趋化因子mRNA在实验性变态反应性神经炎中表达的研究
作者：周文斌 黄琼 杨欢 朱世津 肖波 谢光洁
单位：周文斌(湖南医科大学附属湘雅医院神经内科 410008))；杨欢(湖南医科大学附属湘雅医院神经内科 410008))；肖波(湖南医科大学附属湘雅医院神经内科 410008))；谢光洁(湖南医科大学附属湘雅医院神经内科 410008))；黄琼(湖南常德市第一人民医院神经内科)；朱世津(湖南常德市第一人民医院神经内科)
关键词：趋化因子；实验性变态反应性神经炎；炎性反应
脑与神经疾病杂志000501
摘 要 目的：实验性变态反应性神经炎(EAN)是一类T细胞介导的周围神经系统的自身免疫病，可用牛坐骨神经加完全氟氏佐剂诱导而成。本文研究趋化因子mRNA在实验性变态反应性神经炎(EAN)中的表达并探索其可能的作用。方法：用兔坐骨神经匀浆免疫Wistar大鼠，诱导格林巴利综合症(GBS)的动物模型EAN；采用地高辛标记的寡核苷酸探针检测EAN病变神经组织浸润细胞上趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β) mRNA表达情况。结果：MCP-1 mRNA在临床症状出现前1-2天(14天)水平最高，随后逐渐下降；MIP-1 βmRA在临床症状出现前1-2天水平开始升高，在临床症状达到高峰时(21天)最高，进入恢复期后降至基础水平。结论：趋化因子在EAN的炎性细胞迁移及浸润进入神经细胞过程中起到重要作用。
, 百拇医药
C-C Chemokine mRNA expression in murin experimental allergic neuritis
Zhou Wenbin,Huang Qiong,Yang Huan,et al.
(Department of Neurology,Xiangya Hospital,Hunan Medical University,Changsha,410078,China)
Abstract Objective：Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a T-cell-mediated autoimmune disease of the peripheral nervous system (PNS) that can be actively induced in Lewis rats by imunization with bovine PNS myelin and Freund's complete adjuvant.In the present study,the dynamics of the expression of C-C chemokines mRNA of macrophage inflammatory protein-1 β(MIP-1 β) and monocyte chemotactic protein-1(MCP-1) were determined in the sciatic nerves of EAN.Methods:The mRNA of MIP-1 β and MCP-1 were identified in infiltrating cells in sciatic nerve sections over the course of EAN by in situ hybridization (ISH) using digoxingenin labeled riboprobes.Results:The maximum of mRNA encoding MIP-1β positive cells in the scitic nerves was seen on day 21 post immunization(p.i.) correlating with the development of severe clinical signs.Peak numbers of MCP-1 mRNA positive cellswere induced in the infiltrating cells in sciatic nerves 1-2days before clinical signs were apparent of EAN,favoring a role for these chemokines in disease development.Conclusion:These results define a subset of chemokines that may play an important role in the inflammatory process during muring EAN and have relevance for future studies on pathogenesis and treatment of GBS in humans.
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Key words Chemokine;Experimental autoimmune neuritis;Inflammation.
实验性变态反应性神经炎(EAN)是一类CD4+细胞介导的周围神经系统(PNS)的炎性脱髓鞘疾病。它可由敏感的动物PNS组织、 纯化的PNS髓鞘成分P2蛋白或P0蛋白加完全弗氏佐剂诱导而成[1～3]。EAN是研究格林-巴利综合怔(GBS)免疫病理机制的动物模型。其主要病理改变为血-神经屏障破坏，免疫球蛋白漏出，PNS周围包括T淋巴细胞，巨噬细胞等炎性细胞的浸润及小静脉旁神经及神经根的脱髓鞘[4，5]。在CD4+细胞介导的EAN中，CD4+细胞分泌的促炎性细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)及γ-干扰素(IFN-)可上调MHCⅡ类抗原，促进炎性细胞渗出进入PNS。但TNF、 IEN-并不直接对炎性细胞的迁移及渗出产生作用，此过程尚需要粘附分子及趋化因子的参与[6-8]。趋化因子是一群低分子量、 可被促炎性细胞因子(Thl)诱导的糖蛋白，由多种细胞产生，对淋巴细胞有强大的趋化作用，可活化及上调粘附分子的表达[8，9]，因而在炎性细胞从血循环聚集到PNS的过程中可能起重要作用。本实验中，我们应用原位杂交方法观察了趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)mRNA在EAN中的表达，试图探讨其在EAN中的可能作用。
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材 料 及 方 法
1.EAN模型的制备[10]：60只健康Wistar雌性大鼠(6～8)周龄，重180～200g，随机分为实验组及对照组各30只，每组各分5小组，6只为1小组。
抗原制备：健康家兔处死后立即在无菌条件下取坐骨神经，去除脂肪，肌肉及其他结缔组织，剪碎，用超声匀浆机制成匀浆，调整神经匀浆浓度为150g/L，置于-30℃冰箱备用。
EAN模型诱导：实验组每只足垫下注射等量的神经匀浆及完全弗氏佐剂(CFA)共0.5ml，对照组每只足垫下注射等量PBS及CFA共0.5ml。
2.主要试剂来源：趋化因子探针由美国R&D公司提供，其他免疫试剂均购自福州新迈公司。
3.临床分级：根据其临床症状分6级。0级：正常；1级：精神萎靡，活动减少；2级：轻度消瘦，后肢轻瘫；3级：消瘦，后肢严重瘫痪，前肢受累；4级：明显消瘦，四肢衰弱，活动困难；5级：极度衰弱，濒死或死亡。
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4.组织切片制备：被免疫的动物于不同的时间点处死：尚无症状时(7天)，疾病的早期症状出现前1～2天或出现时(14天)，疾病的高峰期(21)，疾病的早期恢复(28天)，疾病完全恢复时(35天)。对照组动物在相同的时间处死。大鼠的坐骨神经根被取出后部分用甲醛或戊二醛固定，作HE染色及半薄切片；部分置于液氮中保存。冰冻切片(10μm)置于玻片(原位杂交用，Fisher Scient ific,Pittsburgh,PA,USA)拟行原位杂交，藏于-20℃。
5.原位杂交[11]：寡核苷酸探针序列见表1，为增加敏感性而使用二或三个探针混合后，用地高辛标记。玻片37℃干燥后于42℃预杂交2h，再加入4μl/ml(V/V)地高辛标记的cDNA探针，42℃杂交过夜。次日用2×SSC60℃中洗涤30min，以含20ug/ml RNase A的缓冲液(10mM Tris-Cl,1mM EDTA,0.5M NaCl,pH7.5)37℃孵育30min。然后以不含RNaseA的缓冲液37℃洗浸10分钟，空气中干燥后，加入1.5U/ml AP标记的抗地高辛抗体40℃中反应过夜，经缓冲液洗涤，NBT/BCIP显色液避光显色30～60min，中止反应。光镜下观察阳性反应细胞呈兰色。
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6.统计学处理：本数据以X±S表示，采用成组设计的t检验。
表1 原位杂交用寡核苷酸探针(Rat) 探针
GenBank
accession no.
序列
MCP-1
M57441
Probel:rMCPL-44L30
5'ACA GGC CCA GAA GCG TGA CAG AGA CCT GCA3'
Probe2:rMCP1-159L30
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5'CCA GCC GAC TCA TTG GGA TCA TCT TGC CA3'
MIP-1β
U06434
Probel:rMIPL β-21L28
5'GCA GAA GGC GGC CAC AAG CAG GAG GAG A3'
Probe2:rMIPl β-164L30
5'ATA CCA CAG CTG GCT GGG AGC AAA GGC TGC3'
Probe3:rMIPl β-213L30
5'CAG GGC TCG CTG GGG TCG GCA CAG ATT TGC3'
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表2 MIP-1β，MCP-1mRNA在组织浸润细胞中的表达(x±s) 组别
7
14
21
28
35
MIP-1β
EAN
12.1±2.5
119.3±4.7
735.2±11.5
211.8±5.8
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7.5±3.5
Control
11.3±1.5
12.3±1.8
21.7±2.3
23.1±2.5
22.6±2.4
MCP-1
EAN
18.7±9.3
1159.5±43.2
356.5±17.3
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143±13.1
15.9±8.6
Control
20.5±7.9
8.8±11.2
9.5±13.6
12.6±7.9
19.3±10.6
注：各组间相比(7vs14,14vs21，21vs28，28vs35)，P<0.01。表中数字为100mm2组织内浸润细胞的阳性细胞数。结 果
一、 临床表现
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实验组动物在接受免疫后均出现EAN的典型表现，包括进行性体重减轻，肢体瘫痪等。于12～16天先后发病，21天左右达到高峰，随后逐渐恢复。对照组动物无发病。通过HE染色及半薄切片观察神经的病理改变显示，发病动物的神经组织切片中有不同程度的炎性细胞浸润，主要为单核细胞、 巨噬细胞及淋巴细胞；髓鞘的改变主要为薄髓鞘及脱髓鞘，炎性细胞浸润及髓鞘脱失程度与临床评级基本一致。
二、 MCP-1及MIP-1β mRNA表达
从表2中可见，EAN组织动物21天时，神经根组织内MIP-1β mRNA-表达细胞平均最多，每100mm2组织内为735.2±11.5，随后开始下降；7天vs14天，14天vs21天，21天vs28天，28天vs35天，P<0.01，差异有显著性。14天、 21天及28天时与对照组相比较差异有显著性，P<0.001。
在临床症状刚开始出现时(14天)神经根组织内MCP-1mRNA阳性细胞即达高峰，为1159.5±43.2，随后开始下降；7天vs14天,14天vs21天，21天vs28天，28天vs35天，P<0.01，差异有显著性。14天、 21天及28天时与对照组相比较差异有显著性，P<0.001。
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讨 论
趋化因子为一类小分子的促炎性白细胞介素家族，根据其结构可分为两个亚类。一类称为C-X-C，它的两个具有保守性的半胱氨酸被一个氨基酸分开；另一类为C-C，它的两个半胱氨酸是相连的。在人类，C-X-C蛋白质位于第4条染色体上，C-C则位于17上。它们的功能有很大的差别：C-X-C主要针对中性粒细胞，而C-C则主要对单核细胞及T细胞产生作用[8]。多种细胞包括单核/吞噬细胞、 淋巴细胞、 中性粒细胞及星形胶质细胞等产生各类作用特异的趋化因子。趋化因子在大部分静止细胞内无表达，当淋巴细胞受到刺激而活化时水平迅速上升，且其mRNA占细胞总mRNA的1%。在慢性炎症过程中，起主要作用的是C-C类趋化因子。属C-C类的MCP-1可趋化单核及T细胞[13]；RANTES(调节活化正常T细胞表达及分泌)可趋化单核细胞及记忆T细胞[14]；巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1 α)吸引单核细胞及CD8+T细胞；而MIP-1 β则作用于CD4+T细胞[15]。另有资料证明MIP-1 β可促进内皮细胞粘附T细胞[12]。趋化因子除直接作用于淋巴细胞外，还可上调粘附分子的表达而促进其渗出。
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EAN的组织病理学研究表明，病变神经处浸润的细胞主要为CD4+细胞及巨噬细胞，少量的CD8+细胞及B细胞偶而可见[16]。本实验中，应用原位杂交法检测了趋化因子MCP-1及MIP-1β mRNA在EAN动物神经根的表达。炎症反应时，MCP-1在淋巴细胞从血循环聚集到组织的过程中起到重要作用。MCP-1主要能吸引T淋巴细胞单核吞噬细胞。本资料显示，MCP-1在神经根的表达高峰出现在EAN动物临床症状的早期，提示其可能在疾病中起到吸引炎性细胞进入PNS并参与始发炎性反应的作用。MIP-1 β则作用于CD4+T细胞。本研究中，MIP-1β的表达与EAN临床症状的演变基本一致并观察到动物未发病时的表达与对照组相比无明显差异，在症状刚开始出现时即有少量趋化因子mRNA的表达，症状达到高峰时表达最多且与PNS的病理改变密切相关。该结果表明MIP-1β可能吸引了主要的炎性细胞，在浸润细胞迁移进入PNS的过程中起到重要作用。Ransohoff等[17]在实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)中观察到类似的结果。在EAE的中枢神经系统(CNS)中，趋化因子mRNA在症状出现前处于基线水平，症状出现后则直线上升，并随症状缓解逐渐降低。且活化的抗原特异性T细胞在趋化因子的表达之前进入CNS，表明趋化因子可通过促进非特异性炎性细胞进入CNS的脑实质而使病灶扩大。
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大量资料表明，EAN的自动恢复与Thl细胞因子减少及抗炎性的细胞因子增加有关。本研究中，EAN疾病缓解时趋化因子水平逐渐下降至与对照组无差异。最近的研究表明，疾病的缓解期中，Th2类细胞因子IL-10，IL-4，TGF-β水平均有升高[16]。且IL-10应用于治疗EAN可明显减轻其症状，可抑制巨噬细胞及T细胞产生Th1细胞因子[18]，因而可能使趋化因子水平下降。
我们的结果显示，趋化因子可能在EAN的PNS炎性反应中扮演重要作用。该发现与目前关于EAN发病机制的假设相一致：即抗原特异性的CD4+T细胞首先浸润进入PNS，随后识别抗原，导致促炎性细胞因子出现，使趋化因子产生，从而吸聚更多的非抗原特异性的T细胞，巨噬细胞进入炎症区域。已有研究表明，在EAE中，应用抗趋化因子的抗体可使其症状明显减轻[19，20]，故进一步研究针对趋化因子的治疗将可能有益于EAN的恢复，从而有助于最终获得治疗人类疾病GBS的新认识。
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参考文献
1，Waksman ZH and Adams RD.Allergic neuritis:an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvant.J.Exp.Med.1995,102,213～225.
2，Kadlubowski M and Hughes RAC.Identification of the neuritogen for experimental allergic neuritis.Nature.1979,277,140～141.
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10，李柯娃，谢光洁，王洪林，等.豚鼠实验性变态反应性神经炎的病理观察及淋巴细胞转化功能测定.脑电图与神经精神疾病杂志，1989，5∶88～91.
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13，Yoshimura T,Robinson EA,Tanaka S,et al.Purification and amino acid analysis of two human glimoa-derived monocyte chemoattractants.J Exp.Med.1989,169,1449～1459.
14，Schall TJ,Bacon K,Toy KJ,et al.Selective attraction of monocytes and Tlymphocytes of the memory phenotype by cytokine RANTES.Nature.1990,347,669～671.
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17，Glabinski A,Tani M,Ransohoff RM,et al.Central nervous system chemokine mRNA accumulation follows leukocyte entry at the onset of murine acute experimental autoimmune encephalomyelitis.Brain Behav Immunol.1995,9,315～330.
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18，Bai XF,Zhu J,Zhang GX,et al.IL-10 suppresses experimental autoimmune neuritis And down-regulates TH1-type immune responses.Clin Immunol Immunopathol.1997,83,117～126.
19，Karpus WJ,Lukacs NW,McRae BL,et al.An important role for the chemokine macrophage inflammatory protein-1 α in the pathogenesis of the T-cell-mediated autoimmune disease,experimental autoimmune encephalomyelitis.J Immunol.1995,155,5003～5010.
20，Karpus WJ,Ransohoff RM.Chemokine regulation of experimental autoimmune encephalomyelitis.J Immunol.1998,161,2667～2671.
收稿日期：2000-6-15, 百拇医药
单位：周文斌(湖南医科大学附属湘雅医院神经内科 410008))；杨欢(湖南医科大学附属湘雅医院神经内科 410008))；肖波(湖南医科大学附属湘雅医院神经内科 410008))；谢光洁(湖南医科大学附属湘雅医院神经内科 410008))；黄琼(湖南常德市第一人民医院神经内科)；朱世津(湖南常德市第一人民医院神经内科)
关键词：趋化因子；实验性变态反应性神经炎；炎性反应
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摘 要 目的：实验性变态反应性神经炎(EAN)是一类T细胞介导的周围神经系统的自身免疫病，可用牛坐骨神经加完全氟氏佐剂诱导而成。本文研究趋化因子mRNA在实验性变态反应性神经炎(EAN)中的表达并探索其可能的作用。方法：用兔坐骨神经匀浆免疫Wistar大鼠，诱导格林巴利综合症(GBS)的动物模型EAN；采用地高辛标记的寡核苷酸探针检测EAN病变神经组织浸润细胞上趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β) mRNA表达情况。结果：MCP-1 mRNA在临床症状出现前1-2天(14天)水平最高，随后逐渐下降；MIP-1 βmRA在临床症状出现前1-2天水平开始升高，在临床症状达到高峰时(21天)最高，进入恢复期后降至基础水平。结论：趋化因子在EAN的炎性细胞迁移及浸润进入神经细胞过程中起到重要作用。
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C-C Chemokine mRNA expression in murin experimental allergic neuritis
Zhou Wenbin,Huang Qiong,Yang Huan,et al.
(Department of Neurology,Xiangya Hospital,Hunan Medical University,Changsha,410078,China)
Abstract Objective：Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a T-cell-mediated autoimmune disease of the peripheral nervous system (PNS) that can be actively induced in Lewis rats by imunization with bovine PNS myelin and Freund's complete adjuvant.In the present study,the dynamics of the expression of C-C chemokines mRNA of macrophage inflammatory protein-1 β(MIP-1 β) and monocyte chemotactic protein-1(MCP-1) were determined in the sciatic nerves of EAN.Methods:The mRNA of MIP-1 β and MCP-1 were identified in infiltrating cells in sciatic nerve sections over the course of EAN by in situ hybridization (ISH) using digoxingenin labeled riboprobes.Results:The maximum of mRNA encoding MIP-1β positive cells in the scitic nerves was seen on day 21 post immunization(p.i.) correlating with the development of severe clinical signs.Peak numbers of MCP-1 mRNA positive cellswere induced in the infiltrating cells in sciatic nerves 1-2days before clinical signs were apparent of EAN,favoring a role for these chemokines in disease development.Conclusion:These results define a subset of chemokines that may play an important role in the inflammatory process during muring EAN and have relevance for future studies on pathogenesis and treatment of GBS in humans.
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Key words Chemokine;Experimental autoimmune neuritis;Inflammation.
实验性变态反应性神经炎(EAN)是一类CD4+细胞介导的周围神经系统(PNS)的炎性脱髓鞘疾病。它可由敏感的动物PNS组织、 纯化的PNS髓鞘成分P2蛋白或P0蛋白加完全弗氏佐剂诱导而成[1～3]。EAN是研究格林-巴利综合怔(GBS)免疫病理机制的动物模型。其主要病理改变为血-神经屏障破坏，免疫球蛋白漏出，PNS周围包括T淋巴细胞，巨噬细胞等炎性细胞的浸润及小静脉旁神经及神经根的脱髓鞘[4，5]。在CD4+细胞介导的EAN中，CD4+细胞分泌的促炎性细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)及γ-干扰素(IFN-)可上调MHCⅡ类抗原，促进炎性细胞渗出进入PNS。但TNF、 IEN-并不直接对炎性细胞的迁移及渗出产生作用，此过程尚需要粘附分子及趋化因子的参与[6-8]。趋化因子是一群低分子量、 可被促炎性细胞因子(Thl)诱导的糖蛋白，由多种细胞产生，对淋巴细胞有强大的趋化作用，可活化及上调粘附分子的表达[8，9]，因而在炎性细胞从血循环聚集到PNS的过程中可能起重要作用。本实验中，我们应用原位杂交方法观察了趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)mRNA在EAN中的表达，试图探讨其在EAN中的可能作用。
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材 料 及 方 法
1.EAN模型的制备[10]：60只健康Wistar雌性大鼠(6～8)周龄，重180～200g，随机分为实验组及对照组各30只，每组各分5小组，6只为1小组。
抗原制备：健康家兔处死后立即在无菌条件下取坐骨神经，去除脂肪，肌肉及其他结缔组织，剪碎，用超声匀浆机制成匀浆，调整神经匀浆浓度为150g/L，置于-30℃冰箱备用。
EAN模型诱导：实验组每只足垫下注射等量的神经匀浆及完全弗氏佐剂(CFA)共0.5ml，对照组每只足垫下注射等量PBS及CFA共0.5ml。
2.主要试剂来源：趋化因子探针由美国R&D公司提供，其他免疫试剂均购自福州新迈公司。
3.临床分级：根据其临床症状分6级。0级：正常；1级：精神萎靡，活动减少；2级：轻度消瘦，后肢轻瘫；3级：消瘦，后肢严重瘫痪，前肢受累；4级：明显消瘦，四肢衰弱，活动困难；5级：极度衰弱，濒死或死亡。
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4.组织切片制备：被免疫的动物于不同的时间点处死：尚无症状时(7天)，疾病的早期症状出现前1～2天或出现时(14天)，疾病的高峰期(21)，疾病的早期恢复(28天)，疾病完全恢复时(35天)。对照组动物在相同的时间处死。大鼠的坐骨神经根被取出后部分用甲醛或戊二醛固定，作HE染色及半薄切片；部分置于液氮中保存。冰冻切片(10μm)置于玻片(原位杂交用，Fisher Scient ific,Pittsburgh,PA,USA)拟行原位杂交，藏于-20℃。
5.原位杂交[11]：寡核苷酸探针序列见表1，为增加敏感性而使用二或三个探针混合后，用地高辛标记。玻片37℃干燥后于42℃预杂交2h，再加入4μl/ml(V/V)地高辛标记的cDNA探针，42℃杂交过夜。次日用2×SSC60℃中洗涤30min，以含20ug/ml RNase A的缓冲液(10mM Tris-Cl,1mM EDTA,0.5M NaCl,pH7.5)37℃孵育30min。然后以不含RNaseA的缓冲液37℃洗浸10分钟，空气中干燥后，加入1.5U/ml AP标记的抗地高辛抗体40℃中反应过夜，经缓冲液洗涤，NBT/BCIP显色液避光显色30～60min，中止反应。光镜下观察阳性反应细胞呈兰色。
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6.统计学处理：本数据以X±S表示，采用成组设计的t检验。
表1 原位杂交用寡核苷酸探针(Rat) 探针
GenBank
accession no.
序列
MCP-1
M57441
Probel:rMCPL-44L30
5'ACA GGC CCA GAA GCG TGA CAG AGA CCT GCA3'
Probe2:rMCP1-159L30
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5'CCA GCC GAC TCA TTG GGA TCA TCT TGC CA3'
MIP-1β
U06434
Probel:rMIPL β-21L28
5'GCA GAA GGC GGC CAC AAG CAG GAG GAG A3'
Probe2:rMIPl β-164L30
5'ATA CCA CAG CTG GCT GGG AGC AAA GGC TGC3'
Probe3:rMIPl β-213L30
5'CAG GGC TCG CTG GGG TCG GCA CAG ATT TGC3'
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表2 MIP-1β，MCP-1mRNA在组织浸润细胞中的表达(x±s) 组别
7
14
21
28
35
MIP-1β
EAN
12.1±2.5
119.3±4.7
735.2±11.5
211.8±5.8
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7.5±3.5
Control
11.3±1.5
12.3±1.8
21.7±2.3
23.1±2.5
22.6±2.4
MCP-1
EAN
18.7±9.3
1159.5±43.2
356.5±17.3
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143±13.1
15.9±8.6
Control
20.5±7.9
8.8±11.2
9.5±13.6
12.6±7.9
19.3±10.6
注：各组间相比(7vs14,14vs21，21vs28，28vs35)，P<0.01。表中数字为100mm2组织内浸润细胞的阳性细胞数。结 果
一、 临床表现
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实验组动物在接受免疫后均出现EAN的典型表现，包括进行性体重减轻，肢体瘫痪等。于12～16天先后发病，21天左右达到高峰，随后逐渐恢复。对照组动物无发病。通过HE染色及半薄切片观察神经的病理改变显示，发病动物的神经组织切片中有不同程度的炎性细胞浸润，主要为单核细胞、 巨噬细胞及淋巴细胞；髓鞘的改变主要为薄髓鞘及脱髓鞘，炎性细胞浸润及髓鞘脱失程度与临床评级基本一致。
二、 MCP-1及MIP-1β mRNA表达
从表2中可见，EAN组织动物21天时，神经根组织内MIP-1β mRNA-表达细胞平均最多，每100mm2组织内为735.2±11.5，随后开始下降；7天vs14天，14天vs21天，21天vs28天，28天vs35天，P<0.01，差异有显著性。14天、 21天及28天时与对照组相比较差异有显著性，P<0.001。
在临床症状刚开始出现时(14天)神经根组织内MCP-1mRNA阳性细胞即达高峰，为1159.5±43.2，随后开始下降；7天vs14天,14天vs21天，21天vs28天，28天vs35天，P<0.01，差异有显著性。14天、 21天及28天时与对照组相比较差异有显著性，P<0.001。
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讨 论
趋化因子为一类小分子的促炎性白细胞介素家族，根据其结构可分为两个亚类。一类称为C-X-C，它的两个具有保守性的半胱氨酸被一个氨基酸分开；另一类为C-C，它的两个半胱氨酸是相连的。在人类，C-X-C蛋白质位于第4条染色体上，C-C则位于17上。它们的功能有很大的差别：C-X-C主要针对中性粒细胞，而C-C则主要对单核细胞及T细胞产生作用[8]。多种细胞包括单核/吞噬细胞、 淋巴细胞、 中性粒细胞及星形胶质细胞等产生各类作用特异的趋化因子。趋化因子在大部分静止细胞内无表达，当淋巴细胞受到刺激而活化时水平迅速上升，且其mRNA占细胞总mRNA的1%。在慢性炎症过程中，起主要作用的是C-C类趋化因子。属C-C类的MCP-1可趋化单核及T细胞[13]；RANTES(调节活化正常T细胞表达及分泌)可趋化单核细胞及记忆T细胞[14]；巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1 α)吸引单核细胞及CD8+T细胞；而MIP-1 β则作用于CD4+T细胞[15]。另有资料证明MIP-1 β可促进内皮细胞粘附T细胞[12]。趋化因子除直接作用于淋巴细胞外，还可上调粘附分子的表达而促进其渗出。
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EAN的组织病理学研究表明，病变神经处浸润的细胞主要为CD4+细胞及巨噬细胞，少量的CD8+细胞及B细胞偶而可见[16]。本实验中，应用原位杂交法检测了趋化因子MCP-1及MIP-1β mRNA在EAN动物神经根的表达。炎症反应时，MCP-1在淋巴细胞从血循环聚集到组织的过程中起到重要作用。MCP-1主要能吸引T淋巴细胞单核吞噬细胞。本资料显示，MCP-1在神经根的表达高峰出现在EAN动物临床症状的早期，提示其可能在疾病中起到吸引炎性细胞进入PNS并参与始发炎性反应的作用。MIP-1 β则作用于CD4+T细胞。本研究中，MIP-1β的表达与EAN临床症状的演变基本一致并观察到动物未发病时的表达与对照组相比无明显差异，在症状刚开始出现时即有少量趋化因子mRNA的表达，症状达到高峰时表达最多且与PNS的病理改变密切相关。该结果表明MIP-1β可能吸引了主要的炎性细胞，在浸润细胞迁移进入PNS的过程中起到重要作用。Ransohoff等[17]在实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)中观察到类似的结果。在EAE的中枢神经系统(CNS)中，趋化因子mRNA在症状出现前处于基线水平，症状出现后则直线上升，并随症状缓解逐渐降低。且活化的抗原特异性T细胞在趋化因子的表达之前进入CNS，表明趋化因子可通过促进非特异性炎性细胞进入CNS的脑实质而使病灶扩大。
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大量资料表明，EAN的自动恢复与Thl细胞因子减少及抗炎性的细胞因子增加有关。本研究中，EAN疾病缓解时趋化因子水平逐渐下降至与对照组无差异。最近的研究表明，疾病的缓解期中，Th2类细胞因子IL-10，IL-4，TGF-β水平均有升高[16]。且IL-10应用于治疗EAN可明显减轻其症状，可抑制巨噬细胞及T细胞产生Th1细胞因子[18]，因而可能使趋化因子水平下降。
我们的结果显示，趋化因子可能在EAN的PNS炎性反应中扮演重要作用。该发现与目前关于EAN发病机制的假设相一致：即抗原特异性的CD4+T细胞首先浸润进入PNS，随后识别抗原，导致促炎性细胞因子出现，使趋化因子产生，从而吸聚更多的非抗原特异性的T细胞，巨噬细胞进入炎症区域。已有研究表明，在EAE中，应用抗趋化因子的抗体可使其症状明显减轻[19，20]，故进一步研究针对趋化因子的治疗将可能有益于EAN的恢复，从而有助于最终获得治疗人类疾病GBS的新认识。
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收稿日期：2000-6-15, 百拇医药