应线性趋势。DNA片段化率与坏死率正相关。结论 HHar确可诱导AL原代细胞凋亡。其诱导细胞凋亡的能力因剂量、作用时间的不同而不同。
, http://www.100md.com
中图分类号：R73-361 文献标识码：A
文章编号：1000-7431(2000)05-0331-04
OBSERVATION OF THE APOPTOSIS OF PRIMARY ACUTE LEUKEMIA CELLS INDUCECD BY HOMOHARRINGTONINUM
LI Hao,XU Jian, MIN Jie, et al.
(Shandong Medical University，Jinan 250012,China)
Abstract：Objective To observe the characteristics of apoptosis of primary actue leukemia cells induced by homoharringtoninum(HHar).Methods The morphological changes were observed by microscope, SEM and TEM, the biochemical characteristics were observed by DNA agarose gel electrophoresis, internucleosomal DNA fragmentation ratios. The time-dose-effect relationship was analyzed by SSPS software. Results The morphological and biochemical characteristics of apoptosis of primary acute leukemia cells induced by HHar were in common with the typical changes. The DNA fragmentation ratios of the primary leukemia cells increased gradully with increasing time and increasing HHar dose showing a time-effect and dose-effect linear trend, and was positively correlated to the necrosis rates of the cells. Conclusion HHar can induce primary acute leukemia cells apoptosis. Its effect is various according to different concentration and different time.
, 百拇医药
Key words：Homoharringtoninum; Leukemia,acute; Apoptosis
高三尖杉酯碱(HHar)是临床常用的化疗药物之一，近年来随着诱导细胞凋亡的治疗方法的认可及应用，人们提出小剂量HHar的作用是以诱导细胞凋亡为主，为验证这一推测，作者选取成人AL原代细胞为研究对象，观察HHar作用后细胞形态、生化特征改变，并进一步分析量效关系，为临床具体用药提供可靠的理论依据。
材料与方法
一、病例 收集初诊AL病人骨髓10例，按1986年天津会议标准分型。年龄17～44岁，男性7例，女性3例。ALL-L2 4例，AML-M2a 3例，AML-M3b 2例，AML-M5a 1例。外周血白细胞计数：1.0×109/L～52.60×109/L，骨髓原+早(原+幼)占：70.4%～92.5%。
, 百拇医药
二、药液配制 取HHar临床常用量5 mg、2.5 mg、0.5 mg，依公式[1]计算得相应的近似最大血药浓度为：1.0 mg/L、0.5 mg/L、0.1 mg/L。配制成相应浓度药液，-20 ℃避光保存。
三、培养体系制备 抽取患者骨髓5 ml，加肝素0.3 ml抗凝(125 U/ml)，制成单个核细胞悬液后常规分离，用含10% 小牛血清RPMI 1640制成5×105/ml细胞悬液。分离后细胞成活率为100%，原+早(原+幼)占95%以上。分别加入不同浓度药物，使终浓度达到最大血药浓度。以同一病人原代细胞不加药组为对照组。置37℃、5 % CO2饱和湿度培养箱内培养。
四、Giemsa染色、扫描电镜、透射电镜观察 HHar作用后AL原代细胞的形态及超微结构改变[2]。
五、DNA凝胶电泳 观察HHar作用后AL原代细胞的凋亡[3]。
, 百拇医药
六、二苯胺法定量测定 实验组和对照组细胞DNA片段化率[4]。
七、台盼蓝染色 记数实验组和对照组细胞的坏死率[2]。
八、统计处理 采用SSPS软件包对数据进行统计学分析。
结 果
一、光镜下HHar作用后AL原代细胞的形态学变化
以HHar 0.1 mg/L作用6 h后，AML-M2a、ALL-L2原代细胞细胞形态改变为例(见插页第Ⅰ页图3A、3B)。部分细胞发生凋亡，细胞体积变小，核染色质浓集成块状或断裂，核膜完整或发生裂解，细胞膜保持完整或包绕核碎片及少量胞质形成凋亡小体。未发生凋亡的细胞体积较大，形态规则，胞核呈圆形或稍有凹陷，染色质细，可见1～2个核仁，胞质量少，嗜碱性。同时可见少数细胞体积增大，染色质肿胀疏松，发生坏死。
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二、扫描电镜下HHar作用后AL原代细胞的形态改变
以AML-M3b原代细胞为例，如图1a所示，体外培养6 h的对照组细胞呈球形，表面分布有粗短、形态各异的微绒毛。而经HHar 0.1 mg/L作用6 h后的细胞，如图1b、所示，出现表面平滑化，微绒毛消失，继而细胞表面形成大小不等的泡状隆起，细胞以出泡的方式开始形成凋亡小体。
图1 扫描电镜下实验组及对照组AML-M3b原代细胞的形态特征
1a：体外培养6 h的对照组(×8000)
1b：HHar0.1 mg/L作用6 h(×10000)
三、透射电镜下HHar后AL原代细胞的超微结构
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以AML-M2a原代细胞及对照组为例，如图2a所示，体外培养6 h的对照组细胞核质比值大，核染色质丰富，分布均匀，细胞质内有较多细胞器，线粒体形态规则，结构完整。经HHar 0.1 mg/L作用6 h后的细胞，如图2b、2c所示，体积缩小，核染色质边集呈新月状，核膜完整或发生裂解，细胞质浓缩，细胞膜保持完整。胞质内线粒体体积缩小，呈现固缩，空泡化等改变。
图2 透射电镜下实验组及对照组AML-M2a原代细胞的超微结构
2a、2b体外培养6 h的对照组(×8000)；2b、2c HHar 0.1 mg/L作用6 h(×25000 8000)
四、HHar作用后AL原代细胞凋亡的电泳结果
, 百拇医药
以HHar 1.0 mg/L、0.5 mg/L、0.1 mg/L作用6 h后AML-M2b原代细胞DNA凝胶电泳结果为例。均可见明显DNA梯状图谱(DNA ladder)，即180～200 bp及其整数倍数的DNA片段成梯状排列。对照组未见明显的DNA梯状图谱。
五、HHar对AL原代细胞诱导凋亡及杀伤的量效关系
各实验组DNA片段化率随HHar浓度的增高，作用时间的延长而增高，24 h达到峰值，后缓慢下降，对照组DNA片段化率随培养时间的延长而缓慢增高。高、中、低剂量组DNA片段化率具有时间——效应线性趋势(χ2值为37.18、32.54、24.84，P<0.01)，6～72 h各实验组DNA片段化率具有剂量——效应线性趋势(χ2值为6.80、18.97、21.51、18.47、6.25，P<0.01)。各实验组坏死率随HHar浓度的增高，作用时间的延长而增高。对照组坏死率随培养时间的延长而缓慢增高。高、中、低剂量组坏死率具有时间——效应性趋势(χ2值为22.09～13.57、8.85，P<0.01)，24～72 h各实验组坏死率具有剂量——效应线性趋势(χ2值为4.01、11.46、14.67，P<0.01)。DNA片段化率与坏死率正相关(r=0.495，P<0.01)(表1)。
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表1 急性白血病原代细胞HHar作用后的DNA片段化率和坏死率(
±s)
时 间(h)
实 验 组(血药浓度)
对照组
1.0 mg/L
0.5 mg/L
0.1 mg/L
DNA
片
段
化
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率
(%)
6
25.90±3.91**△
18.93±8.22
14.46±8.74
7.43±1.80
12
48.65±5.99**
42.89±8.10**
40.34±9.58**
, 百拇医药
16.41±6.37
24
58.15±7.38**△△
50.30±7.47**
45.50±4.554**
21.10±7.79
48
51.54±8.67**
48.92±8.56**
46.79±9.74**
, 百拇医药
23.52±7.92
72
49.30±14.56**
46.59±14.84**
44.11±15.48**
27.15±7.50
坏
死
率
(%)
6
3.20±1.483**△
, 百拇医药
1.60±0.89
1.00±0.01
0.60±0.55
12
12.16±5.52**△
7.56±3.094**
5.29±2.43
3.14±1.68
24
20.29±4.82**△△
15.29±5.62**
, http://www.100md.com
9.43±4.89
6.29±2.93
48
29.43±6.70**△△
23.57±6.73**
18.86±5.58**
10.14±2.03
72
43.29±3.30**△△☆☆
36.29±4.19**△△
, 百拇医药
26.57±4.928**
13.43±4.04
与对照组进行显著性分析P<0.05，**P<0.01；与低剂量组进行显著性分析△P<0.05，△△P<0.01；与中剂量组进行显著性分析☆P<0.05，☆☆P<0.01
讨 论
近年来，人们逐渐认识到细胞增殖与凋亡的平衡影响着肿瘤的发生、发展。诱导肿瘤细胞凋亡的治疗方法成为当前研究的热点[5]。在白血病治疗过程中，HHar不仅是一种重要的常规化疗药物，而且被用于MDS；一般状况较差，不适强烈化疗的AL患者及MDR(微量残留白血病)进行小剂量化疗。如1988年国内曾报道：小剂量HHar(0.25～0.5 mg/d)治疗成人AML的CR率为27.08%[6]。由于HHar诱导细胞凋亡的量效关系不明确，仅推测其为“大剂量杀伤，小剂量诱导细胞凋亡”。
, 百拇医药
本研究以AL原代细胞为研究对象，模拟人体内用药后的最大血药浓度，采用多种目前国内、国外公认的检测细胞凋亡的经典方法证实了HHar确可诱导AL原代细胞凋亡，其形态、生化特征均符合经典的凋亡改变。对二苯胺定量测定的细胞DNA片段化率及台盼蓝染色计数的坏死率进行分析，显示量效关系为：HHar作用AL原代细胞后高剂量组诱导细胞凋亡的能力大于低剂量组，杀伤能力也大于低剂量组：药物作用细胞后发生凋亡的时间早于坏死的时间，在同一时间点，发生凋亡的细胞数多于发生坏死的细胞数。因此，在组建个体化化疗方案时，不应仅把筛选抑制细胞增殖敏感性较高的药物作为标准，而应考虑到其诱导细胞凋亡的敏感性。药物诱导细胞凋亡的量效关系要具体药物具体分析，并不是所有药物均遵循“大剂量杀伤，小剂量诱导细胞凋亡”。药物的用量要依据其量效关系。
临床急性白血病化疗中，对HHar的敏感性因个体而异。在实验中亦可观察到：同一时间点，药物诱导细胞凋亡的数目因样本的不同而差异较大，但量效关系是一致的。诱导细胞凋亡敏感性的指标及临床疗效间的关系，将在以后的分组研究及临床观察中得以证实。
, 百拇医药
HHar主要作用于细胞周期中G1、S及G2期，属于细胞周期特异性药物。人类白血病细胞以G0/G1期细胞占大多数，S、G2-M期内细胞比例很低[7]。在实验培养过程中未加入任何外源性细胞因子，故保持了原有的周期分布特点。因此，HHar作用的靶细胞数目不同以及不同细胞周期内的细胞对损伤的修复能力不同，可能是影响其量效关系的原因之一。仍有待于从药物诱导细胞凋亡的内在机制及分子调控等多方面进行深层次探讨。
(本研究的实验室工作得到山东省医科院基础所免疫室张玲教授、王芸副主任技师的协助和指导，特此致谢。)
作者简介：李颢，女，硕士，住院医师。
参考文献
[1]张鲁榕，孔宪涛，谢映华，等.白血病化疗药物体外敏感的临床应用〔J〕.中华血液学杂志，1990，11(3)：141
, 百拇医药
[2]姜 泊，张亚历，周殿元，等.分子生物学常用实验方法〔M〕.人民军医出版社，1996：170
[3]郑德先.细胞凋亡研究进展与分析技术〔M〕.中国医学科学院.中国协和医科大学，1996：9
[4]Bhalla K,Ibrado AM, Tourkine E, et al. High dose mitoxantrone induce programmed cell death or apoptosis in human myeloid leukemia cells〔J〕. Blood,1993,82(10):3133
[5]Deboroh E, Banker, Groudine M. Measurement of spontaneous and therapeutic agent-induced apoptosis with Bcl-2 protein expression in acute myeloid leukemia〔J〕. Blood, 1997,89(1):243.
[6]小剂量高三尖杉酯碱治疗协作组.小剂量高三尖杉酯碱治疗急性非淋巴细胞白血病48例初步观察〔J〕.中华血液学杂志，1988，9(8)：499.
[7]季 红，汪月增，周 琦，等.人白血病细胞周期分布的流式细胞术分析〔J〕.中华血液学杂志，1990，11(1)：4.
(收稿日期：1999-09-26；修回日期：2000-03-23), http://www.100md.com
单位：李颢(山东医科大学研究生 济南 250012)；徐健 闵捷 张福东 彭翠兰 徐功立(山东省立医院)
关键词：高三尖杉酯碱；急性白血病；凋亡
肿瘤000506 摘要：目的 观察高三尖杉酯碱(HHar)诱导急性白血病(AL)原代细胞凋亡的形态、生化特征，并分析量效关系，以指导临床治疗。方法 经HHar作用后的AL原代细胞由光镜、电镜观察形态特征，DNA凝胶电泳、二苯胺法测定生化特征，SSPS软件分析量效关系。结果 HHar作用后AL原代细胞形态、生化特征均符合典型的细胞凋亡改变；其DNA片段化率随HHar作用时间的延长，浓度的增高而增加，具有时间——效应及剂量——效应线性趋势。DNA片段化率与坏死率正相关。结论 HHar确可诱导AL原代细胞凋亡。其诱导细胞凋亡的能力因剂量、作用时间的不同而不同。
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中图分类号：R73-361 文献标识码：A
文章编号：1000-7431(2000)05-0331-04
OBSERVATION OF THE APOPTOSIS OF PRIMARY ACUTE LEUKEMIA CELLS INDUCECD BY HOMOHARRINGTONINUM
LI Hao,XU Jian, MIN Jie, et al.
(Shandong Medical University，Jinan 250012,China)
Abstract：Objective To observe the characteristics of apoptosis of primary actue leukemia cells induced by homoharringtoninum(HHar).Methods The morphological changes were observed by microscope, SEM and TEM, the biochemical characteristics were observed by DNA agarose gel electrophoresis, internucleosomal DNA fragmentation ratios. The time-dose-effect relationship was analyzed by SSPS software. Results The morphological and biochemical characteristics of apoptosis of primary acute leukemia cells induced by HHar were in common with the typical changes. The DNA fragmentation ratios of the primary leukemia cells increased gradully with increasing time and increasing HHar dose showing a time-effect and dose-effect linear trend, and was positively correlated to the necrosis rates of the cells. Conclusion HHar can induce primary acute leukemia cells apoptosis. Its effect is various according to different concentration and different time.
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Key words：Homoharringtoninum; Leukemia,acute; Apoptosis
高三尖杉酯碱(HHar)是临床常用的化疗药物之一，近年来随着诱导细胞凋亡的治疗方法的认可及应用，人们提出小剂量HHar的作用是以诱导细胞凋亡为主，为验证这一推测，作者选取成人AL原代细胞为研究对象，观察HHar作用后细胞形态、生化特征改变，并进一步分析量效关系，为临床具体用药提供可靠的理论依据。
材料与方法
一、病例 收集初诊AL病人骨髓10例，按1986年天津会议标准分型。年龄17～44岁，男性7例，女性3例。ALL-L2 4例，AML-M2a 3例，AML-M3b 2例，AML-M5a 1例。外周血白细胞计数：1.0×109/L～52.60×109/L，骨髓原+早(原+幼)占：70.4%～92.5%。
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二、药液配制 取HHar临床常用量5 mg、2.5 mg、0.5 mg，依公式[1]计算得相应的近似最大血药浓度为：1.0 mg/L、0.5 mg/L、0.1 mg/L。配制成相应浓度药液，-20 ℃避光保存。
三、培养体系制备 抽取患者骨髓5 ml，加肝素0.3 ml抗凝(125 U/ml)，制成单个核细胞悬液后常规分离，用含10% 小牛血清RPMI 1640制成5×105/ml细胞悬液。分离后细胞成活率为100%，原+早(原+幼)占95%以上。分别加入不同浓度药物，使终浓度达到最大血药浓度。以同一病人原代细胞不加药组为对照组。置37℃、5 % CO2饱和湿度培养箱内培养。
四、Giemsa染色、扫描电镜、透射电镜观察 HHar作用后AL原代细胞的形态及超微结构改变[2]。
五、DNA凝胶电泳 观察HHar作用后AL原代细胞的凋亡[3]。
, 百拇医药
六、二苯胺法定量测定 实验组和对照组细胞DNA片段化率[4]。
七、台盼蓝染色 记数实验组和对照组细胞的坏死率[2]。
八、统计处理 采用SSPS软件包对数据进行统计学分析。
结 果
一、光镜下HHar作用后AL原代细胞的形态学变化
以HHar 0.1 mg/L作用6 h后，AML-M2a、ALL-L2原代细胞细胞形态改变为例(见插页第Ⅰ页图3A、3B)。部分细胞发生凋亡，细胞体积变小，核染色质浓集成块状或断裂，核膜完整或发生裂解，细胞膜保持完整或包绕核碎片及少量胞质形成凋亡小体。未发生凋亡的细胞体积较大，形态规则，胞核呈圆形或稍有凹陷，染色质细，可见1～2个核仁，胞质量少，嗜碱性。同时可见少数细胞体积增大，染色质肿胀疏松，发生坏死。
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二、扫描电镜下HHar作用后AL原代细胞的形态改变
以AML-M3b原代细胞为例，如图1a所示，体外培养6 h的对照组细胞呈球形，表面分布有粗短、形态各异的微绒毛。而经HHar 0.1 mg/L作用6 h后的细胞，如图1b、所示，出现表面平滑化，微绒毛消失，继而细胞表面形成大小不等的泡状隆起，细胞以出泡的方式开始形成凋亡小体。
图1 扫描电镜下实验组及对照组AML-M3b原代细胞的形态特征
1a：体外培养6 h的对照组(×8000)
1b：HHar0.1 mg/L作用6 h(×10000)
三、透射电镜下HHar后AL原代细胞的超微结构
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以AML-M2a原代细胞及对照组为例，如图2a所示，体外培养6 h的对照组细胞核质比值大，核染色质丰富，分布均匀，细胞质内有较多细胞器，线粒体形态规则，结构完整。经HHar 0.1 mg/L作用6 h后的细胞，如图2b、2c所示，体积缩小，核染色质边集呈新月状，核膜完整或发生裂解，细胞质浓缩，细胞膜保持完整。胞质内线粒体体积缩小，呈现固缩，空泡化等改变。
图2 透射电镜下实验组及对照组AML-M2a原代细胞的超微结构
2a、2b体外培养6 h的对照组(×8000)；2b、2c HHar 0.1 mg/L作用6 h(×25000 8000)
四、HHar作用后AL原代细胞凋亡的电泳结果
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以HHar 1.0 mg/L、0.5 mg/L、0.1 mg/L作用6 h后AML-M2b原代细胞DNA凝胶电泳结果为例。均可见明显DNA梯状图谱(DNA ladder)，即180～200 bp及其整数倍数的DNA片段成梯状排列。对照组未见明显的DNA梯状图谱。
五、HHar对AL原代细胞诱导凋亡及杀伤的量效关系
各实验组DNA片段化率随HHar浓度的增高，作用时间的延长而增高，24 h达到峰值，后缓慢下降，对照组DNA片段化率随培养时间的延长而缓慢增高。高、中、低剂量组DNA片段化率具有时间——效应线性趋势(χ2值为37.18、32.54、24.84，P<0.01)，6～72 h各实验组DNA片段化率具有剂量——效应线性趋势(χ2值为6.80、18.97、21.51、18.47、6.25，P<0.01)。各实验组坏死率随HHar浓度的增高，作用时间的延长而增高。对照组坏死率随培养时间的延长而缓慢增高。高、中、低剂量组坏死率具有时间——效应性趋势(χ2值为22.09～13.57、8.85，P<0.01)，24～72 h各实验组坏死率具有剂量——效应线性趋势(χ2值为4.01、11.46、14.67，P<0.01)。DNA片段化率与坏死率正相关(r=0.495，P<0.01)(表1)。
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表1 急性白血病原代细胞HHar作用后的DNA片段化率和坏死率(
±s)时 间(h)
实 验 组(血药浓度)
对照组
1.0 mg/L
0.5 mg/L
0.1 mg/L
DNA
片
段
化
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率
(%)
6
25.90±3.91**△
18.93±8.22
14.46±8.74
7.43±1.80
12
48.65±5.99**
42.89±8.10**
40.34±9.58**
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24
58.15±7.38**△△
50.30±7.47**
45.50±4.554**
21.10±7.79
48
51.54±8.67**
48.92±8.56**
46.79±9.74**
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23.52±7.92
72
49.30±14.56**
46.59±14.84**
44.11±15.48**
27.15±7.50
坏
死
率
(%)
6
3.20±1.483**△
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1.00±0.01
0.60±0.55
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12.16±5.52**△
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3.14±1.68
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20.29±4.82**△△
15.29±5.62**
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6.29±2.93
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29.43±6.70**△△
23.57±6.73**
18.86±5.58**
10.14±2.03
72
43.29±3.30**△△☆☆
36.29±4.19**△△
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13.43±4.04
与对照组进行显著性分析P<0.05，**P<0.01；与低剂量组进行显著性分析△P<0.05，△△P<0.01；与中剂量组进行显著性分析☆P<0.05，☆☆P<0.01
讨 论
近年来，人们逐渐认识到细胞增殖与凋亡的平衡影响着肿瘤的发生、发展。诱导肿瘤细胞凋亡的治疗方法成为当前研究的热点[5]。在白血病治疗过程中，HHar不仅是一种重要的常规化疗药物，而且被用于MDS；一般状况较差，不适强烈化疗的AL患者及MDR(微量残留白血病)进行小剂量化疗。如1988年国内曾报道：小剂量HHar(0.25～0.5 mg/d)治疗成人AML的CR率为27.08%[6]。由于HHar诱导细胞凋亡的量效关系不明确，仅推测其为“大剂量杀伤，小剂量诱导细胞凋亡”。
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本研究以AL原代细胞为研究对象，模拟人体内用药后的最大血药浓度，采用多种目前国内、国外公认的检测细胞凋亡的经典方法证实了HHar确可诱导AL原代细胞凋亡，其形态、生化特征均符合经典的凋亡改变。对二苯胺定量测定的细胞DNA片段化率及台盼蓝染色计数的坏死率进行分析，显示量效关系为：HHar作用AL原代细胞后高剂量组诱导细胞凋亡的能力大于低剂量组，杀伤能力也大于低剂量组：药物作用细胞后发生凋亡的时间早于坏死的时间，在同一时间点，发生凋亡的细胞数多于发生坏死的细胞数。因此，在组建个体化化疗方案时，不应仅把筛选抑制细胞增殖敏感性较高的药物作为标准，而应考虑到其诱导细胞凋亡的敏感性。药物诱导细胞凋亡的量效关系要具体药物具体分析，并不是所有药物均遵循“大剂量杀伤，小剂量诱导细胞凋亡”。药物的用量要依据其量效关系。
临床急性白血病化疗中，对HHar的敏感性因个体而异。在实验中亦可观察到：同一时间点，药物诱导细胞凋亡的数目因样本的不同而差异较大，但量效关系是一致的。诱导细胞凋亡敏感性的指标及临床疗效间的关系，将在以后的分组研究及临床观察中得以证实。
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HHar主要作用于细胞周期中G1、S及G2期，属于细胞周期特异性药物。人类白血病细胞以G0/G1期细胞占大多数，S、G2-M期内细胞比例很低[7]。在实验培养过程中未加入任何外源性细胞因子，故保持了原有的周期分布特点。因此，HHar作用的靶细胞数目不同以及不同细胞周期内的细胞对损伤的修复能力不同，可能是影响其量效关系的原因之一。仍有待于从药物诱导细胞凋亡的内在机制及分子调控等多方面进行深层次探讨。
(本研究的实验室工作得到山东省医科院基础所免疫室张玲教授、王芸副主任技师的协助和指导，特此致谢。)
作者简介：李颢，女，硕士，住院医师。
参考文献
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(收稿日期：1999-09-26；修回日期：2000-03-23), http://www.100md.com