G3BP在三组不同转移潜能的癌系中表达差异的检测
作者：刘宇欣 郑杰 方伟岗 李文静 由江峰 吴秉铨
单位：刘宇欣 郑杰 方伟岗 李文静 由江峰 吴秉铨(北京医科大学病理系 北京 100083)
关键词：肿瘤细胞，培养的；肿瘤转移；G3BP
肿瘤000504 摘要：目的 在三组具有不同转移潜能的癌细胞亚系中，在RNA水平及蛋白水平检测G3BP(Ras-GTPase-Activiting protein SH3 domain binding protein)与肿瘤转移潜能的相关性。方法 研究对象为三组具有不同转移潜能的癌细胞亚系，即PG(人肺巨细胞癌，裸鼠体内转移率100%)与PAa(人肺腺癌，无转移)；PG亚系BE1与LH7(前者裸鼠体内转移率100%，后者无转移)；1E8与2B4来自人前列腺癌PC-3M(前者裸鼠体内转移率100%，后者无转移)。检测方法包括Northern 杂交，蛋白质Western印迹免疫化学，免疫组织化学。结果 应用mRNA差异显示技术对比研究具有不同转移潜能的亚系BE1，LH7时，发现一个849 bp片段在BE1低表达，而在LH7高表达，经Northern杂交验证其表达差异后测序，GenBank Blastn检索，与G3BP同源性高达99%。在三组具有不同转移潜能的癌系中，Northern杂交，蛋白质Western印迹免疫化学显示G3BP在低转移癌系LH7，2B4，PAa中表达显著高于其所对应的高转移癌系BE1，1E8，PG。免疫组织化学提示G3BP蛋白位于胞质，低转移癌系LH7，2B4，PAa表达显著高于其所对应的高转移癌系BE1，1E8，PG(PG各细胞染色不均一)。结论 在mRNA水平和蛋白质水平，G3BP在三组高低转移癌系中的表达具有显著差异，在低转移癌系中的表达水平显著高于其所对应的高转移癌系，提示G3BP与肿瘤的转移表型可能具有相关性。
, http://www.100md.com
中图分类号：R73-37 文献标识码：A
文章编号：1000-7431(2000)05-0325-03
G3BP EXPRESSION IN HUMAN CARCINOMA CELL SUBLINES WITH OR WITHOUT METASTATIC POTENTIAL
LIU Yu-xin, ZHENG Jie, FANG Wei-gang, et al.
(Department of Pathology, Beijing Medical University，Beijing 10083,China)
Abstract：Objective The relationship between G3BP (Ras-GTPase-Activating protein SH3 domain binding protein) and cancer metastasis was studied. Methods G3BP expression in three pairs of cancer cell sublines with/without metastatic potential (BE1/LH7, 1E8/2B4 and PG/PAa) was confirmed by Northern hybridization, Western blotting and immunohistochemical analysis. Results G3BP was obtaine by mRNA differential display and it displayed a strong expression in LH7 (no metastatic potential in recipient nude mice ) and a very weak expression in BE1 (100% metastatic frequency). Northern blotting and Western blotting with a polyclonal G3BP antibody confirmed an increased G3BP expression in non-metastatic cell lines (LH7, 2B4, PAa) compared with highly metastatic cell lines (BE1, 1E8, PG). Immunohistochemical analysis demonstrated a prominent granular pattern of G3BP accumulation in cytoplasm. Conclusion The results revealed a significant association between G3BP expression and cancer metastasis, due to its different expressions in messenger RNA and protein level between the three pairs of cell sublines with different metastatic potentials.
, 百拇医药
Key words：Tumor cell,clutured Neoplasm metastasis； G3BP
我室应用mRNA差异显示技术对比研究来自人肺巨细胞癌PG的亚系BE1，LH7时(前者裸鼠体内转移率100%，后者无转移)，克隆一个849 bp片段在BE1低表达，而在LH7高表达，经GenBank Blastn检索，与G3BP(Ras-GTPase-Activiting protein SH3 domain binding protein)同源性高达99%，提示G3BP与肿瘤的转移具有一定的相关性[1]。现将研究对象扩展到另两组具有不同转移潜能的癌细胞系，包括人肺巨细胞癌PG(裸鼠体内100%转移)，人肺腺癌PAa(裸鼠体内不转移)，人前列腺癌PC-3M亚系1E8，2B4(我室分离建立，前者裸鼠体内100%转移，后者无转移)[2]；同时将检测方法由差异显示扩展到RNA水平(Northern杂交)，蛋白水平(蛋白质Western印迹免疫化学，免疫组织化学)检测G3BP与肿瘤转移潜能的相关性，为G3BP参与肿瘤转移这一假设提供依据。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、细胞培养 人肺巨细胞癌PG及其亚系BE1、LH7、人肺腺癌PAa，人前列腺癌PC-3M亚系1E8、2B4，以含10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养，贴壁生长，置37 ℃，5 % CO2培养箱中。
二、Northern杂交 异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。分光光度计测A260 nm，计算RNA含量，取15 μg 总RNA于2%甲醛变性琼脂糖/EB胶电泳约4 h(电压10 V/cm)，紫外灯下观察记录18S(约2 kb)，28 S(约5 kb)与上样孔的距离。10×SSC为缓冲液按常规方法吸印过夜。硝酸纤维膜80℃烤90 min。以G3BP PCR产物25 ng为模板，按照Prim-a-gene试剂盒(Promega公司)说明书随机引物法标记探针。将硝酸纤维素膜封入杂交袋中，按0.2 ml/cm2加预杂交液(6×SSC，50 % 甲酰胺，1 % SDS，1×Denhard试剂)，42 ℃预杂交3 h后加入已100 ℃变性5 min的探针，42 ℃杂交过夜。以2×SSC，0.1 % SDS 200 ml室温洗膜15 min 2次，0.2×SSC，0.1 % SDS 200 ml 42 ℃洗膜15 min2次。膜在2×SSC中漂洗后放射自显影1～3天，以β-actin作为内参照。
, 百拇医药
三、蛋白质Western印迹免疫化学 生长状态良好的细胞PBS洗两遍，用细胞刮子收集细胞，加入100 μl悬浮缓冲液(0.1 mol/L NaCl，0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.6，0.01 mol/L EDTA pH 8.0，100 μg/ml 苯*****)混匀，加100 μl 2×SDS 上样缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl pH 6.8，200 mmol/L DTT， 4 % SDS，0.2 %溴酚兰，20 % 甘油)混匀，冰浴30 min，100 ℃ 10 min，超声裂解至溶液的粘稠度可控，10 000转离心10 min，收集上清分装。Lowry法测定蛋白浓度[3]，配置5%浓缩胶：水3.4 ml，30%丙烯酰胺0.83 ml，1 mol/L Tris-HCl (pH 6.8) 0.63 ml，10 % SDS 0.05 ml，10 % AP 0.05 ml，TEMED 0.005 ml；10 % 分离胶：水4.0 ml，30 %丙烯酰胺3.3 ml，1.5 mol/L Tris-HCl (pH 8.8) 2.5 ml，10 % SDS 0.1 ml，10 % AP 0.1 ml，TEMED 0.004 ml。取各细胞系蛋白 100 μg， 100 ℃变性 5 min，4 ℃，电泳4～6 h(浓缩胶100 V，分离胶120 V)，电泳缓冲液为25 mmol/L Tris-HCl，250 mmol/L 甘氨酸 pH 8.3，0.1 % SDS。电泳结束后将凝胶置于电转移缓冲液中(39 mmol/L 甘氨酸，48 mmol/L Tris， 0.037 % SDS， 20 % 甲醇)浸泡30 min，用夹心法把滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、滤纸依次固定，插入电转移槽中，凝胶在阴极，硝膜在阳极方向，加入转移缓冲液，50 V、4℃ 转移12～14 h。硝膜以丽春红染色，对照蛋白分子量标志剪下相应部位的硝膜放入杂交袋中，5% 脱脂奶粉/PBS封闭1 h，然后按0.2 ml/cm2加入一抗(兔G3BP多克隆抗体，由法国Rhone-Poulenc Rorer实验室馈赠，1∶500稀释)4 ℃过夜。0.05 %吐温/PBS洗膜15 min 3次后，加入羊抗兔的IgG-HRP(1∶2000)室温1 h。用0.05 %吐温/PBS洗膜15 min3次。采用发光试剂(Santa Cruz生物技术公司)检测特异条带，X光片曝光。
, 百拇医药
四、免疫组织化学 采用ABC试剂盒(Vector公司)，G3BP多克隆抗体由法国Rhone-Poulenc Rorer实验室馈赠。细胞培养于载玻片上24 h，丙酮固定30 min，PBS洗3次共15 min，0.3 % H2O2灭活内源性过氧化氢酶30 min，PBS洗，0.3 % Triton打孔5 min，PBS洗，10 %兔血清封闭37 ℃ 30 min，PBS洗，滴加G3BP多克隆抗体(1∶500)，湿盒中温育4 ℃过夜，PBS洗，滴加生物素标记的羊抗兔二抗，室温1 h，PBS洗，滴加AB液(A与B液等量，于用前30 min混匀)，室温30 min，PBS洗，0.04% DAB加入0.03% H2O2显色10 min，充分水洗，苏木素复染，中性树脂封片，镜检。凡细胞质内出现明显的棕黄色颗粒为阳性细胞。染色强度分级：根据阳性细胞占全部细胞的比例分为，阴性(-)，无阳性细胞或阳性细胞数少于5%；阳性(+)，阳性细胞占5 %～50 %；强阳性(++)，阳性肿瘤细胞>50 %。同时以PBS替代一抗作为空白对照。
, http://www.100md.com
结 果
一、Northern杂交 如图1所示，mRNA水平，G3BP在各细胞系中均有不同水平的表达，在低转移癌系中的表达高于其相应的高转移癌系：可见PAa杂交信号强于PG；LH7杂交信号强于BE1；2B4杂交信号强于1E8。根据G3BP的杂交信号位置估计其mRNA约3.3 kb，与文献报道相符。下图显示β-actin作为内参照，在6个细胞系中杂交信号强度一致。
二、蛋白质Western印迹免疫化学 如图2所示，蛋白质水平，G3BP在各细胞系中 有不同水平的表达，G3BP在低转移癌系中的蛋白表达高于其相应的高转移癌系：PAa阳性信号强于PG；LH7阳性信号强于BE1；2B4阳性信号强于1E8。阳性信号位于68 kD处，与文献报道相符。
三、免疫组织化学 (见插页第Ⅰ页图2)所示，免疫组化阳性信号为位于胞质的棕黄色颗粒，G3BP在各细胞系中均有不同水平的表达，PAa(++)，PG(+)，PG是由具有不同转移潜能的亚系组成的母系，可见PG各细胞的染色不均一，说明各细胞中G3BP的表达水平不同，表现出一定的异质性；LH7(++)显著强于BE1(+)；2B4(++)显著强于1E8(-)。
, 百拇医药
图2 G3BP在细胞内的免疫组化，阳性信号即位于胞质的棕黄色颗粒(正文见第325页)
图1 上图示G3BP(3.3 kb)Northern杂交，PAa杂交信号强于PG；LH7杂交信号强于BE1；2B4杂交信号强于1E8。下图示β-actin作为内参照在6个细胞系中杂交信号强度一致。
图2 蛋白质Western免疫印迹杂交。可见PAa阳性信号强于PG；LH7阳性信号强于BE1；2B4阳性信号强于1E8，G3BP阳性信号位于68 kD处。
讨 论
G3BP由法国Rhone-Poulenc Rorer实验室于1996年克隆[4]。G3BP蛋白由466个氨基酸组成，位于胞质。GAP(RAS-GTPase Activiting Protein)是Ras信号传导通路中重要的调控分子及下游靶分子。G3BP是第一个被证实与GAP的SH3(Src Homology)功能区牢固结合的分子，当ras处于激活状态时GAP-G3BP复合物形成。三年来国外各实验室的工作集中于G3BP生化功能的研究。先后揭示了G3BP具有内源性核糖核酸酶(RNase)活性[5]及ATP和Mg2+离子依赖的DNA/RNA解旋酶活性[6]。由此推测G3BP作为接头蛋白(adapter protein)，通过与GAP-SH3功能区的牢固结合，将RNA降解与上游信号分子联系起来，从而影响某些蛋白的RNA稳定性和翻译的有效性。G3BP已成为联系RAS信号传导通路与核酸代谢的枢纽分子，可能作为RNA降解系统中的一分子，调控正常细胞的生长与分化。
, http://www.100md.com
本研究证明G3BP表达的升高与肿瘤转移能力的下降具有相关性。当研究对象扩大到三组具有不同转移潜能的癌系，涉及肺巨细胞癌，肺腺癌，前列腺癌，检测方法由mRNA差异显示，Northern 杂交(mRNA水平)扩展到蛋白质Western印迹免疫化学(蛋白水平)，免疫组织化学(抗原抗体反应，亚细胞定位)，在上述系统中均验证了这一相关性。Northern杂交，蛋白质Western印迹免疫化学，免疫组织化学的结果提示高转移癌系G3BP在mRNA转录和蛋白翻译两方面均有下降，为G3BP参与肿瘤转移这一假设提供了可靠的证据。
这一相关性是否意味着G3BP DNA 解旋酶，内源性核糖核酸酶活性的提高，使来自同一母系的某些癌细胞较其它细胞转移能力降低，而其表达的差异是否与RAS信号传导通路相关?我室将在肿瘤临床标本中继续检测G3BP与转移的相关性，结合其生化功能的研究必将为回答这一问题提供线索。
作者简介：刘宇欣，女，在读博士生。
, 百拇医药
参考文献
[1]刘宇欣，郑 杰，方伟岗，等.应用差异显示从高低转移癌系克隆出基因G3BP〔J〕.肿瘤，1999，19(5)：267
[2]刘宇欣，郑 杰，方伟岗，等.具有不同转移潜能的前列腺癌细胞亚系的分离鉴定〔J〕.中华病理学杂志，1999，28(5)：361
[3]Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, et al. Protein measure-mcnt with the folin phenol reagent〔J〕. J Biol Chem, 1951,153:256
[4]Parker F, Maurier F, Deulmeau I, et al. A ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein〔J〕. Mol Cell Biol,1996,16:2561
, 百拇医药
[5]Gallouzi I, Parker F, Chebli K, et al. A novel phosphorylation-dependent RNase activity of GAP-SH3 binding protein:a potential link between signal transduction and RNA stability〔J〕. Mol Cell Biol, 1998,18:3956
[6]Costa M, Ochem A, Staub A, et al. Human DNA helicase Ⅷ:a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway〔J〕. Nucleic Acids Res,1999,27(3):817
(收稿日期：2000-02-21), 百拇医药
单位：刘宇欣 郑杰 方伟岗 李文静 由江峰 吴秉铨(北京医科大学病理系 北京 100083)
关键词：肿瘤细胞，培养的；肿瘤转移；G3BP
肿瘤000504 摘要：目的 在三组具有不同转移潜能的癌细胞亚系中，在RNA水平及蛋白水平检测G3BP(Ras-GTPase-Activiting protein SH3 domain binding protein)与肿瘤转移潜能的相关性。方法 研究对象为三组具有不同转移潜能的癌细胞亚系，即PG(人肺巨细胞癌，裸鼠体内转移率100%)与PAa(人肺腺癌，无转移)；PG亚系BE1与LH7(前者裸鼠体内转移率100%，后者无转移)；1E8与2B4来自人前列腺癌PC-3M(前者裸鼠体内转移率100%，后者无转移)。检测方法包括Northern 杂交，蛋白质Western印迹免疫化学，免疫组织化学。结果 应用mRNA差异显示技术对比研究具有不同转移潜能的亚系BE1，LH7时，发现一个849 bp片段在BE1低表达，而在LH7高表达，经Northern杂交验证其表达差异后测序，GenBank Blastn检索，与G3BP同源性高达99%。在三组具有不同转移潜能的癌系中，Northern杂交，蛋白质Western印迹免疫化学显示G3BP在低转移癌系LH7，2B4，PAa中表达显著高于其所对应的高转移癌系BE1，1E8，PG。免疫组织化学提示G3BP蛋白位于胞质，低转移癌系LH7，2B4，PAa表达显著高于其所对应的高转移癌系BE1，1E8，PG(PG各细胞染色不均一)。结论 在mRNA水平和蛋白质水平，G3BP在三组高低转移癌系中的表达具有显著差异，在低转移癌系中的表达水平显著高于其所对应的高转移癌系，提示G3BP与肿瘤的转移表型可能具有相关性。
, http://www.100md.com
中图分类号：R73-37 文献标识码：A
文章编号：1000-7431(2000)05-0325-03
G3BP EXPRESSION IN HUMAN CARCINOMA CELL SUBLINES WITH OR WITHOUT METASTATIC POTENTIAL
LIU Yu-xin, ZHENG Jie, FANG Wei-gang, et al.
(Department of Pathology, Beijing Medical University，Beijing 10083,China)
Abstract：Objective The relationship between G3BP (Ras-GTPase-Activating protein SH3 domain binding protein) and cancer metastasis was studied. Methods G3BP expression in three pairs of cancer cell sublines with/without metastatic potential (BE1/LH7, 1E8/2B4 and PG/PAa) was confirmed by Northern hybridization, Western blotting and immunohistochemical analysis. Results G3BP was obtaine by mRNA differential display and it displayed a strong expression in LH7 (no metastatic potential in recipient nude mice ) and a very weak expression in BE1 (100% metastatic frequency). Northern blotting and Western blotting with a polyclonal G3BP antibody confirmed an increased G3BP expression in non-metastatic cell lines (LH7, 2B4, PAa) compared with highly metastatic cell lines (BE1, 1E8, PG). Immunohistochemical analysis demonstrated a prominent granular pattern of G3BP accumulation in cytoplasm. Conclusion The results revealed a significant association between G3BP expression and cancer metastasis, due to its different expressions in messenger RNA and protein level between the three pairs of cell sublines with different metastatic potentials.
, 百拇医药
Key words：Tumor cell,clutured Neoplasm metastasis； G3BP
我室应用mRNA差异显示技术对比研究来自人肺巨细胞癌PG的亚系BE1，LH7时(前者裸鼠体内转移率100%，后者无转移)，克隆一个849 bp片段在BE1低表达，而在LH7高表达，经GenBank Blastn检索，与G3BP(Ras-GTPase-Activiting protein SH3 domain binding protein)同源性高达99%，提示G3BP与肿瘤的转移具有一定的相关性[1]。现将研究对象扩展到另两组具有不同转移潜能的癌细胞系，包括人肺巨细胞癌PG(裸鼠体内100%转移)，人肺腺癌PAa(裸鼠体内不转移)，人前列腺癌PC-3M亚系1E8，2B4(我室分离建立，前者裸鼠体内100%转移，后者无转移)[2]；同时将检测方法由差异显示扩展到RNA水平(Northern杂交)，蛋白水平(蛋白质Western印迹免疫化学，免疫组织化学)检测G3BP与肿瘤转移潜能的相关性，为G3BP参与肿瘤转移这一假设提供依据。
, http://www.100md.com
材料与方法
一、细胞培养 人肺巨细胞癌PG及其亚系BE1、LH7、人肺腺癌PAa，人前列腺癌PC-3M亚系1E8、2B4，以含10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养，贴壁生长，置37 ℃，5 % CO2培养箱中。
二、Northern杂交 异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA。分光光度计测A260 nm，计算RNA含量，取15 μg 总RNA于2%甲醛变性琼脂糖/EB胶电泳约4 h(电压10 V/cm)，紫外灯下观察记录18S(约2 kb)，28 S(约5 kb)与上样孔的距离。10×SSC为缓冲液按常规方法吸印过夜。硝酸纤维膜80℃烤90 min。以G3BP PCR产物25 ng为模板，按照Prim-a-gene试剂盒(Promega公司)说明书随机引物法标记探针。将硝酸纤维素膜封入杂交袋中，按0.2 ml/cm2加预杂交液(6×SSC，50 % 甲酰胺，1 % SDS，1×Denhard试剂)，42 ℃预杂交3 h后加入已100 ℃变性5 min的探针，42 ℃杂交过夜。以2×SSC，0.1 % SDS 200 ml室温洗膜15 min 2次，0.2×SSC，0.1 % SDS 200 ml 42 ℃洗膜15 min2次。膜在2×SSC中漂洗后放射自显影1～3天，以β-actin作为内参照。
, 百拇医药
三、蛋白质Western印迹免疫化学 生长状态良好的细胞PBS洗两遍，用细胞刮子收集细胞，加入100 μl悬浮缓冲液(0.1 mol/L NaCl，0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.6，0.01 mol/L EDTA pH 8.0，100 μg/ml 苯*****)混匀，加100 μl 2×SDS 上样缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl pH 6.8，200 mmol/L DTT， 4 % SDS，0.2 %溴酚兰，20 % 甘油)混匀，冰浴30 min，100 ℃ 10 min，超声裂解至溶液的粘稠度可控，10 000转离心10 min，收集上清分装。Lowry法测定蛋白浓度[3]，配置5%浓缩胶：水3.4 ml，30%丙烯酰胺0.83 ml，1 mol/L Tris-HCl (pH 6.8) 0.63 ml，10 % SDS 0.05 ml，10 % AP 0.05 ml，TEMED 0.005 ml；10 % 分离胶：水4.0 ml，30 %丙烯酰胺3.3 ml，1.5 mol/L Tris-HCl (pH 8.8) 2.5 ml，10 % SDS 0.1 ml，10 % AP 0.1 ml，TEMED 0.004 ml。取各细胞系蛋白 100 μg， 100 ℃变性 5 min，4 ℃，电泳4～6 h(浓缩胶100 V，分离胶120 V)，电泳缓冲液为25 mmol/L Tris-HCl，250 mmol/L 甘氨酸 pH 8.3，0.1 % SDS。电泳结束后将凝胶置于电转移缓冲液中(39 mmol/L 甘氨酸，48 mmol/L Tris， 0.037 % SDS， 20 % 甲醇)浸泡30 min，用夹心法把滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、滤纸依次固定，插入电转移槽中，凝胶在阴极，硝膜在阳极方向，加入转移缓冲液，50 V、4℃ 转移12～14 h。硝膜以丽春红染色，对照蛋白分子量标志剪下相应部位的硝膜放入杂交袋中，5% 脱脂奶粉/PBS封闭1 h，然后按0.2 ml/cm2加入一抗(兔G3BP多克隆抗体，由法国Rhone-Poulenc Rorer实验室馈赠，1∶500稀释)4 ℃过夜。0.05 %吐温/PBS洗膜15 min 3次后，加入羊抗兔的IgG-HRP(1∶2000)室温1 h。用0.05 %吐温/PBS洗膜15 min3次。采用发光试剂(Santa Cruz生物技术公司)检测特异条带，X光片曝光。
, 百拇医药
四、免疫组织化学 采用ABC试剂盒(Vector公司)，G3BP多克隆抗体由法国Rhone-Poulenc Rorer实验室馈赠。细胞培养于载玻片上24 h，丙酮固定30 min，PBS洗3次共15 min，0.3 % H2O2灭活内源性过氧化氢酶30 min，PBS洗，0.3 % Triton打孔5 min，PBS洗，10 %兔血清封闭37 ℃ 30 min，PBS洗，滴加G3BP多克隆抗体(1∶500)，湿盒中温育4 ℃过夜，PBS洗，滴加生物素标记的羊抗兔二抗，室温1 h，PBS洗，滴加AB液(A与B液等量，于用前30 min混匀)，室温30 min，PBS洗，0.04% DAB加入0.03% H2O2显色10 min，充分水洗，苏木素复染，中性树脂封片，镜检。凡细胞质内出现明显的棕黄色颗粒为阳性细胞。染色强度分级：根据阳性细胞占全部细胞的比例分为，阴性(-)，无阳性细胞或阳性细胞数少于5%；阳性(+)，阳性细胞占5 %～50 %；强阳性(++)，阳性肿瘤细胞>50 %。同时以PBS替代一抗作为空白对照。
, http://www.100md.com
结 果
一、Northern杂交 如图1所示，mRNA水平，G3BP在各细胞系中均有不同水平的表达，在低转移癌系中的表达高于其相应的高转移癌系：可见PAa杂交信号强于PG；LH7杂交信号强于BE1；2B4杂交信号强于1E8。根据G3BP的杂交信号位置估计其mRNA约3.3 kb，与文献报道相符。下图显示β-actin作为内参照，在6个细胞系中杂交信号强度一致。
二、蛋白质Western印迹免疫化学 如图2所示，蛋白质水平，G3BP在各细胞系中 有不同水平的表达，G3BP在低转移癌系中的蛋白表达高于其相应的高转移癌系：PAa阳性信号强于PG；LH7阳性信号强于BE1；2B4阳性信号强于1E8。阳性信号位于68 kD处，与文献报道相符。
三、免疫组织化学 (见插页第Ⅰ页图2)所示，免疫组化阳性信号为位于胞质的棕黄色颗粒，G3BP在各细胞系中均有不同水平的表达，PAa(++)，PG(+)，PG是由具有不同转移潜能的亚系组成的母系，可见PG各细胞的染色不均一，说明各细胞中G3BP的表达水平不同，表现出一定的异质性；LH7(++)显著强于BE1(+)；2B4(++)显著强于1E8(-)。
, 百拇医药
图2 G3BP在细胞内的免疫组化，阳性信号即位于胞质的棕黄色颗粒(正文见第325页)
图1 上图示G3BP(3.3 kb)Northern杂交，PAa杂交信号强于PG；LH7杂交信号强于BE1；2B4杂交信号强于1E8。下图示β-actin作为内参照在6个细胞系中杂交信号强度一致。
图2 蛋白质Western免疫印迹杂交。可见PAa阳性信号强于PG；LH7阳性信号强于BE1；2B4阳性信号强于1E8，G3BP阳性信号位于68 kD处。
讨 论
G3BP由法国Rhone-Poulenc Rorer实验室于1996年克隆[4]。G3BP蛋白由466个氨基酸组成，位于胞质。GAP(RAS-GTPase Activiting Protein)是Ras信号传导通路中重要的调控分子及下游靶分子。G3BP是第一个被证实与GAP的SH3(Src Homology)功能区牢固结合的分子，当ras处于激活状态时GAP-G3BP复合物形成。三年来国外各实验室的工作集中于G3BP生化功能的研究。先后揭示了G3BP具有内源性核糖核酸酶(RNase)活性[5]及ATP和Mg2+离子依赖的DNA/RNA解旋酶活性[6]。由此推测G3BP作为接头蛋白(adapter protein)，通过与GAP-SH3功能区的牢固结合，将RNA降解与上游信号分子联系起来，从而影响某些蛋白的RNA稳定性和翻译的有效性。G3BP已成为联系RAS信号传导通路与核酸代谢的枢纽分子，可能作为RNA降解系统中的一分子，调控正常细胞的生长与分化。
, http://www.100md.com
本研究证明G3BP表达的升高与肿瘤转移能力的下降具有相关性。当研究对象扩大到三组具有不同转移潜能的癌系，涉及肺巨细胞癌，肺腺癌，前列腺癌，检测方法由mRNA差异显示，Northern 杂交(mRNA水平)扩展到蛋白质Western印迹免疫化学(蛋白水平)，免疫组织化学(抗原抗体反应，亚细胞定位)，在上述系统中均验证了这一相关性。Northern杂交，蛋白质Western印迹免疫化学，免疫组织化学的结果提示高转移癌系G3BP在mRNA转录和蛋白翻译两方面均有下降，为G3BP参与肿瘤转移这一假设提供了可靠的证据。
这一相关性是否意味着G3BP DNA 解旋酶，内源性核糖核酸酶活性的提高，使来自同一母系的某些癌细胞较其它细胞转移能力降低，而其表达的差异是否与RAS信号传导通路相关?我室将在肿瘤临床标本中继续检测G3BP与转移的相关性，结合其生化功能的研究必将为回答这一问题提供线索。
作者简介：刘宇欣，女，在读博士生。
, 百拇医药
参考文献
[1]刘宇欣，郑 杰，方伟岗，等.应用差异显示从高低转移癌系克隆出基因G3BP〔J〕.肿瘤，1999，19(5)：267
[2]刘宇欣，郑 杰，方伟岗，等.具有不同转移潜能的前列腺癌细胞亚系的分离鉴定〔J〕.中华病理学杂志，1999，28(5)：361
[3]Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, et al. Protein measure-mcnt with the folin phenol reagent〔J〕. J Biol Chem, 1951,153:256
[4]Parker F, Maurier F, Deulmeau I, et al. A ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein〔J〕. Mol Cell Biol,1996,16:2561
, 百拇医药
[5]Gallouzi I, Parker F, Chebli K, et al. A novel phosphorylation-dependent RNase activity of GAP-SH3 binding protein:a potential link between signal transduction and RNA stability〔J〕. Mol Cell Biol, 1998,18:3956
[6]Costa M, Ochem A, Staub A, et al. Human DNA helicase Ⅷ:a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway〔J〕. Nucleic Acids Res,1999,27(3):817
(收稿日期：2000-02-21), 百拇医药