神经系统疾病基因治疗研究现状
作者：叶静 刘协和
单位：叶静(首都医科大学宣武医院神经内科 100053)；刘协和(华西医科大学附属第一医院神经科)
关键词：
脑与神经疾病杂志000529
基因治疗是将外源基因导入人体细胞，使其在体内表达，产生有治疗意义的生物蛋白或关闭、抑制异常表达的基因，从而达到治疗某种疾病的目的。按技术在遗传信息的中心法则的靶向环节来分类，基因治疗可通过以下几方面技术来实现：①基因转移技术： 用人工合成基因和基因转移等技术，将一种生物的基因片段转移到另一种生物的活细胞中，插入或整合在其DNA中，从而改变其遗传结构和某些特性。这是目前开展最广泛和深入的一种方法； ②反义RNA技术： 是一种干涉性治疗。人工合成的反义RNA能与特异mRNA分子互补结合，来调控特定基因的表达，主要靶向于基因表达的翻译水平； ③反基因技术： 构建三链DNA。脱氧寡聚核苷酸以NDA双螺旋分子的专一性序列为靶物，通过与该序列形成三螺旋DNA来阻止基因转录。三链DNA被称为“能够攻击病毒和癌细胞而不损害健康组织的新型药物”。基因治疗的途径可通过生殖细胞和体细胞，前者因技术难度大，并涉及伦理学、社会学问题，尚未开展。体细胞基因治疗可根据基因转移途径分为直接法和间接法，前者是将外源目的基因直接注入体内，如肺囊性纤维化的治疗。间接法是将携带目的基因的载体导入离体培养和受体细胞，再输回患者体内，与自体组织移植类似； 或将携带目的基因的病毒载体直接导入靶器官。多数基因治疗采用间接法。从修饰目的基因的角度，基因治疗分为①基因补偿： 将有正常功能的基因导入靶细胞，以补偿由于相应内源基因的缺失或突变失活所致的蛋白质缺失。如肌萎缩营养不良的基因治疗，即是将携带正常基因的载体导入受损肌肉组织，来补偿由于不良的基因治疗，即是将携带正常基因的载体导入受损肌组织，来补偿由于基因突变所致的肌营养不良蛋白缺失。②基因纠正： 消除原有异常基因，以外源正常基因取代之。③代谢性基因交换： 促进外源正常基因表达水平超过原有异常基因表达水平，起到补偿作用。④转入反义RNA，抑制变异基因的表达。
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人类的基因治疗要满足3个必要条件，①疾病基因或治疗基因已能克隆或序列已知； ②基因产物的功能及特点已清楚； ③基因导入必须在体外或疾病动物模型中实验过。应选择病情十分严重、预后极差又没有有效常规治疗手段的疾病。
成功的基因治疗应以安全、有效、简便、实用为目的。目前的临床应用尚不十分成熟，疗效尚不确切，但未发现癌变等严重并发症。某些疾病的基因治疗虽然可改善症状，但表达水平和持续时间有待进一步提高。解决上述问题的方法主要从载体构建方面入手。目前已研制出无病毒基因的腺病毒载体、腺病毒与腺相关病毒的杂合病毒载体、质子体-质粒载体。预计在21世纪，基因治疗将成为一种生物治疗的常规方法，将成为手术、放疗、药物治疗的补充手段，其成本低于基因工程药物，可能成为新一代的治疗方法。
神经系统疾病基因治疗的研究近年已取得了一定成绩，但尚未应用于临床。由于神经系统疾病的下列特点，施行基因治疗是必要的。①神经系统遗传、变性疾病多，目前尚无有效治疗方法； ②虽然有些疾病病因明确，或已开发出生化药物，但血脑屏障使足够浓度药物达到靶细胞成为困难，易造成其它脏器副作用。如将胎脑移植给患者，使之分泌疾病所缺陷的物质，也不失为一种解决给药方式的办法，但同种异体移植有以下缺点： 第一，供体来源困难，难以找到不排斥的供体； 第二，成活困难，80～90%细胞在移植过程中死亡； 第三，供体的胚胎组织可能受到细菌、病毒的潜伏感染； 第四，颅脑手术操作复杂。由于下列原因，使某些神经系统疾病基因治疗成为可能： ①部分神经系统遗传病为单基因遗传病，致病基因已克隆，基因产物(酶或递质减少)已明确，使遗传工程方法治疗这些不治之症成为可能； ②神经元为分裂后期细胞，用DNA病毒作载体已成功； ③立体定向术在颅脑外科的广泛应用遗传工程细胞的脑内导入成为可能； ④一些中枢神经系统疾病动物模型及转基因鼠已建立，下面介绍几种常见中枢神经系统疾病的基因治疗研究现状。
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1.帕金森氏病： 是目前在基因治疗方面研究最多的中枢神经系统疾病，国内也进行了较深入研究。其病因是中脑多巴胺能神经元变性，使多巴胺合成、分泌减少，多巴胺合成限速酶-酪氨酸羟化酶(HT)可使突触后膜多巴胺增多。先将TH基因转染到成肌细胞再注入脑内，可见大鼠由阿朴吗啡诱发的旋转行为改善[1]。将脑源性神经营养因子(BDNF)基因与TH基因同时构建在逆转录病毒载体上，再注入帕金森氏病模型大鼠毁损侧纹状体内，可见BDNF基因与TH基因共表达[2]。最近国外某研究小组，已将TH基因通过腺相关病毒(AAV)载体在脑内表达。
2.肌营养不良症： Duchenne型肌营养不良(DMD)基因定位于Xp21.2，基因大小2.4MB，编码400kd的抗肌萎缩蛋白，该基因突变导致肌细胞膜抗肌萎缩蛋白全部丢失，使骨骼肌、心肌细胞死亡。Becker型肌营养不良(KMD)外显子17～48处有5.1kb缺失，产生截断蛋白。由于这两个基因均较长，难以找到合适载体，将cDNA经过修饰，去掉大部分编码蛋白中央杆部分，可装载于腺病毒载体中，在小鼠和狗的DMD模型中可部分替代致病基因，使受损肌肉再生，维持半年[3～5]。目前存在的主要问题是①转移基因只能在肌肉局部，②排斥反应。目前尚无使大量肌细胞再生并有临床疗效的方法。
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3.Huntington舞蹈病： 该基因定位于CHr 4p16.3，为CAG三核苷酸重复数异常扩增所致。CAG重复区在编码多聚谷氨酸胺蛋白基因的5’端，产生异常蛋白，导致纹体区选择性神经细胞死亡，使GABA缺失，产生舞蹈动作。目前将GABA基因和产生GABA的成纤维细胞或肌母细胞直接注入病变区，均未能缓解动物模型的GABA缺失。寄希望于将含正常CAG重复数的基因导入患病脑中。
4.肌萎缩侧索硬化(ALS)： 7～10%ALS病人为常染色体显性遗传，基因定位于21q22.2，约20%有胞浆铜-锌超氧化物歧化酶(SOD)突变。最近ALS转基因小鼠模型成功，基因治疗的目的是如何替代和修饰SOD的突变效应。原癌基因BCL-2的过表达可减弱家族性肌萎缩侧索硬化转基因鼠的脊髓运动神经元变性的数量，并可延迟运动神经元疾病的发生[6]。携带神经营养因子NT-3基因的腺病毒载体肌肉注射，使进展性运动神经元病的突变鼠寿命增加50%，运动突触丢失减少，并且肌电图评价神经肌肉功能已改善[7]。
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5.缺血性脑血管病： 已从多种途径对该病进行基因治疗研究。①针对发病危险因素： 家族性高胆固醇血症是由于LDL受体基因缺陷，将携带正常基因的载体导入体内的治疗已应用于人体。针对其它患病危险因素包括控制血压，将血管紧张素Ⅱ受体反义mRNA注射到原发高血压大鼠脑室，可使动物平均动脉压降低。②通过阻断促神经元死亡因子、增加保护因子途径： 脑缺血继发兴奋毒性损害因素有兴奋性氨基酸、细胞内钙超载、一氧化氮、氧自由基，导致细胞死亡，半暗带形成。保护机制有热休克蛋白、神经营养因子等。将携带BCL-2基因载体注入脑内，产生神经元凋亡抑制蛋白，可减轻神经元损害。谷氨酸与N-甲基D-天门冬氨酸(NMDA)受体结合，使钙内流增加，产生级联反应，诱导神经元死亡。将一种NMDA受体亚单位的反义寡聚核苷酸注入脑室，可减少钙内流及神经死亡，梗塞面积减少40%； 将人类热休克蛋白基因导入体外培养神经元，对缺血、缺氧耐受力提高。
6.Alzheimer病： 乙酰胆碱转移酶、神经营养因子的基因用于Alzheimer病治疗正在研究中。
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7.癫痫： 目前某些单基因遗传的癫痫基因定位已明确，但尚无基因治疗研究报道。通过基因替代疗法，增加脑内抑制性神经介质是最有前途的癫痫基因治疗。将谷氨酸脱羧酶(GAD67)基因装入腺病毒载体，可在新生大鼠不同脑区表达，并检出GABA在培养的神经元和胶质细胞大量产物的功能和表达[8]。这一结果给难治性癫痫的治疗新对策研究带来希望。
8.脊髓损伤： 将神经营养因子、碱性鞘蛋白基因用于脊髓损伤治疗已取得一定疗效。
目前神经系统基因治疗尚存在的问题和对策： 第一，对载体的免疫排斥，用自体工程细胞、免疫抑制剂、微囊包膜可能解决部分问题； 第二，作为分裂后期神经元的载体应用。目前较新的腺相关病毒载体存在容量小、表达时间短等缺点，尚有待改进及发现新型载体； 第三，立体定向对脑的损伤； 第四，基因转移后表达逐渐下降。可利用内源或外源调节因子调节转移基因的表达。
参考文献
, 百拇医药
1，赵迎春，等.临床神经科学，1997，5(1)∶1～5.
2，朱君明，等.中国神经精神疾病杂志，1999，25(1)∶55.
3，Dunckley MG,et al.Hum Mol Genet,1993,2∶717.
4，Acsadi G,et al.Nature,1991,352∶815.
5，Vincent N,et al.Nature,Genet,1993,5∶130.
6，Kostie V,et al.Science,1997,277(5325)∶559～562.
7，Ridoux V,et al.Exp Neurol 1997,144(1)∶92～97.
8，Robert JJ,et al.Gene Therapy 1997,4∶1237～1245.
收稿日期：2000-05-05, 百拇医药
单位：叶静(首都医科大学宣武医院神经内科 100053)；刘协和(华西医科大学附属第一医院神经科)
关键词：
脑与神经疾病杂志000529
基因治疗是将外源基因导入人体细胞，使其在体内表达，产生有治疗意义的生物蛋白或关闭、抑制异常表达的基因，从而达到治疗某种疾病的目的。按技术在遗传信息的中心法则的靶向环节来分类，基因治疗可通过以下几方面技术来实现：①基因转移技术： 用人工合成基因和基因转移等技术，将一种生物的基因片段转移到另一种生物的活细胞中，插入或整合在其DNA中，从而改变其遗传结构和某些特性。这是目前开展最广泛和深入的一种方法； ②反义RNA技术： 是一种干涉性治疗。人工合成的反义RNA能与特异mRNA分子互补结合，来调控特定基因的表达，主要靶向于基因表达的翻译水平； ③反基因技术： 构建三链DNA。脱氧寡聚核苷酸以NDA双螺旋分子的专一性序列为靶物，通过与该序列形成三螺旋DNA来阻止基因转录。三链DNA被称为“能够攻击病毒和癌细胞而不损害健康组织的新型药物”。基因治疗的途径可通过生殖细胞和体细胞，前者因技术难度大，并涉及伦理学、社会学问题，尚未开展。体细胞基因治疗可根据基因转移途径分为直接法和间接法，前者是将外源目的基因直接注入体内，如肺囊性纤维化的治疗。间接法是将携带目的基因的载体导入离体培养和受体细胞，再输回患者体内，与自体组织移植类似； 或将携带目的基因的病毒载体直接导入靶器官。多数基因治疗采用间接法。从修饰目的基因的角度，基因治疗分为①基因补偿： 将有正常功能的基因导入靶细胞，以补偿由于相应内源基因的缺失或突变失活所致的蛋白质缺失。如肌萎缩营养不良的基因治疗，即是将携带正常基因的载体导入受损肌肉组织，来补偿由于不良的基因治疗，即是将携带正常基因的载体导入受损肌组织，来补偿由于基因突变所致的肌营养不良蛋白缺失。②基因纠正： 消除原有异常基因，以外源正常基因取代之。③代谢性基因交换： 促进外源正常基因表达水平超过原有异常基因表达水平，起到补偿作用。④转入反义RNA，抑制变异基因的表达。
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人类的基因治疗要满足3个必要条件，①疾病基因或治疗基因已能克隆或序列已知； ②基因产物的功能及特点已清楚； ③基因导入必须在体外或疾病动物模型中实验过。应选择病情十分严重、预后极差又没有有效常规治疗手段的疾病。
成功的基因治疗应以安全、有效、简便、实用为目的。目前的临床应用尚不十分成熟，疗效尚不确切，但未发现癌变等严重并发症。某些疾病的基因治疗虽然可改善症状，但表达水平和持续时间有待进一步提高。解决上述问题的方法主要从载体构建方面入手。目前已研制出无病毒基因的腺病毒载体、腺病毒与腺相关病毒的杂合病毒载体、质子体-质粒载体。预计在21世纪，基因治疗将成为一种生物治疗的常规方法，将成为手术、放疗、药物治疗的补充手段，其成本低于基因工程药物，可能成为新一代的治疗方法。
神经系统疾病基因治疗的研究近年已取得了一定成绩，但尚未应用于临床。由于神经系统疾病的下列特点，施行基因治疗是必要的。①神经系统遗传、变性疾病多，目前尚无有效治疗方法； ②虽然有些疾病病因明确，或已开发出生化药物，但血脑屏障使足够浓度药物达到靶细胞成为困难，易造成其它脏器副作用。如将胎脑移植给患者，使之分泌疾病所缺陷的物质，也不失为一种解决给药方式的办法，但同种异体移植有以下缺点： 第一，供体来源困难，难以找到不排斥的供体； 第二，成活困难，80～90%细胞在移植过程中死亡； 第三，供体的胚胎组织可能受到细菌、病毒的潜伏感染； 第四，颅脑手术操作复杂。由于下列原因，使某些神经系统疾病基因治疗成为可能： ①部分神经系统遗传病为单基因遗传病，致病基因已克隆，基因产物(酶或递质减少)已明确，使遗传工程方法治疗这些不治之症成为可能； ②神经元为分裂后期细胞，用DNA病毒作载体已成功； ③立体定向术在颅脑外科的广泛应用遗传工程细胞的脑内导入成为可能； ④一些中枢神经系统疾病动物模型及转基因鼠已建立，下面介绍几种常见中枢神经系统疾病的基因治疗研究现状。
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1.帕金森氏病： 是目前在基因治疗方面研究最多的中枢神经系统疾病，国内也进行了较深入研究。其病因是中脑多巴胺能神经元变性，使多巴胺合成、分泌减少，多巴胺合成限速酶-酪氨酸羟化酶(HT)可使突触后膜多巴胺增多。先将TH基因转染到成肌细胞再注入脑内，可见大鼠由阿朴吗啡诱发的旋转行为改善[1]。将脑源性神经营养因子(BDNF)基因与TH基因同时构建在逆转录病毒载体上，再注入帕金森氏病模型大鼠毁损侧纹状体内，可见BDNF基因与TH基因共表达[2]。最近国外某研究小组，已将TH基因通过腺相关病毒(AAV)载体在脑内表达。
2.肌营养不良症： Duchenne型肌营养不良(DMD)基因定位于Xp21.2，基因大小2.4MB，编码400kd的抗肌萎缩蛋白，该基因突变导致肌细胞膜抗肌萎缩蛋白全部丢失，使骨骼肌、心肌细胞死亡。Becker型肌营养不良(KMD)外显子17～48处有5.1kb缺失，产生截断蛋白。由于这两个基因均较长，难以找到合适载体，将cDNA经过修饰，去掉大部分编码蛋白中央杆部分，可装载于腺病毒载体中，在小鼠和狗的DMD模型中可部分替代致病基因，使受损肌肉再生，维持半年[3～5]。目前存在的主要问题是①转移基因只能在肌肉局部，②排斥反应。目前尚无使大量肌细胞再生并有临床疗效的方法。
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3.Huntington舞蹈病： 该基因定位于CHr 4p16.3，为CAG三核苷酸重复数异常扩增所致。CAG重复区在编码多聚谷氨酸胺蛋白基因的5’端，产生异常蛋白，导致纹体区选择性神经细胞死亡，使GABA缺失，产生舞蹈动作。目前将GABA基因和产生GABA的成纤维细胞或肌母细胞直接注入病变区，均未能缓解动物模型的GABA缺失。寄希望于将含正常CAG重复数的基因导入患病脑中。
4.肌萎缩侧索硬化(ALS)： 7～10%ALS病人为常染色体显性遗传，基因定位于21q22.2，约20%有胞浆铜-锌超氧化物歧化酶(SOD)突变。最近ALS转基因小鼠模型成功，基因治疗的目的是如何替代和修饰SOD的突变效应。原癌基因BCL-2的过表达可减弱家族性肌萎缩侧索硬化转基因鼠的脊髓运动神经元变性的数量，并可延迟运动神经元疾病的发生[6]。携带神经营养因子NT-3基因的腺病毒载体肌肉注射，使进展性运动神经元病的突变鼠寿命增加50%，运动突触丢失减少，并且肌电图评价神经肌肉功能已改善[7]。
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5.缺血性脑血管病： 已从多种途径对该病进行基因治疗研究。①针对发病危险因素： 家族性高胆固醇血症是由于LDL受体基因缺陷，将携带正常基因的载体导入体内的治疗已应用于人体。针对其它患病危险因素包括控制血压，将血管紧张素Ⅱ受体反义mRNA注射到原发高血压大鼠脑室，可使动物平均动脉压降低。②通过阻断促神经元死亡因子、增加保护因子途径： 脑缺血继发兴奋毒性损害因素有兴奋性氨基酸、细胞内钙超载、一氧化氮、氧自由基，导致细胞死亡，半暗带形成。保护机制有热休克蛋白、神经营养因子等。将携带BCL-2基因载体注入脑内，产生神经元凋亡抑制蛋白，可减轻神经元损害。谷氨酸与N-甲基D-天门冬氨酸(NMDA)受体结合，使钙内流增加，产生级联反应，诱导神经元死亡。将一种NMDA受体亚单位的反义寡聚核苷酸注入脑室，可减少钙内流及神经死亡，梗塞面积减少40%； 将人类热休克蛋白基因导入体外培养神经元，对缺血、缺氧耐受力提高。
6.Alzheimer病： 乙酰胆碱转移酶、神经营养因子的基因用于Alzheimer病治疗正在研究中。
, http://www.100md.com
7.癫痫： 目前某些单基因遗传的癫痫基因定位已明确，但尚无基因治疗研究报道。通过基因替代疗法，增加脑内抑制性神经介质是最有前途的癫痫基因治疗。将谷氨酸脱羧酶(GAD67)基因装入腺病毒载体，可在新生大鼠不同脑区表达，并检出GABA在培养的神经元和胶质细胞大量产物的功能和表达[8]。这一结果给难治性癫痫的治疗新对策研究带来希望。
8.脊髓损伤： 将神经营养因子、碱性鞘蛋白基因用于脊髓损伤治疗已取得一定疗效。
目前神经系统基因治疗尚存在的问题和对策： 第一，对载体的免疫排斥，用自体工程细胞、免疫抑制剂、微囊包膜可能解决部分问题； 第二，作为分裂后期神经元的载体应用。目前较新的腺相关病毒载体存在容量小、表达时间短等缺点，尚有待改进及发现新型载体； 第三，立体定向对脑的损伤； 第四，基因转移后表达逐渐下降。可利用内源或外源调节因子调节转移基因的表达。
参考文献
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1，赵迎春，等.临床神经科学，1997，5(1)∶1～5.
2，朱君明，等.中国神经精神疾病杂志，1999，25(1)∶55.
3，Dunckley MG,et al.Hum Mol Genet,1993,2∶717.
4，Acsadi G,et al.Nature,1991,352∶815.
5，Vincent N,et al.Nature,Genet,1993,5∶130.
6，Kostie V,et al.Science,1997,277(5325)∶559～562.
7，Ridoux V,et al.Exp Neurol 1997,144(1)∶92～97.
8，Robert JJ,et al.Gene Therapy 1997,4∶1237～1245.
收稿日期：2000-05-05, 百拇医药