多药耐药基因在白血病细胞的高效转移与表达研究
作者：傅建新 王玮 岑建农 李建勇 阮长耿 陈子兴
单位：傅建新 王玮 岑建农 李建勇 阮长耿 陈子兴(苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所 苏州215006)
关键词：基因转移；逆转录病毒；基因，MDR；基因表达；白血病；肿瘤细胞，培养的
肿瘤000502 摘要：目的 研究逆转录病毒介导多药耐药基因MDR1的转移与表达。方法 用MDR病毒转导人类白血病细胞K562和NB4，获得耐药细胞系；外源性MDR1基因的转移和表达用聚合酶链反应(PCR)、流式细胞术(FCM)和半固体集落培养法分析。结果 MDR病毒转导使白血病细胞获得经典多药耐药表型，78.0%～98.7%的细胞表达P-糖蛋白；PCR分析证实耐药细胞整合有MDR原病毒，并共表达全长和异常剪切MDR1转录本。以K562细胞为模型，FCM和集落培养法发现共培养法的基因转导率(67.9%～72.5%)明显高于上清法(33.1%～46.8%)，加入生长因子可提高基因转导率约23%。结论 逆转录病毒可介导MDR1基因在髓系白血病细胞进行有效的转移与表达；MDR1基因可作为选择性标志用于基因治疗。
, 百拇医药
中图分类号：Q78 文献标识码：A
文章编号：1000-7431(2000)05-0319-03
TRANSFER AND EXPRESSION OF HUMAN MULTIDRUG RESISTANCE GENE MEDIATED BY RETROVIRUS IN HUMAN LEUKEMIC CELLS
FU Jian-xin，WANG Wei,CEN Jian-nong,et al.
(Jiangsu Institute of Hematology, First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College,Suzhou 215006,China)
Abstract：Objective To investigate retroviral-mediated transfer and expression of MDR1 gene in leukemic cells. Methods Human myeloid leukemia cells, K562 and NB4, were transduced by MDR retrovirus and the resistant cells were selected. The transduction and expression of MDR1 gene were analyzed by using polymerase chain reaction (PCR), flow cytometry (FCM) and semisolid colonies culture.Results The resistant cell lines, K562/MDR and NB4/MDR, displayed a typical MDR phenotype, in which the integration and expression of MDR1 gene were confirmed by both PCR and FCM analysis. In addition, the expression were noted by both truncated and full-length transcripts. The transduction efficiency in K562 cells was analyzed both on suspension cultures and single-cell colonies. The transduction was significantly more efficient with cocultivation (67.9%～72.5%) than with supernatants (33.1%～46.8%), while the addition of growth factors may improve the efficiency. Conclusion Retrovirus could allow the functional transfer and expression of MDR1 gene in leukemia cells, and MDR1 might act as a selectable gene for coexpression with the genes of interest in gene therapy.
, 百拇医药
Key words： Gene transfer; Retrovirus; Genes,MDR; Gene expression; Leukemia; Tumor cell,cultured
多药耐药基因MDR1编码能量依赖性排出泵——P-糖蛋白(P-gp)，作为化疗保护性基因或选择性基因已被应用[1，2]。本研究利用逆转录病毒将MDR1基因导入白血病细胞，并探讨其作为选择性基因的可能性。
材料与方法
1.主要材料 TRIzol试剂和逆转录酶(Gibco-BRL)；长春新碱(VCR)、秋水仙碱(COL)和聚凝胺(Sigma)；柔红霉素(DNR，Farmitalia)；藻红蛋白直标的P-gp单抗UIC2(Immunotech)；甲基纤维素(Fisher Scientific)。
2.细胞系 通过脂质体转染与病毒转导获得双嗜型逆转录病毒生产细胞PA317/HaMDR，其上清中MDR病毒滴度约为8.5×105CFU/ml[3]。白血病细胞系K562和NB4细胞由本实验室常规保存。
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3.耐药白血病细胞 用含4 mg/L聚凝胺的病毒上清转导K562和NB4细胞，50～100 μg/L COL选择2周，分别得到耐药细胞系；MTT比色法测定其对不同药物的IC50值。
4.聚合酶链反应(PCR) 用于检测MDR1基因整合和表达的引物hMDR1～5见文献[4](图1)。常规提取白血病细胞DNA后，用引物hMDR1和2分析全长MDR1基因的整合；TRIzol试剂一步法提取细胞总RNA，逆转录反应后用半定量PCR检测MDR1基因的两种转录本。
图1 HaMDR原病毒结构、剪切位点及引物示意图
5.MDR1基因转移效率分析 以K562细胞为代表，对三种转导方法的转移效率进行比较。①共培养法，K562细胞与约50%融合的病毒生产细胞按1∶1比例共培养；②上清法，K562细胞加半量病毒上清，24 h重复1次；③上清+生长因子法，除加20%的5637细胞(ATCC HTB9)条件培养液外，余同②。继续培养48 h后收集转导细胞，分别用流式细胞术(FCM)和集落培养法分析转移效率。
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6.P-gp表达的检测 用单抗UIC2和FCM分析细胞表面P-gp的表达[3]。
7.转导细胞的集落培养 用1%甲基纤维素进行半固体集落培养。培养体系中加或不加20 μg/L COL，于培养7～10天后分别计数耐药集落和总集落，用耐药集落的比例反映基因转导率。
结 果
1.耐药细胞系的一般特性 K562/MDR和NB4/MDR细胞对化疗药物产生耐药，尤以K562/MDR细胞为显著(见表1)，该性状已稳定持续40余周。此外，耐药细胞的形态与转导前无明显差别。
表1 MDR1基因转导白血病细胞的耐药特性 药物
IC50，μg/L(耐药倍数)
, http://www.100md.com K562细胞
K562/MDR细胞
NB4细胞
NB4/MDR细胞
VCR
6.08±1.08
471.4±145.5(77.5)
5.33±1.32
302.7±133.5(56.8)
COL
2.24±0.64
91.21±5.32(40.7)
, http://www.100md.com
3.27±0.88
144.5± 9.72(44.2)
DNR
22.41±2.01
524.4±127.6(23.4)
18.09±1.27
174.3±18.86(9.6)
2.MDR1基因的整合和转录 经PCR扩增，对照细胞仅出现MDR1基因组内源性扩增产物(830 bp)；耐药细胞因整合有MDR原病毒，还同时出现283 bp的特异性产物。为检测MDR1转基因的表达水平，首先用引物对3～4证实耐药细胞高表达MDR1基因(产物为157 bp)；图2为用特异性引物对1～2(产物283 bp)和5～4(产物460 bp)分别检测MDR1基因的全长和截短转录本，表明耐药白血病细胞与病毒生产细胞相同，存在两种MDR1基因转录本，提示MDR1基因内部异常剪切位点的存在。
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图2 逆转录-PCR分析MDR1基因的转录与异常剪切
1.K562细胞；2.K562/MDR细胞；3.NB4细胞；4.NB4/MDR细胞；5.PA317/HaMDR细胞；6.HaMDR质粒对照；7.阴性对照；M.分子量标准(pUC19 DNA/MspI,MBI公司)
3.耐药细胞的P-gp表达 用P-gp特异性单抗UIC2证实K562/MDR和NB4/MDR细胞均表达P-gp，阳性率分别达98.7%和78.0%，阴性对照仅分别为1.4%与0.2%(见图3)。提示外源性MDR1基因有高效表达。
4.基因转导效率分析 FCM分析发现共培养法、上清法和上清+生长因子法的转导率(以P-gp阳性率表示)分别为72.5%，38.1%和46.8%，共培养法比后两者分别提高90%和55%；半固体培养法则从P-gp功能分析转导率，3种方法的转导率依次为67.9%，33.1.和41.0%。
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讨 论
MDR1基因的转移和表达在临床有两方面应用前景[1]：作为保护性基因用于预防大剂量化疗所致的骨髓抑制；在基因治疗中作为显性选择基因。本研究建立了逆转录病毒介导的MDR1基因转移系统，在恶性造血细胞中高效表达，并获得稳定的单因素耐药白血病细胞模型。
以MDR1为保护性基因的方案已开始临床试验，但基因标记水平低而效果有限[2]。最近，Bunting等[5]发现移植经MDR1基因转导并离体扩增的造血干细胞(HSC)可引起骨髓增殖综合征，使该策略的前景更为暗淡。相反，作为选择性基因，MDR1具有相当的优越性：已明确P-gp为脂类转移酶，在HSC中低表达；对人体无免疫原性，在体内、外均可对基因修饰靶细胞进行选择或富集。磁珠细胞分选(MACS)技术的发展，使以细胞表面分子(如：NGF受体、CD24或P-gp等)为选择性标志的基因转移成为可能，其中P-gp兼有体内选择的特性而倍受重视[1，2]。
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图3 FCM分析白血病细胞表面P-gp的表达
A:K562细胞和K562/MDR细胞；B:NB4细胞和NB4/MDR细胞
靶细胞的周期状态和靶细胞-病毒结合是影响逆转录病毒介导基因转移的主要因素[2]。本研究以MDR1基因为选择性标志，证实共培养的转导率明显高于上清，而含有GM-CSF等细胞因子的5637细胞条件培养液可提高转导率，也提示用细胞表面分子P-gp作为标志来进行基因转移研究是简便可行的。今后将通过优化基因转导条件来提高对人类造血干/祖细胞的转导率。作者运用逆转录-PCR发现骨髓单个核细胞、白血病细胞(包括K562和NB4)及外周血淋巴细胞均有双嗜型逆转录病毒受体(GALVR2)表达，为基因转移研究提供了依据。
通过转基因或基因剔除小鼠已证实，MDR1基因在分化与发育过程中无重要作用；但也有P-gp表达可抑制细胞分化或凋亡的报道[5，6]。作者发现NB4/MDR细胞仍可被全反式维甲酸诱导分化，且与NB4细胞相比并无差异。因NB4/MDR细胞是P-gp介导的单因素耐药，应该比药物诱导的耐药细胞更为可靠。作为细胞凋亡信使的神经酰胺也是P-gp的底物，提示P-gp与细胞凋亡有相关性[7]，K562/MDR细胞正是分析P-gp表达与细胞凋亡耐受的内在联系的良好模型。目前，本实验室正利用该模型研究MDR1基因转导对砷剂诱导白血病细胞凋亡的影响。可以预见，通过基因转移获得的耐药白血病细胞将有助于阐明经典MDR的特点及其与细胞凋亡之间的联系；而以MDR1为体内选择性基因和细胞表达标志的策略将在今后的基因治疗实践中广泛应用。
, http://www.100md.com
基金项目：本课题受江苏省卫生厅科研项目(H9549)资助
作者简介：傅建新，男，医学硕士，助理研究员。
参考文献
[1]Licht T, Herrmann F, Gottesman MM, et al. In vivo drug-selectable genes: a new concept in gene therapy〔J〕. Stem Cells, 1997,15:104
[2]Havenga M, Hoogerbrugge P, Valerio D, et al. Retroviral stem cell gene therapy〔J〕. Stem Cells, 1997,15:162
[3]傅建新，陈子兴，阮长耿.多药耐药基因MDR1的转移与表达研究〔J〕.苏州医学院学报，1999，19：249
, http://www.100md.com
[4]Fu JX, Wang W, Ruan CG, et al. Efficient expression of human multidrug resistance 1 gene mediated by retroviral vector containing internal ribosomal entry site〔J〕. 中国实验血液学杂志，1999，7：198
[5]Bunting KD, Galigeau J, Topham D, et al. Transduction of bone marrow cells with an MDR1 vector enables ex vivo stem cell expansion, but these expanded grafts cause a myeloproliferative syndrome in transplanted mic〔J〕. Blood,1998,92:2269
[6]Matsushita H, Kizaki M, Kobayashi H, et al. Restoration of retinoid sensitivity by MDR1 ribozymes in retinoic acid-resistant myeloid leukemia cells〔J〕. Blood,1998,91:2452
[7]Bezombes C, Maestre N, Laurent G, et al. Restoration of TNF-induced ceramide generation and apoptosis in resistant human leukemia KG1a cells by the P-glycoprotein blocker PSC833〔J〕.FASEB J, 1998,12:101
(收稿日期：1999-08-16；修回日期：1999-11-05), 百拇医药
单位：傅建新 王玮 岑建农 李建勇 阮长耿 陈子兴(苏州医学院附属第一医院，江苏省血液研究所 苏州215006)
关键词：基因转移；逆转录病毒；基因，MDR；基因表达；白血病；肿瘤细胞，培养的
肿瘤000502 摘要：目的 研究逆转录病毒介导多药耐药基因MDR1的转移与表达。方法 用MDR病毒转导人类白血病细胞K562和NB4，获得耐药细胞系；外源性MDR1基因的转移和表达用聚合酶链反应(PCR)、流式细胞术(FCM)和半固体集落培养法分析。结果 MDR病毒转导使白血病细胞获得经典多药耐药表型，78.0%～98.7%的细胞表达P-糖蛋白；PCR分析证实耐药细胞整合有MDR原病毒，并共表达全长和异常剪切MDR1转录本。以K562细胞为模型，FCM和集落培养法发现共培养法的基因转导率(67.9%～72.5%)明显高于上清法(33.1%～46.8%)，加入生长因子可提高基因转导率约23%。结论 逆转录病毒可介导MDR1基因在髓系白血病细胞进行有效的转移与表达；MDR1基因可作为选择性标志用于基因治疗。
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中图分类号：Q78 文献标识码：A
文章编号：1000-7431(2000)05-0319-03
TRANSFER AND EXPRESSION OF HUMAN MULTIDRUG RESISTANCE GENE MEDIATED BY RETROVIRUS IN HUMAN LEUKEMIC CELLS
FU Jian-xin，WANG Wei,CEN Jian-nong,et al.
(Jiangsu Institute of Hematology, First Affiliated Hospital of Suzhou Medical College,Suzhou 215006,China)
Abstract：Objective To investigate retroviral-mediated transfer and expression of MDR1 gene in leukemic cells. Methods Human myeloid leukemia cells, K562 and NB4, were transduced by MDR retrovirus and the resistant cells were selected. The transduction and expression of MDR1 gene were analyzed by using polymerase chain reaction (PCR), flow cytometry (FCM) and semisolid colonies culture.Results The resistant cell lines, K562/MDR and NB4/MDR, displayed a typical MDR phenotype, in which the integration and expression of MDR1 gene were confirmed by both PCR and FCM analysis. In addition, the expression were noted by both truncated and full-length transcripts. The transduction efficiency in K562 cells was analyzed both on suspension cultures and single-cell colonies. The transduction was significantly more efficient with cocultivation (67.9%～72.5%) than with supernatants (33.1%～46.8%), while the addition of growth factors may improve the efficiency. Conclusion Retrovirus could allow the functional transfer and expression of MDR1 gene in leukemia cells, and MDR1 might act as a selectable gene for coexpression with the genes of interest in gene therapy.
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Key words： Gene transfer; Retrovirus; Genes,MDR; Gene expression; Leukemia; Tumor cell,cultured
多药耐药基因MDR1编码能量依赖性排出泵——P-糖蛋白(P-gp)，作为化疗保护性基因或选择性基因已被应用[1，2]。本研究利用逆转录病毒将MDR1基因导入白血病细胞，并探讨其作为选择性基因的可能性。
材料与方法
1.主要材料 TRIzol试剂和逆转录酶(Gibco-BRL)；长春新碱(VCR)、秋水仙碱(COL)和聚凝胺(Sigma)；柔红霉素(DNR，Farmitalia)；藻红蛋白直标的P-gp单抗UIC2(Immunotech)；甲基纤维素(Fisher Scientific)。
2.细胞系 通过脂质体转染与病毒转导获得双嗜型逆转录病毒生产细胞PA317/HaMDR，其上清中MDR病毒滴度约为8.5×105CFU/ml[3]。白血病细胞系K562和NB4细胞由本实验室常规保存。
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3.耐药白血病细胞 用含4 mg/L聚凝胺的病毒上清转导K562和NB4细胞，50～100 μg/L COL选择2周，分别得到耐药细胞系；MTT比色法测定其对不同药物的IC50值。
4.聚合酶链反应(PCR) 用于检测MDR1基因整合和表达的引物hMDR1～5见文献[4](图1)。常规提取白血病细胞DNA后，用引物hMDR1和2分析全长MDR1基因的整合；TRIzol试剂一步法提取细胞总RNA，逆转录反应后用半定量PCR检测MDR1基因的两种转录本。
图1 HaMDR原病毒结构、剪切位点及引物示意图
5.MDR1基因转移效率分析 以K562细胞为代表，对三种转导方法的转移效率进行比较。①共培养法，K562细胞与约50%融合的病毒生产细胞按1∶1比例共培养；②上清法，K562细胞加半量病毒上清，24 h重复1次；③上清+生长因子法，除加20%的5637细胞(ATCC HTB9)条件培养液外，余同②。继续培养48 h后收集转导细胞，分别用流式细胞术(FCM)和集落培养法分析转移效率。
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6.P-gp表达的检测 用单抗UIC2和FCM分析细胞表面P-gp的表达[3]。
7.转导细胞的集落培养 用1%甲基纤维素进行半固体集落培养。培养体系中加或不加20 μg/L COL，于培养7～10天后分别计数耐药集落和总集落，用耐药集落的比例反映基因转导率。
结 果
1.耐药细胞系的一般特性 K562/MDR和NB4/MDR细胞对化疗药物产生耐药，尤以K562/MDR细胞为显著(见表1)，该性状已稳定持续40余周。此外，耐药细胞的形态与转导前无明显差别。
表1 MDR1基因转导白血病细胞的耐药特性 药物
IC50，μg/L(耐药倍数)
, http://www.100md.com K562细胞
K562/MDR细胞
NB4细胞
NB4/MDR细胞
VCR
6.08±1.08
471.4±145.5(77.5)
5.33±1.32
302.7±133.5(56.8)
COL
2.24±0.64
91.21±5.32(40.7)
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3.27±0.88
144.5± 9.72(44.2)
DNR
22.41±2.01
524.4±127.6(23.4)
18.09±1.27
174.3±18.86(9.6)
2.MDR1基因的整合和转录 经PCR扩增，对照细胞仅出现MDR1基因组内源性扩增产物(830 bp)；耐药细胞因整合有MDR原病毒，还同时出现283 bp的特异性产物。为检测MDR1转基因的表达水平，首先用引物对3～4证实耐药细胞高表达MDR1基因(产物为157 bp)；图2为用特异性引物对1～2(产物283 bp)和5～4(产物460 bp)分别检测MDR1基因的全长和截短转录本，表明耐药白血病细胞与病毒生产细胞相同，存在两种MDR1基因转录本，提示MDR1基因内部异常剪切位点的存在。
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图2 逆转录-PCR分析MDR1基因的转录与异常剪切
1.K562细胞；2.K562/MDR细胞；3.NB4细胞；4.NB4/MDR细胞；5.PA317/HaMDR细胞；6.HaMDR质粒对照；7.阴性对照；M.分子量标准(pUC19 DNA/MspI,MBI公司)
3.耐药细胞的P-gp表达 用P-gp特异性单抗UIC2证实K562/MDR和NB4/MDR细胞均表达P-gp，阳性率分别达98.7%和78.0%，阴性对照仅分别为1.4%与0.2%(见图3)。提示外源性MDR1基因有高效表达。
4.基因转导效率分析 FCM分析发现共培养法、上清法和上清+生长因子法的转导率(以P-gp阳性率表示)分别为72.5%，38.1%和46.8%，共培养法比后两者分别提高90%和55%；半固体培养法则从P-gp功能分析转导率，3种方法的转导率依次为67.9%，33.1.和41.0%。
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讨 论
MDR1基因的转移和表达在临床有两方面应用前景[1]：作为保护性基因用于预防大剂量化疗所致的骨髓抑制；在基因治疗中作为显性选择基因。本研究建立了逆转录病毒介导的MDR1基因转移系统，在恶性造血细胞中高效表达，并获得稳定的单因素耐药白血病细胞模型。
以MDR1为保护性基因的方案已开始临床试验，但基因标记水平低而效果有限[2]。最近，Bunting等[5]发现移植经MDR1基因转导并离体扩增的造血干细胞(HSC)可引起骨髓增殖综合征，使该策略的前景更为暗淡。相反，作为选择性基因，MDR1具有相当的优越性：已明确P-gp为脂类转移酶，在HSC中低表达；对人体无免疫原性，在体内、外均可对基因修饰靶细胞进行选择或富集。磁珠细胞分选(MACS)技术的发展，使以细胞表面分子(如：NGF受体、CD24或P-gp等)为选择性标志的基因转移成为可能，其中P-gp兼有体内选择的特性而倍受重视[1，2]。
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图3 FCM分析白血病细胞表面P-gp的表达
A:K562细胞和K562/MDR细胞；B:NB4细胞和NB4/MDR细胞
靶细胞的周期状态和靶细胞-病毒结合是影响逆转录病毒介导基因转移的主要因素[2]。本研究以MDR1基因为选择性标志，证实共培养的转导率明显高于上清，而含有GM-CSF等细胞因子的5637细胞条件培养液可提高转导率，也提示用细胞表面分子P-gp作为标志来进行基因转移研究是简便可行的。今后将通过优化基因转导条件来提高对人类造血干/祖细胞的转导率。作者运用逆转录-PCR发现骨髓单个核细胞、白血病细胞(包括K562和NB4)及外周血淋巴细胞均有双嗜型逆转录病毒受体(GALVR2)表达，为基因转移研究提供了依据。
通过转基因或基因剔除小鼠已证实，MDR1基因在分化与发育过程中无重要作用；但也有P-gp表达可抑制细胞分化或凋亡的报道[5，6]。作者发现NB4/MDR细胞仍可被全反式维甲酸诱导分化，且与NB4细胞相比并无差异。因NB4/MDR细胞是P-gp介导的单因素耐药，应该比药物诱导的耐药细胞更为可靠。作为细胞凋亡信使的神经酰胺也是P-gp的底物，提示P-gp与细胞凋亡有相关性[7]，K562/MDR细胞正是分析P-gp表达与细胞凋亡耐受的内在联系的良好模型。目前，本实验室正利用该模型研究MDR1基因转导对砷剂诱导白血病细胞凋亡的影响。可以预见，通过基因转移获得的耐药白血病细胞将有助于阐明经典MDR的特点及其与细胞凋亡之间的联系；而以MDR1为体内选择性基因和细胞表达标志的策略将在今后的基因治疗实践中广泛应用。
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基金项目：本课题受江苏省卫生厅科研项目(H9549)资助
作者简介：傅建新，男，医学硕士，助理研究员。
参考文献
[1]Licht T, Herrmann F, Gottesman MM, et al. In vivo drug-selectable genes: a new concept in gene therapy〔J〕. Stem Cells, 1997,15:104
[2]Havenga M, Hoogerbrugge P, Valerio D, et al. Retroviral stem cell gene therapy〔J〕. Stem Cells, 1997,15:162
[3]傅建新，陈子兴，阮长耿.多药耐药基因MDR1的转移与表达研究〔J〕.苏州医学院学报，1999，19：249
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[4]Fu JX, Wang W, Ruan CG, et al. Efficient expression of human multidrug resistance 1 gene mediated by retroviral vector containing internal ribosomal entry site〔J〕. 中国实验血液学杂志，1999，7：198
[5]Bunting KD, Galigeau J, Topham D, et al. Transduction of bone marrow cells with an MDR1 vector enables ex vivo stem cell expansion, but these expanded grafts cause a myeloproliferative syndrome in transplanted mic〔J〕. Blood,1998,92:2269
[6]Matsushita H, Kizaki M, Kobayashi H, et al. Restoration of retinoid sensitivity by MDR1 ribozymes in retinoic acid-resistant myeloid leukemia cells〔J〕. Blood,1998,91:2452
[7]Bezombes C, Maestre N, Laurent G, et al. Restoration of TNF-induced ceramide generation and apoptosis in resistant human leukemia KG1a cells by the P-glycoprotein blocker PSC833〔J〕.FASEB J, 1998,12:101
(收稿日期：1999-08-16；修回日期：1999-11-05), 百拇医药