人细胞毒T淋巴细胞杀伤胃癌细胞及诱发凋亡的实验研究
作者：宋伟庆 韩彩丽 张玉印 贾汝梅 蒋贻康
单位：韩彩丽(河北医科大学病理教研室)；宋伟庆 张玉印 贾汝梅 蒋贻康(河北医科大学第二医院胃肠外科 石家庄 050000)
关键词：胃肿瘤；癌，腺泡细胞；T淋巴细胞，细胞毒性；凋亡
肿瘤000505 摘要：目的 测定特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)对胃癌细胞的体外杀伤活性及观察形态学改变。方法 用分离胃腺癌患者的癌细胞经丝裂霉素C处理后，作为抗原与抗CD3单克隆抗体、重组白细胞介素-2刺激患者自体外周血单个核细胞，体外诱导CTL， 用MTT比色法测定CTL对自体癌细胞、人胃癌细胞株(BGC-823和MGC-803)的体外杀伤活性。将CTL与BGC-823共同温育，通过透射和扫描电镜观察杀伤靶细胞的形态改变。结果 CTL对自体胃癌细胞有特异性杀伤作用，可使靶细胞凋亡或溶解坏死。结论 体外混合细胞培养诱导出的CTL，对靶细胞有明显的杀伤作用。
, 百拇医药
中图分类号：R392.12 文献标识码：A
文章编号：1000-7431(2000)05-0328-03
EXPERIMENTAL STUDY ON THE KILLING AND THE APOPTOSIS INDUCING EFFECT OF HUMAN CTL TO GASTRIC TUMOR CELLS
SONG Wei-qing, HAN Cai-li, ZHANG Yu-yin, et al.
(Surgical Department, The Second Hospital, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000,China)
Abstract：Objective The killing activity of specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) against gastic carcinoma cells and the morphological changes was studied.Methods Isolated patient's gastric carcinoma cells were treated with mi-tomycin-C, and were used as stimulator. The lymphocytes from autologous peripheral blood of the patients were cultured with mitomycin-C, stimulator, in culture medium containing anti-CD3 monoclonal antibody and rIL-2. The killing activity of CTL against autologous gastric carcinoma cells and gastric carcinoma cell lines (BGC-823 and MGC-803) was tested by using MTT method. Morphological changes after CTL co-cultured with BGC-823 were observed under electronic microscope (TEM and SEM).Results CTL was highly specific against autologous cancer cells by inducing apoptosis or lytic necrosis.Conclusion CTL induced by mitomycin-C treated gastric carcinoma cell ,anti-CD3 McAb and rIL-2 have obtained obvious killing activity in vitro.
, http://www.100md.com
Key words：Gastric neoplasms; Carcinoma,adenocyte; T lymphocyte，cytotxic； Apoptosis
用胃癌患者自体癌组织中分离出的癌细胞，经丝裂霉素C处理后，与抗CD3单克隆抗体和重组白细胞介素-2(IL-2)体外刺激自体外周血单个核细胞，诱导细胞毒T淋巴细胞(CTL)，观察后者杀瘤活性，并通过透射和扫描电镜观察CTL杀伤胃癌细胞的动态形态学变化。现将实验结果报告如下。
材料与方法
一、CTL体外诱导 选取本院外科手术切除的胃癌标本共18例，均病理证实为胃腺癌。从新鲜胃腺癌组织中分离出癌细胞，经丝裂霉素C处理后，与自体外周血中分离出的单个核细胞按比例混合，具体方法见文献[1]。加入抗CD3单克隆抗体125 ng/ml，5% CO2 37 ℃培养，24 h后加入IL-2100 u/ml，培养12天，每3天传代1次。
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二、CTL体外杀伤活性测定 用MTT比色法测定CTL对自体瘤细胞、胃腺癌细胞株BGC-823(军事医学科学院)、胃粘液腺癌细胞株MGC-803(中国医学科学院实验动物所)的体外杀伤活性。调CTL与靶细胞浓度为2×106/ml与1×105/ml，效应细胞：靶细胞(E∶T)=20∶1。取细胞各100 μl加入到54孔酶联板，5 % CO2， 37℃培养24 h后，加5 mg/ml MTT 10 μl，继续培养4 h，1000 r/min离心5 min，弃上清加150 μl 二甲基亚砜震荡，待蓝紫色沉淀溶解后，用DG-3022酶联仪(南京华东电子管厂生产)，波长570 nm测定，读取A值，同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照，每组均设三个复孔，取其均值，按下式计算：
三、电镜样品制备
(一)靶细胞 人胃腺癌细胞株BGC-823，具有抗NK活性及贴壁特点，传代生长的细胞，经EDTA-Na消化，细胞计数。将体外诱导的CTL与靶细胞按20∶1放入各培养瓶中，5 % CO2， 37℃共同温育，分别于30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h不同时间收集细胞。
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(二)透射电镜样品制备 将共同温育不同时间收集的细胞离心500 r/min，5 min，用2.5% 戊二醛4 ℃固定，1 % 锇酸后固定，常规脱水，EPON812包埋，LKB-NOVA切片机超薄切片，枸橼酸铅和醋酸双氧铀染色。JEM-1200EX透射电镜观察。
(三)扫描电镜样品制备 将各个时间收集的细胞悬液，滴在载玻片上，待细胞沉淀，吸去液体，4%戊二醛4℃固定，1%锇酸后固定，2% 单宁酸染色，乙醇逐级脱水，临界点干燥，离子溅射镀金，S-520扫描电镜观察。
结 果
一、体外杀瘤活性测定 用体外诱导产生的CTL杀伤自体瘤细胞、BGC-823、MGC-803细胞株，结果见附表。CTL对自体瘤细胞的杀伤活性明显高于胃癌细胞株(P<0.01)，对同一组织分型细胞株BGC-823的杀伤活性高于非同一组织分型细胞株MGC-803(P<0.05)。
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附表 CTL杀瘤活性测定(%)E∶T=20∶1 靶 细 胞
CTL杀伤活性(
±s)
自体靶细胞
80.89%±1.67%
BGC-823
50.26%±0.65%#
MGC-803
38.83%±2.57%
BGC-823，MGC-803与自体靶细胞组比较P<0.01，BGC与MGC比较＃P<0.05 二、电镜观察 发现在共同温育30 min时，癌细胞彼此分离呈圆形，细胞内结构无明显变化，CTL的形态与外周血淋巴细胞结构相似。在温育1～2 h后，可见数个CTL靠近癌细胞，并将其包围，CTL的胞体与癌细胞胞体密切相贴或CTL伸出伪足与癌细胞紧贴。此时癌细胞发生变化，透射电镜可见胞浆浓缩，电子密度增大，细胞内出现许多电子密度较大的圆形团块，细胞明显变形但胞膜完整。另一部分癌细胞内出现大空泡，细胞器结构不清。共同温育4～8 h，癌细胞核发生明显改变，核膜皱缩呈波浪状，异染色质明显增多，积聚成团、周边化、核固缩，表现为球形或半月形，染色质碎裂，细胞发生裂解形成有完整胞膜的突起，并脱落成为凋亡小体(见图1)。而另一部分癌细胞则表现为细胞肿胀，细胞器破碎，细胞溶解坏死。随着温育时间的延长，CTL本身也发生变化，表现为细胞器增多以线粒体为主。扫描电镜下可见癌细胞表面有许多圆形或椭圆形小孔(见图2)，有些呈镂空状。
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图1 凋亡小体脱落(↑) ×2500
图2 靶细胞表面出现小孔(↑) ×70000
讨 论
目前肿瘤生物治疗已成为治疗恶性肿瘤一种新的模式。近年来我国应用淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)过继性免疫治疗恶性肿瘤较为普遍，且有一定的疗效，但其特异性较差，并需要输入大量的IL-2维持其活性，因此患者不能耐受。肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)对杀伤靶细胞的特异性较好，但只有某些类型肿瘤的TIL杀伤活性较高，而且从肿瘤组织中分离出的淋巴细胞数量有限，体外扩增时间较长，故在临床应用中受到限制。CTL以其特异性强，杀瘤活性高，而日益受到人们的重视。近几年已证明，CTL是机体最重要的免疫监视细胞，是抑瘤机制中的重要环节，是肿瘤过继免疫治疗中主要的效应细胞，是较为理想的细胞群体[2]。
, 百拇医药
本实验通过从自体新鲜胃癌组织中分离出的癌细胞与自体外周血的淋巴细胞按一定比例进行体外混合培养，诱导出CTL。结果表明：CTL对靶细胞有较高的杀伤活性和较强的特异性。杀伤自体瘤细胞的活性(80.89%±1.67%)明显高于对胃癌细胞株的杀伤活性(50.26 %±0.65 %；38.83 %± 2.57 %)，在统计学上有非常明显的差异(P<0.01)。对同一组织分型的胃腺癌细胞株BGC-823的杀伤活性也明显高于胃粘液腺癌细胞株MGC-802(P<0.05)。
通过透射和扫描电镜观察，结果表明体外诱导CTL具有杀伤癌细胞的功能，其过程可分为CTL识 别、围攻和癌细胞死亡三个阶段。癌细胞死亡有凋亡和坏死两种形式。引起凋亡和坏死的机制可能有两条途径；即CTL表面的Fas配体与靶细胞膜上的Fas分子相互作用，交叉连接细胞内的“死亡位点”(Death Domain)[3，4]，或通过效应细胞产生的穿孔素在靶细胞膜上形成的孔注入自身酶成份——颗粒酶B(Granzyme B)，并在Ca++参与下启动靶细胞的凋亡信号，使靶细胞的DNA裂解而发生凋亡[5]。另一途径是通过CD3分子传导信号，从而活化磷脂酶C，使胞浆内Ca++浓度升高，激活蛋白酶C，通过穿孔素形成的小孔将溶细胞介质注入靶细胞，使靶细胞溶解坏死[6]。此外在CTL与靶细胞温育后期，CTL本身亦发生变化，出现细胞器增多，以线粒体为主。这可能与CTL主动进攻靶细胞大量耗能有关。
, 百拇医药
本文采用混合细胞培养的方法诱导出CTL，在体外测定对自体癌细胞有特异性杀伤作用。并通过形态学观察证实，体外诱导的CTL可使靶细胞凋亡或溶解坏死。但对CTL在体内的杀伤效应，有待进一步的研究。
作者简介：宋伟庆，男，学士，副主任医师。
参考文献
[1]韩彩丽，宋伟庆，阎蕴力，等.自体胃癌细胞诱导细胞毒T淋巴细胞的实验观察〔J〕.河北医药，1997 19(2)：83
[2]李 昆，程一棹.肿瘤免疫治疗中细胞毒T淋巴细胞的应用〔J〕.国外医学 免疫学分册，1992，3：125
[3]Richter C. Pro-oxidants and mitochondrial Ca++：their relationship to apoptosis and oncogenesis〔J〕. FEBS Lett,1993,325(1，2)：104
, 百拇医药
[4]Berggern LJ, Larsson O, Rorsman P, et al. Increased activity of 1-type Ca++ channels exposed to serum from patients with type Ⅰ diabetes〔J〕. Science, 1993,261(5117):86
[5]Shiver JW, Lishan S, Henkart PA. Cytotoxicity with target DNA breakdown by rat basophilic leukemia cells expressing both cytolysin and granzyme A〔J〕. Cell, 1992,71:315
[6]Felzen B, Berk G, Rasen D, et al. Effects of parifiec perforin and granzyme A from cytotoxic T lymphocytes on guinea pig ventricular myocytes〔J〕. Cardiovasc Res,1994,28:643
(收稿日期：1998-04-08；修回日期：1998-11-15), 百拇医药
单位：韩彩丽(河北医科大学病理教研室)；宋伟庆 张玉印 贾汝梅 蒋贻康(河北医科大学第二医院胃肠外科 石家庄 050000)
关键词：胃肿瘤；癌，腺泡细胞；T淋巴细胞，细胞毒性；凋亡
肿瘤000505 摘要：目的 测定特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)对胃癌细胞的体外杀伤活性及观察形态学改变。方法 用分离胃腺癌患者的癌细胞经丝裂霉素C处理后，作为抗原与抗CD3单克隆抗体、重组白细胞介素-2刺激患者自体外周血单个核细胞，体外诱导CTL， 用MTT比色法测定CTL对自体癌细胞、人胃癌细胞株(BGC-823和MGC-803)的体外杀伤活性。将CTL与BGC-823共同温育，通过透射和扫描电镜观察杀伤靶细胞的形态改变。结果 CTL对自体胃癌细胞有特异性杀伤作用，可使靶细胞凋亡或溶解坏死。结论 体外混合细胞培养诱导出的CTL，对靶细胞有明显的杀伤作用。
, 百拇医药
中图分类号：R392.12 文献标识码：A
文章编号：1000-7431(2000)05-0328-03
EXPERIMENTAL STUDY ON THE KILLING AND THE APOPTOSIS INDUCING EFFECT OF HUMAN CTL TO GASTRIC TUMOR CELLS
SONG Wei-qing, HAN Cai-li, ZHANG Yu-yin, et al.
(Surgical Department, The Second Hospital, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000,China)
Abstract：Objective The killing activity of specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) against gastic carcinoma cells and the morphological changes was studied.Methods Isolated patient's gastric carcinoma cells were treated with mi-tomycin-C, and were used as stimulator. The lymphocytes from autologous peripheral blood of the patients were cultured with mitomycin-C, stimulator, in culture medium containing anti-CD3 monoclonal antibody and rIL-2. The killing activity of CTL against autologous gastric carcinoma cells and gastric carcinoma cell lines (BGC-823 and MGC-803) was tested by using MTT method. Morphological changes after CTL co-cultured with BGC-823 were observed under electronic microscope (TEM and SEM).Results CTL was highly specific against autologous cancer cells by inducing apoptosis or lytic necrosis.Conclusion CTL induced by mitomycin-C treated gastric carcinoma cell ,anti-CD3 McAb and rIL-2 have obtained obvious killing activity in vitro.
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Key words：Gastric neoplasms; Carcinoma,adenocyte; T lymphocyte，cytotxic； Apoptosis
用胃癌患者自体癌组织中分离出的癌细胞，经丝裂霉素C处理后，与抗CD3单克隆抗体和重组白细胞介素-2(IL-2)体外刺激自体外周血单个核细胞，诱导细胞毒T淋巴细胞(CTL)，观察后者杀瘤活性，并通过透射和扫描电镜观察CTL杀伤胃癌细胞的动态形态学变化。现将实验结果报告如下。
材料与方法
一、CTL体外诱导 选取本院外科手术切除的胃癌标本共18例，均病理证实为胃腺癌。从新鲜胃腺癌组织中分离出癌细胞，经丝裂霉素C处理后，与自体外周血中分离出的单个核细胞按比例混合，具体方法见文献[1]。加入抗CD3单克隆抗体125 ng/ml，5% CO2 37 ℃培养，24 h后加入IL-2100 u/ml，培养12天，每3天传代1次。
, http://www.100md.com
二、CTL体外杀伤活性测定 用MTT比色法测定CTL对自体瘤细胞、胃腺癌细胞株BGC-823(军事医学科学院)、胃粘液腺癌细胞株MGC-803(中国医学科学院实验动物所)的体外杀伤活性。调CTL与靶细胞浓度为2×106/ml与1×105/ml，效应细胞：靶细胞(E∶T)=20∶1。取细胞各100 μl加入到54孔酶联板，5 % CO2， 37℃培养24 h后，加5 mg/ml MTT 10 μl，继续培养4 h，1000 r/min离心5 min，弃上清加150 μl 二甲基亚砜震荡，待蓝紫色沉淀溶解后，用DG-3022酶联仪(南京华东电子管厂生产)，波长570 nm测定，读取A值，同时设空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照，每组均设三个复孔，取其均值，按下式计算：
三、电镜样品制备
(一)靶细胞 人胃腺癌细胞株BGC-823，具有抗NK活性及贴壁特点，传代生长的细胞，经EDTA-Na消化，细胞计数。将体外诱导的CTL与靶细胞按20∶1放入各培养瓶中，5 % CO2， 37℃共同温育，分别于30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h不同时间收集细胞。
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(二)透射电镜样品制备 将共同温育不同时间收集的细胞离心500 r/min，5 min，用2.5% 戊二醛4 ℃固定，1 % 锇酸后固定，常规脱水，EPON812包埋，LKB-NOVA切片机超薄切片，枸橼酸铅和醋酸双氧铀染色。JEM-1200EX透射电镜观察。
(三)扫描电镜样品制备 将各个时间收集的细胞悬液，滴在载玻片上，待细胞沉淀，吸去液体，4%戊二醛4℃固定，1%锇酸后固定，2% 单宁酸染色，乙醇逐级脱水，临界点干燥，离子溅射镀金，S-520扫描电镜观察。
结 果
一、体外杀瘤活性测定 用体外诱导产生的CTL杀伤自体瘤细胞、BGC-823、MGC-803细胞株，结果见附表。CTL对自体瘤细胞的杀伤活性明显高于胃癌细胞株(P<0.01)，对同一组织分型细胞株BGC-823的杀伤活性高于非同一组织分型细胞株MGC-803(P<0.05)。
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附表 CTL杀瘤活性测定(%)E∶T=20∶1 靶 细 胞
CTL杀伤活性(
±s)自体靶细胞
80.89%±1.67%
BGC-823
50.26%±0.65%#
MGC-803
38.83%±2.57%
BGC-823，MGC-803与自体靶细胞组比较P<0.01，BGC与MGC比较＃P<0.05 二、电镜观察 发现在共同温育30 min时，癌细胞彼此分离呈圆形，细胞内结构无明显变化，CTL的形态与外周血淋巴细胞结构相似。在温育1～2 h后，可见数个CTL靠近癌细胞，并将其包围，CTL的胞体与癌细胞胞体密切相贴或CTL伸出伪足与癌细胞紧贴。此时癌细胞发生变化，透射电镜可见胞浆浓缩，电子密度增大，细胞内出现许多电子密度较大的圆形团块，细胞明显变形但胞膜完整。另一部分癌细胞内出现大空泡，细胞器结构不清。共同温育4～8 h，癌细胞核发生明显改变，核膜皱缩呈波浪状，异染色质明显增多，积聚成团、周边化、核固缩，表现为球形或半月形，染色质碎裂，细胞发生裂解形成有完整胞膜的突起，并脱落成为凋亡小体(见图1)。而另一部分癌细胞则表现为细胞肿胀，细胞器破碎，细胞溶解坏死。随着温育时间的延长，CTL本身也发生变化，表现为细胞器增多以线粒体为主。扫描电镜下可见癌细胞表面有许多圆形或椭圆形小孔(见图2)，有些呈镂空状。
, http://www.100md.com
图1 凋亡小体脱落(↑) ×2500
图2 靶细胞表面出现小孔(↑) ×70000
讨 论
目前肿瘤生物治疗已成为治疗恶性肿瘤一种新的模式。近年来我国应用淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)过继性免疫治疗恶性肿瘤较为普遍，且有一定的疗效，但其特异性较差，并需要输入大量的IL-2维持其活性，因此患者不能耐受。肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)对杀伤靶细胞的特异性较好，但只有某些类型肿瘤的TIL杀伤活性较高，而且从肿瘤组织中分离出的淋巴细胞数量有限，体外扩增时间较长，故在临床应用中受到限制。CTL以其特异性强，杀瘤活性高，而日益受到人们的重视。近几年已证明，CTL是机体最重要的免疫监视细胞，是抑瘤机制中的重要环节，是肿瘤过继免疫治疗中主要的效应细胞，是较为理想的细胞群体[2]。
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本实验通过从自体新鲜胃癌组织中分离出的癌细胞与自体外周血的淋巴细胞按一定比例进行体外混合培养，诱导出CTL。结果表明：CTL对靶细胞有较高的杀伤活性和较强的特异性。杀伤自体瘤细胞的活性(80.89%±1.67%)明显高于对胃癌细胞株的杀伤活性(50.26 %±0.65 %；38.83 %± 2.57 %)，在统计学上有非常明显的差异(P<0.01)。对同一组织分型的胃腺癌细胞株BGC-823的杀伤活性也明显高于胃粘液腺癌细胞株MGC-802(P<0.05)。
通过透射和扫描电镜观察，结果表明体外诱导CTL具有杀伤癌细胞的功能，其过程可分为CTL识 别、围攻和癌细胞死亡三个阶段。癌细胞死亡有凋亡和坏死两种形式。引起凋亡和坏死的机制可能有两条途径；即CTL表面的Fas配体与靶细胞膜上的Fas分子相互作用，交叉连接细胞内的“死亡位点”(Death Domain)[3，4]，或通过效应细胞产生的穿孔素在靶细胞膜上形成的孔注入自身酶成份——颗粒酶B(Granzyme B)，并在Ca++参与下启动靶细胞的凋亡信号，使靶细胞的DNA裂解而发生凋亡[5]。另一途径是通过CD3分子传导信号，从而活化磷脂酶C，使胞浆内Ca++浓度升高，激活蛋白酶C，通过穿孔素形成的小孔将溶细胞介质注入靶细胞，使靶细胞溶解坏死[6]。此外在CTL与靶细胞温育后期，CTL本身亦发生变化，出现细胞器增多，以线粒体为主。这可能与CTL主动进攻靶细胞大量耗能有关。
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本文采用混合细胞培养的方法诱导出CTL，在体外测定对自体癌细胞有特异性杀伤作用。并通过形态学观察证实，体外诱导的CTL可使靶细胞凋亡或溶解坏死。但对CTL在体内的杀伤效应，有待进一步的研究。
作者简介：宋伟庆，男，学士，副主任医师。
参考文献
[1]韩彩丽，宋伟庆，阎蕴力，等.自体胃癌细胞诱导细胞毒T淋巴细胞的实验观察〔J〕.河北医药，1997 19(2)：83
[2]李 昆，程一棹.肿瘤免疫治疗中细胞毒T淋巴细胞的应用〔J〕.国外医学 免疫学分册，1992，3：125
[3]Richter C. Pro-oxidants and mitochondrial Ca++：their relationship to apoptosis and oncogenesis〔J〕. FEBS Lett,1993,325(1，2)：104
, 百拇医药
[4]Berggern LJ, Larsson O, Rorsman P, et al. Increased activity of 1-type Ca++ channels exposed to serum from patients with type Ⅰ diabetes〔J〕. Science, 1993,261(5117):86
[5]Shiver JW, Lishan S, Henkart PA. Cytotoxicity with target DNA breakdown by rat basophilic leukemia cells expressing both cytolysin and granzyme A〔J〕. Cell, 1992,71:315
[6]Felzen B, Berk G, Rasen D, et al. Effects of parifiec perforin and granzyme A from cytotoxic T lymphocytes on guinea pig ventricular myocytes〔J〕. Cardiovasc Res,1994,28:643
(收稿日期：1998-04-08；修回日期：1998-11-15), 百拇医药